MUELLER-HINTON 56137 - 63824 - 63901 - 64884 - 64888

MUELLER-HINTON + SANGRE DE OVEJA 63825 – 63902

MUELLER-HINTON + SANGRE DE CABALLO + β-NAD 63524
MEDIO DE AISLAMIENTO PARA PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA

1- USO PREVISTO
El agar Mueller-Hinton es un medio sólido estandarizado para pruebas de sensibilidad a antimicrobianos mediante los métodos
de difusión en agar o de dilución en agar.

2- PRINCIPIO
La composición del medio Mueller-Hinton debe ser estandarizada para obtener resultados fiables de sensibilidad a los
antimicrobianos, con concentraciones definidas de CaCl2, MgCl2 y ZnCl2, porque se sabe que las variaciones en las
concentraciones de los cationes Mg2+ y Ca2+ afectan a los resultados obtenidos (diámetros y concentraciones mínimas
inhibidoras o CMI) para Pseudomonas aeruginosa con aminoglucósidos y para Staphylococci con tetraciclina.
La baja concentración de timidina también reduce los fenómenos de recrecimiento alrededor de los discos de trimetoprim-
sulfamida y trimetoprim.

3- CÓMO SE SUMINISTRA
• Medio listo para usar:
- caja de 20 placas de Petri redondas (90 mm) (MH) código 63824
- caja de 10 placas de Petri cuadradas (120 mm) (MH) código 63901
• Medio listo para usar (para dispensar):
- 6 frascos de 200 ml (MH) código 56137
• Medio deshidratado:
- frasco de 500 g código 64884
- tambor de 5 kg código 64888
• Medio listo para usar con sangre de oveja:
- caja de 20 placas de Petri redondas (90 mm) (MHB) código 63825
- caja de 10 placas de Petri cuadradas (120 mm) (MHB) código 63902

• Medio listo para usar con sangre de caballo y β-NAD:

- caja de 20 placas de Petri redondas (90 mm) (MHF) código 63524

4- COMPOSICIÓN TEÓRICA (g/l de agua destilada)*

(1,2)
El Mueller-Hinton, con o sin la adición de sangre de oveja, se elabora de acuerdo con la fórmula descrita por la OMS

Peptona 3.0
Hidrolisato de caseína 17.5
Agar 15
Ca2+ 20 - 25 mg/L
Mg2+ 10 -12.5 mg/L
pH final 7,4 ± 0.2
Suplementos: sangre de oveja al 5% (para el medio MHB) o sangre de
caballo al 5% (para el medio MHF)
β-NAD (para el medio MHF) 20 mg/L
β-NAD: β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide
* fórmula adaptada para asegurar los mejores rendimientos del medio.

Preparación del medio:

Homogeneice el polvo contenido en el frasco.
Añada 35 gramos de medio deshidratado a un litro de agua recién destilada. Caliente hasta que hierva y se produzca la
disolución completa.
Esterilice en el autoclave a 121°C ± 1°C durante 15 minutos. Dispense en tubos o frascos estériles.
En el momento de su uso, derrita el medio en el baño maría hirviendo y dispense todo el contenido del frasco o los tubos en placas
de Petri redondas. La capa de agar debe ser de 4 mm de espesor. Seque las placas de Petri durante 30 minutos a 37°C. El
volumen de medio de Mueller-Hinton que produce una capa de agar de exactamente 4 mm de espesor es de 25 ml para una placa
de Petri de 90 mm, 60 ml para una placa de Petri cuadrada de 120 mm, 70 ml para una placa de Petri redonda de 150 mm.

1
En el momento de su uso (antes de dispensar), puede suplementarse el medio con:
• sangre de oveja o caballo al 5% para el medio Mueller-Hinton + sangre,
• Cloruro sódico (NaCl) al 5% para el medio Mueller-Hinton + 5% NaCl.

5- CONSERVACIÓN
• Medio listo para usar: a +2-20°C
• Medio listo para usar (para dispensar): a +2-25°C
• Medio listo para usar, con sangre: a +2-8°C
• Medio deshidratado: frasco cerrado herméticamente en un lugar seco a +15-25°C.
La fecha de caducidad y el número de lote están indicados en el envasado.

6- INSTRUCCIONES
Material:
Material suministrado: Medio de Mueller-Hinton con o sin la adición de sangre de oveja.
Material específico no suministrado:
• Estándar de opacidad equivalente al estándar 0,5 de MacFarland
• Equipamiento de laboratorio necesario para pruebas de sensibilidad a los antibióticos por el método de difusión en agar.

Precauciones de empleo: Cumpla las instrucciones de las directrices actuales (CLSI 7,8, CA-SFM 9, EUCAST 10,11,12
). Observe
siempre técnicas y precauciones actuales sobre la protección contra peligros microbiológicos.

Inoculación:
A partir de un cultivo puro, fresco, realizado en medio de agar, prepare una suspensión con una opacidad equivalente al
estándar 0,5 de Mac Farland. El protocolo de estandarización del inóculo se describe en las diversas directrices publicadas por
el CLSI y el CA-SFM y el EUCAST para el método de difusión en agar y el método de dilución en agar.
Si el medio se conserva a 4°C, deje que se ajuste a la temperatura ambiente (18-30°C).
Si se observa un exceso de humedad sobre la superficie, seque las placas en un horno durante 10 a 30 minutos en el
incubador antes de su uso.

MÉTODO DE DIFUSIÓN
• Inoculación por inundación (método recomendado por el CA-SFM):
Partiendo del inóculo estandarizado, siga el procedimiento indicado por el CA-SFM respecto a la dilución de la suspensión
inicial de la especie bacteriana estudiada.
Inunde toda la placa con la suspensión obtenida y luego elimine el exceso de suspensión.

• Inoculación en líneas (Método de Kirby-Bauer recomendado por el CLSI y CA-SFM, y EUCAST):

A partir de un inóculo estandarizado, siga las directrices del CLSI, CA-SFM, EUCAST para inocular la placa:
• Sumerja un palo con torunda estéril, no tóxico, en la suspensión.
• Elimine el exceso de suspensión rotando suavemente la torunda contra las paredes del tubo.
• Inocule la placa con la torunda para obtener un cultivo de las colonias confluyentes.
Aplique discos usando un dispensador o pinzas, presionando suavemente.

MÉTODO DE DILUCIÓN EN AGAR

El procedimiento de inoculación y de prueba se describe en las directrices del CLSI y el CA-SFM.

Incubación:
Siga las directrices actuales del CLSI y el CA-SFM.
Las condiciones de incubación varían según la especie bacteriana estudiada.

7- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

La interpretación de la prueba de sensibilidad a antimicrobianos usando el método de difusión con disco o el método de
dilución en agar se describe en actualizaciones periódicas de las directrices del CA-SFM y el CLSI y el EUCAST.

8- RENDIMIENTO / CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA

• Aspecto del medio Mueller-Hinton listo para usar: agar de color ámbar, transparente a opalescente.
• Aspecto del medio Mueller-Hinton deshidratado: polvo beige.
• Aspecto del medio Mueller-Hinton + sangre listo para usar: agar rojo.

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Los rendimientos de crecimiento del medio Mueller-Hinton con o sin sangre de oveja se verifican con las siguientes cepas:

CEPAS RESULTADO DEL CULTIVO DESPUÉS DE 24 horas a 37 °C

Escherichia coli ATCC 25922 Crecimiento satisfactorio
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Crecimiento satisfactorio
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento satisfactorio
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Crecimiento satisfactorio
Haemophilus influenzae NCTC 8468/CIP 54.94 Crecimiento satisfactorio

• La composición del MH medio se verifica con las siguientes cepas y discos (lista no exhaustiva):

CEPAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS

Escherichia coli ATCC 25922
- Amikacina 30 µg
- Ampicilina 10 µg
- Tetraciclina 30 µg
Staphylococcus aureus ATCC 25923
cumple las especificaciones actuales
- Amikacina 30 µg
de diámetros de inhibición
- Cefalotina 30 µg
(CLSI y/o CA-SFM) (8, 9)
- Tetraciclina 30 µg
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
- Amikacina 30 µg
- Cefotaxima 30 µg
- Ciprofloxacino 5 µg

• La composición del medio MHB se verifica con las siguientes cepas y discos (lista no exhaustiva):

CEPAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
- Erytromicina 15 µg
- Penicilina 10 UI
cumple las especificaciones actuales
- Tetraciclina 30 µg
de diámetros de inhibición
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
(CLSI) (8)
- Amikacina 30 µg
- Cefotaxima 30 µg
- Ciprofloxacino 5 µg

• La composición del medio MHF se verifica con las siguientes cepas y discos (lista no exhaustiva):

CEPAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
- Erytromicina 15 µg
- Penicilina 10 UI
cumple las especificaciones actuales
- Tetraciclina 30 µg
de diámetros de inhibición
Haemophilus influenzae NCTC 8468/ CIP 54.94
(EUCAST) (12)
- Ampicilina 2 µg
- Cefaclor 30 µg
- Tetraciclina 30 µg

9- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE

Todos los reactivos fabricados se elaboran según nuestro sistema de calidad, que va desde la recepción de las materias
primas hasta la comercialización final del producto. Cada lote se somete a valoraciones de control de calidad y sale al mercado
sólo cuando está de acuerdo con los criterios de aceptación predefinidos. Los registros relativos a la producción y al control de
cada lote se conservan en Bio-Rad.

10- LÍMITES DE USO

Deben usarse siempre cultivos puros, frescos, para obtener resultados interpretables.
Debido a los requisitos nutricionales, algunas cepas pueden no crecer en este medio. En este caso, debe usarse un medio
adecuado: HTM para Haemophilus, Mueller-Hinton más sangre de oveja al 5% Streptococcus pneumoniae y Streptococci
β−hemolíticos, agar GC para Neisseria gonorrhoeae.
Varios factores pueden afectar a los resultados (tamaño del inóculo, tiempo de incubación y atmósfera, etc.) Por tanto, es
esencial cumplir el protocolo descrito en las directrices actuales (CLSI, CA-SFM, EUCAST).
No se recomienda el medio Mueller-Hinton sangre fresca para estudiar la sensibilidad de S. pneumoniae al cotrimoxazol (7).

3
11- BIBLIOGRAFÍA
1- World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization. 1981. Technical report series 673 (Révision
1981). W.H.O., Geneva – p156-192.
2- World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization. 1992. Technical report series 822. W.H.O.,
Geneva.
3- Casillas, E.,Kenny, M.A., Minshew B.H., Schoenknecht, F. 1981. Effect of ionized calcium and soluble magnesium on the
predictability of the performance of Mueller-Hinton agar susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa with
Gentamicin. Antimicrob. Agents Chemother. 19:987-992.
4- Murray, P.R., Zeitinger, J. R. 1983. Evaluation of Mueller-Hinton agar for disk diffusion susceptibility tests. J. Clin.
Microbiol. 18: 1269-1271
5. D’Amato, R.F., Thornsberry C., Baker C.N., Kirven, L.A. 1976. Effect of calcium and magnesium ions on the susceptibility
of Pseudomonas species to Tetracycline, Gentamicin, Polymyxin B, and Carbenicillin. Antimicrob. Agents Chemother. 7:
596-600.
6. D’Amato, R.F., Thornsberry C. 1979. Calcium and Magnesium in Mueller-Hinton agar and their influence on disk diffusion
susceptibility results. Current Microbiol.2:135-138
7. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. Approved standard M2-A10. Performance standards for antimicrobial
susceptibility tests, 10th ed. CLSI, Wayne, Pa.
8. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. CLSI document M100-S19. Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing, 20th informational supplement, Wayne, Pa.
9. Comité de l’antibiogramme. 2010. French Society of Microbiology.
10. European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2009. Media preparation for disc diffusion testing
V1.0.
11. European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2009. EUCAST disk diffusion antimicrobial
susceptibility testing method summary - V1.0.
12. European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2010. EUCAST QC Tables V1.1.

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