EVALUACIÓN Y ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE UNA MUESTRA DE ADN

J.D.Huanca1

1
Escuela profesional de Ingeniería Biotecnológica, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y
Biotecnológicas, Universidad Católica de Santa María, Arequipa, Perú

RESUMEN
En la presente práctica se realizó la separación de fragmentos de ADN con respecto a su
peso molecular y así identificar si se hizo una buena extracción. Para ellos utilizamos el
método más empleado en laboratorios de análisis genómicos, electroforesis. Este
procedimiento consta de una cámara electroforética y un gel específico para lo que se
desea separar, ya sea de agarosa(50pb-40Kb) o poliacrilamida(5pb-600pb); se optó por el
gel de agarosa ya que es más sencillo de preparar y finalmente como resultado no se
obtuvo correctamente una corrida ni se identificó el ADN extraído.

Palabras clave: fragmentos, electroforesis, gel de agarosa, cámara electroforética.

ABSTRACT
In the present practice, the separation of DNA fragments with respect to their molecular
weight was performed and thus to identify if a good extraction was made. For them we
use the most used method in genomic analysis laboratories, electrophoresis. This
procedure consists of an electrophoretic chamber and a specific gel for which it is desired
to separate, either agarose (50pb-40Kb) or polyacrylamide (5pb-600pb); the agarose gel
was chosen since it is easier to prepare and finally as a result a run was not obtained
correctly nor was the extracted DNA identified.

Keywords: fragments, electrophoresis, agarose gel, electrophoretic chamber

INTRODUCCIÓN decir "migración". El prefijo electro nos

Seguramente hemos trabajado a lo largo
de los años de la carrera con un método
muy aplicado en Biotecnología, para la
separación de fragmentos de ADN por su
peso molecular respectivo, que es la
electroforesis. El término electroforesis
proviene del sufijo foresis que quiere
dice que estamos utilizando electricidad
para hacer que las moléculas migren.
La electroforesis es una técnica utilizada
para separar fragmentos de ADN o ARN,
por su tamaño y carga. La electroforesis
consta en aplicar una corriente a través
de un gel que contiene las moléculas de
interés.En base a su tamaño y carga,
las moléculas se desplazarán por el gel en
diferentes direcciones y a diferentes
velocidades, con lo que se separan unas
de otras.
Todas las moléculas de ADN tienen la
misma cantidad de carga por masa.
Debido a esto, la electroforesis en gel
separa los fragmentos de ADN
únicamente por su tamaño. La
electroforesis nos permite ver cuántos
fragmentos diferentes de ADN están
presentes en una muestra y cuán grandes
son unos con respecto a otros. Los geles
para separar ADN suelen estar hechos de
un polisacárido llamado agarosa, que se
consigue como hojuelas secas
pulverizadas. Cuando la agarosa se
calienta en una solución amortiguadora
(agua mezclada con algunas sales) y deja
enfriar, se forma un gel sólido
ligeramente blando. A nivel molecular, el
gel es una matriz de moléculas de
agarosa que se mantienen unidas por
puentes de hidrógeno y que forman
pequeños poros. En un extremo, el gel
tiene muescas en forma de ranuras
llamadas pozos, donde se colocarán las
muestras de ADN.FIGURA1. Uno de los
extremos de la cámara se conecta a un
electrodo positivo y el otro extremo se
conecta a un electrodo negativo. El
cuerpo principal de la cámara, donde se
coloca el gel, se llena con solución
amortiguadora (buffer TAE 0.5X) con
sales que puede conducir la corriente;
esta se enrasa hasta un nivel que cubra
todo el gel.
FIG.1 Ubicación del gel de agarosa en la
cámara electroforético.
El extremo del gel que tiene los pozos se
coloca hacia el electrodo negativo. El
extremo sin pozos (hacia donde migrarán
los fragmentos de ADN) se coloca hacia el
electrodo positivo. Una vez que el gel
está en la cámara, cada una de las
muestras de ADN que queremos analizar
se transfiere cuidadosamente a uno de
los pozos. Un pozo se reserva para
el marcador de peso molecular, que es
un estándar de referencia que contiene
fragmentos de ADN de longitudes
conocidas. A continuación, se aplica
energía eléctrica a la cámara y empieza a
fluir corriente a través del gel. Los grupos
fosfato de su esqueleto de azúcares-
fosfato le otorgan una carga negativa a
las moléculas de ADN, por lo que
comienzan a moverse a través de la
matriz de gel hacia el polo positivo.
Cuando el sistema está encendido y pasa
corriente por el gel, se dice que el gel
está corriendo. FIGURA 2
Conforme corre el gel, los fragmentos
más cortos de ADN viajarán más rápido a
través de los poros de la matriz del gel
que los fragmentos más grandes.
Después de un rato que ha corrido el gel,
los fragmentos más cortos de ADN
estarán más cerca del extremo positivo
del gel y los más largos se mantendrán
FIG.2. Muestra detallada del gel de agarosa y su fundamento
cerca de los pozos. Una vez que los
fragmentos se han separado, podemos
examinar el gel y saber el tamaño de las
bandas que se encuentran en él. Cuando
un gel se tiñe con un pigmento que se
une al ADN y se coloca bajo luz UV, los
fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos
permite ver el ADN presente en distintos
lugares a lo largo del gel. Esta practica
opta por realizar una corrida
electroforética exitosa con respecto al
DNA genómico.
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación del gel de agarosa: Preparar
un gel de agarosa al 1% en una solución
final de 20 ml, pesando así en una
balanza analítica 0.2 g de Agarosa y
añadiendo el Buffer Tae 1X enrasando a
20 ml; teniendo una concentración de
1:10 y mezclar. Calentar hasta que la
muestra entre en una temperatura de
ebullición, esperar a que la muestra
enfríe a 40°C y añadir 2µl del SYBr Safe
para diferenciar los fragmentos en el gel.
Gelificar la muestra a temperatura
ambiente añadiendo el peine también
por 15´. Retirar y colocar en la cámara de
electroforesis.
Preparación de la muestra de ADN: Se
cogieron 8µl de ADN y 2µl del buffer de
Corrida Electroforética: Enrasar con el
buffer TAE 0.5X el gel ya introducido en
la cámara de electroforesis; conectar la
fuente de poder a los electrodos de la
cámara electroforética, para luego
carga 6X obteniendo así un volumen final
de 10µl.
comenzar con la corrida a 100V/40´.
Finalizado el proceso desconectar la
fuente de poder . Retirar el gel de la
cámara de electroforesis y visualizar las
bandas de DNA iluminando el gel con una
lámpara de luz ultravioleta. Visualizar.
RESULTADOS

*Observamos el gel de agarosa en la cámara de luz ultravioleta con la

muestra adicionada pero no se vio ningún fragmento de ADN en la corrida. Y
se comparó con los pesos moleculares de una corrida realizada
correctamente y como es que nos debió salir.

DISCUSIÓN

Probablemente no se obtuvo una correcta identificación de los fragmentos

en la cámara de luz UV por una mala extracción por parte del operador o que
el buffer TAE como es reutilizado haya afectado en la resolución.

CONCLUSIONES

Se preparo un gel de agarosa 1% para la visualización de fragmentos de DNA.

Se realizó una corrida electroforética del DNA de fluido sanguíneo extraído

anteriormente.
RECOMENDACIONES

-Se recomienda hacer una buena extracción de DNA antes de pasar al

análisis electroforético con la bioseguridad respectiva.

-Usar el visor de gel en la camara correcto ya que por un error de luz y de

criterio podría no verse las bandas.

REFERENCIAS

1. De Castro, A. M. P. (2010). Electroforesis en gel de agarosa.

2. Pérez, H. M. G. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida:
fundamentos, actualidad e importancia. Universo Diagnóstico, 1(2), 31-
4.
3. Becerra, V., & Paredes, C. (2000). Uso de marcadores bioquímicos y
moleculares en estudios de diversidad genética. Agricultura técnica,
60(3), 270-281.
4. http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/6798/mod_resou
rce/content/0/Electroforesis.pdf

CUESTIONARIO

1. Indique que factores afectan la separación del DNA en una corrida

electroforética.
En general, la separación de fragmentos grandes de DNA es mejor a
bajos voltajes (aunque esto incrementa el tiempo de electroforesis).
Sin embargo, elevados voltajes producen bandas estrechas y bastante
bien resueltas cuando se trata de fragmentos pequeños.A mayor
concentración de agarosa, menor diámetro de poro y menor
movilidad. La movilidad electroforética de los fragmentos de DNA es
inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño, expresado en
pares de bases.
2. ¿Qué otros buffers se pueden utilizar en la electroforesis de DNA?
Indique su composición y en que situaciones se les puede usar.
 Tampón Tris-Gly: Un tampón "Tris-glicina" se prepara con Tris
base y con glicina, ambos a la concentración indicada. El pH
debe resultar el adecuado sin necesidad de ajustarlo (pues este
tampón no debe llevar cloruro). Una composición frecuente es
125 mM Gly, 25 mM Tris, pH=8,3. En el caso de electroforesis
desnaturalizante lleva además 0,1% de SDS. En la electroforesis
PAGE discontinua, es el tampón con el que se llena la cubeta o
tanque de electroforesis.
 Xileno-cianol y verde cianol: Se trata de compuestos coloreados
y con carga, utilizados para comprobar el progreso de la
electroforesis. En la electroforesis el xileno-cianol se mueve
aproximadamente como las moléculas de DNA de 3500 a 5000
pb (depende del tampón y el % de agarosa en el gel).
Ambos tienen un color azul turquesa que permite detener la
electroforesis con la confianza de que las moléculas grandes de
DNA no se hayan salido del gel.

 GelRed™: Es la marca comercial de un compuesto adecuado

para revelar el DNA en geles. Su estructura es un secreto
comercial bajo patente, pero es algo similar al compuesto
mostrado a la derecha.
o Dos núcleos aromáticos: le confieren capacidad
intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al
DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se
debe a su geometría plana y su estructura aromática, que
interacciona favorablemente con el interior hidrófobo de
la doble hélice.
o Una cadena alifática larga que hace de conector entre
ambos núcleos intercalantes.
o Por otra pare, su ligera carga positiva también facilita su
unión al DNA (recuérdese que éste es una molécula
polianiónica).
 Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia:
o En forma libre, los dos núcleos aromáticos interaccionan entre sí
y por ello la molécula apenas es fluorescente.
o Al unirse al DNA los dos núcleos se separan y, al encontrarse en
un entorno hidrófobo, emiten una fluorescencia intensa. Se
excitan con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emiten luz
visible, de color rojo (de ahí el nombre del reactivo).
o En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su
posición en el gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en
una disolución de GelRed™, o bien incorporar éste a la
disolución de agarosa con la que se prepara el gel.
o Los ensayos realizados por el fabricante indican que este
compuesto no es cancerígeno como el etidio, lo cual se atribuye
a que su estructura y, en particular, su carga impiden que
atraviese las membranas celulares.

3. Mencione cuatro diferencias entre Geles de Agarosa y Geles de

poliacrilamida.
AGAROSA
 Fragmentos de 50pb-40Kb
 Menor resolución
 Más fácil de preparación
 La corrida es horizontal
POLIACRILAMIDA
Fragmentos de 5-600 pb
Mayor resolución
Más complicada de preparar
La corrida es vertical

4. Determinar el peso molecular de las bandas obtenidas.

5. ¿Qué criterios hay que tener en cuenta para seleccionar el voltaje y la

concentración de agarosa a usar en corrida electroforética?
El voltaje que se aplica en los geles de agarosa depende de la
resolución requerida y del tamaño de los fragmentos a separar. Entre
1-10V/cm (los cm se refieren a la distancia entre los electrodos), la
movilidad electroforética de los fragmentos lineales de DNA es
proporcional al voltaje aplicado; sin embargo, si se incrementa el
 voltaje, los fragmentos grandes cambian su movilidad electroforética,
sin que ésta guarde relación con su tamaño.

TRABAJO ADICIONAL
6. Desea realizar una resolución de sus fragmentos de ADN con enzimas
de restricción digerido. El tamaño de los productos esperados oscila
desde 500 hasta 100 pb. Usted descubre dos geles de agarosa de
polimerización, uno de ellos es al 5% de agarosa; el otro es 2% de
agarosa. ¿Cuál podría utilizar para resolver sus fragmentos?
Fundamente su respuesta.
100-500% 500-1000%
Se elegiría la agarosa al 5% debido Se elegiría la agarosa al 2% por
al tamaño de la porosidad y las tener menor tamaño en la
moléculas que ingresaran en cuya porosidad.
sustancia.

7. Después de la finalización de la corrida de fragmentos junto con el

marcador de peso molecular en un gel de agarosa, supongamos
muestras caso A y caso B, a continuación se observó:
Caso A: los carriles del gel en blanco (sin banda, no hay marcador de
peso molecular)
Debido al colorante se encontró que si se usa el SYBR safe funcionara
con luz azul en cambio el bromuro de etidio es capatado mejor por la
luz UV
Caso B: solamente el marcador de peso molecular es visible.
Hubo una mala extracción de ADN por parte del operador.
¿Qué explicaciones podría dar para estos casos? Suponga que ha
incluido un marcador de peso molecular en la corrida.
Que antes de hacer el procedimiento debería tenerse todo listo con
respecto a la luz uv y la luz azul.
 8. ¿Por qué el SYBr Safe o Run Safe es menos tóxico que el EtBr? Indique
5 diferencias.
Se realizó varios estudios con respecto al Bromuro de Etidio que es
una sustancia mutágena que a un mal manejo del sistema
electroforético y una mala manipulación.

RESUMEN

Hoy en día la tecnología ha ido avanzando y se dice que los robots tendrán
una dominación en la humanidad. Se ha hecho un estudio sobre pequeños
agentes creados por el hombre para el tratamiento de diversas
enfermedades y en algunos casos tengan el objetivo principal de eliminar
células cancerígenas y así optar por un avance en la nanotecnología. Estas
microparticulas actúan destruyendo las capas tumorales desde el origen de
esta así eliminando por completo la matriz cancerígena. Se establece que la
inserción de esta sustancia es vía sanguínea o vía muscular, en algunas
conferencias dictadas por TEC se dice que en la actualidad ya prácticamente
estamos respirando nanorobots por lo que se dice que estamos al margen y
expuestos a esta nueva faceta que ayudara a la medicina y a la
investigación. La creación de estas formas nanoscópicas es denominada
origami de ADN por los investigadores. Y sus propiedades pueden ser
aprovechadas para diseñar estructuras con agentes terapéuticos en su
interior que se despliegan y liberan estos agentes cuando llega su diana.