k k

11 N.◦ de publicación:
ES 2 004 704
19
REGISTRO DE LA
PROPIEDAD INDUSTRIAL kNúmero de solicitud: 8700816
21

ESPAÑA
kInt. Cl. : C12N 3/00
51 4

A01N 63/00

12k PATENTE DE INVENCION A6

k
22 Fecha de presentación: 24.03.87 k
73 Titular/es: Reuter Laboratories, Inc.
Manassas Park, Va 22111
8450 Natural Way, US

k
30 Prioridad: 24.03.86 US 843163

k
45 Fecha de anuncio de la concesión: 01.02.89 k
72 Inventor/es: Ellis, Beth-Jayne;
Obenchain, Frederick y
Mehta, Raj

k
46 Fecha de publicación del folleto de patente: k
74 Agente: Durán Moya, Luis Alfonso
01.02.89

k
54 Tı́tulo: Método para la producción in vitro de esporas bacterianas infectivas para el
control de escarabidos.

57kResumen:
Comprende el cultivo de células vegetativas de di-
cho bacilo en un medio lı́quido que comprende
al nivel soluble, trealosa, extracto de levadura,
K2 HPO4 y CaCO3 en condiciones aeróbicas con
pH controlado y añadiendo como coadyuvante de
esporulación de 5 a 250 mg/lb de sulfato de man-
ganeso al final de la fase de crecimiento vegetativo
e incubando hasta que tenga lugar la esporulación.
Destinado al control de escarábidos en agricultura
y jardinerı́a.

Venta de fascı́culos: Registro de la Propiedad Industrial. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION

La presente invención se refiere a nuevos compuestos insecticidas que comprenden esporas producidas
in vitro de bacterias que provocan enfermedad lechosa “milky disease” en larvas de escarabajo y para
5 mejorar métodos para la fabricación de dichos compuestos.

El método más eficaz para controlar los Escarabidos, tales como los escarabajos japoneses, compren-
den la infección de las larvas con bacterias huésped - especı́ficas que provocan enfermedad lechosa en
estas larvas. La enfermedad lechosa es letal a las larvas pero es inocua para otras especies de animales o
10 plantas. Entre las bacterias conocidas de la enfermedad lechosa se incluyen, sin constituir limitación, las
diferentes variedades de Bacillus popilliae (incluyendo las variedades popilliae, lentimorbus, melolonthae,
rhopaea, N.Z. Tipo I, N.Z. Tipo II, etc.)

La etapa vegetativa (barra) de estas bacterias no es adecuada para su utilización en preparados in-
15 secticidas. Las barras son sensitivas y no sobreviven en las condiciones relacionadas con los métodos de
aplicación de insecticidas o en las que se presentan en el campo. Como contraste, las esporas de esas
bacterias son muy resistentes a diferentes condiciones ambientales y permanecen visibles (e ineficaces)
en el campo después de su aplicación (en formulaciones de lı́quidos, polvo, gránulos o cebo) y durante
prolongados perı́odos de tiempo después de la misma.
20
A causa de la elevada proporción de mortalidad en la enfermedad lechosa, la huésped - especifici-
dad de los patógenos de la enfermedad lechosa y la ausencia del tipo de impacto ambiental adverso que
habitualmente acompaña la utilización de pesticidas quı́micos, las esporas de la enfermedad lechosa son
particularmente adecuadas para su utilización en compuestos pesticidas. No obstante, diferentes difi-
25 cultades en la obtención de esporas eficaces, particularmente en cantidades grandes y económicamente
atractivas, han impedido la aceptación amplia de este tipo de pesticidas.

Muchos investigadores han fracasado en la obtención de una esporulación sustancial de la B. popilliae

y otras bacterias de la enfermedad lechosa in vitro. Dutky propuso en primer lugar un método para
30 la producción de esporas B. popilliae in vivo. Este método, descrito por ejemplo en la Patente U.S.A.
N◦ 2.293.890 comporta la inyección de esporas de B. popilliae viable a larvas vivas de escarabajo ja-
ponés (esporas conseguidas de la linfa sanguı́nea de larvas con enfermedad) dejando que la enfermedad se
desarrolle, secando y reduciendo a polvo las larvas enfermas y aplicando el material resultante en el campo.
35 Es evidente que este método in vivo es extremadamente engorroso, costoso y requiere gran cantidad
de mano de obra. Además mediante dicho método solamente se pueden conseguir cantidades limitadas
de B. popilliae, tanto por el hecho de que la cantidad de esporas consegida como porcentaje de la masa
de larvas es pequeño, como por el hecho de que se puede obtener larvas de escarabidos solamente durante
ciertos meses (Marzo a Mayo y de Agosto a Octubre).
40
Para satisfacer la necesidad reconocida de una fuente alternativa de esporas para la enfermedad le-
chosa la investigación ha revertido a métodos in vitro. Desafortunadamente solamente se ha informado de
una esporulación limitada de las bacterias de la enfermedad lechosa in vitro. Si bien se pueden producir
grandes cantidades de células vegetativas en métodos artificiales (lı́quidos o sólidos), el grado promedio
45 de esporulación no supera usualmente 10 - 30% y la infectividad de las esporas se ha indicado ser o bien
sustancialmente reducida (de tal forma que no serı́a útil comercialmente) o inexistente: ver, M.G. Klein
“Advances in the Use of B. popilliae for Pest Control” en Micr. Contr. of Pests and Plant Diseases,
Burgess, H.D. (Editor) 1981 Academic Press, pp. 184 - 192.
50 St. Julien y L.A. Bulla, Jr. Current Topics in Comparative Pathobiology, T.C. Cheng (Editor) 1973,
G., Vol. 2, Academic Press, pp 57 - 87 indican que una esporulación del orden del 20% tiene lugar en
una población de células coloniales NRRL B - 2309M en un medio sólido formulado mediante extracto
de levadura, ingredientes del medio Mueller - Hinton contiene una cantidad muy pequeña (0,15%) de
almidón. Por lo tanto, el medio St. Julien y Bulla contiene solamente 0,0015%de almidón.
55
La Patente U.S.A. n◦ de Rhodes y otros se propone un procedimiento para la inducción de esporulación
in vitro de subcepas NRRL - B - 2309 de B. popilliae en una producción solamente 3 - 5% mediante

(a) cultivo de células vegetativas drante 18 - 24 horas en frascos sometidos a agitación (o con aireación
60 0,15 - 0,5 vvm) en un medio acuoso que contiene (en base peso por volumen) 0,2% de glucosa,
fructosa o trehalosa, 1,5 - 2,0% de extracto de levadura y una cantidad suficiente de K2 HPO4 para
ajustar el pH a 7,2 - 7,5 (0,3%);

2
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(b) transferir las células a recipientes inclinados (“slants”) o placas que contienen agar, extracto de
levadura, acetato sódico y K2 HPO4 para formar colonias no densas; y
(c) cultivar las colonias durante 42 dı́as hasta aparición de esporulación.
5
La Patente U.S.A. n◦ 3.071.519 de Bonnefoi está destinada a un método para la producción de gran
número de esporas B.thuringiesis mediante el cultivo de una base de estas bacterias en un medio lı́quido
con un pH comprendido entre 5,5 y 8,5 conteniendo nitrógeno aminado y por lo menos uno de los com-
puestos: sacarasa, maltosa, dextrosa y dextrina y como elemento trazador, uno o varios de: calcio, zinc,
10
manganeso y magnesio hasta que tenga lugar la esporulación y recogiendo las esporas. No obstante, la
B. thuringiensis no es una bacteria productora de la enfermedad lechosa. Además la B. thuringiensis se
ha mostrado mucho más fácil de cultivar in vitro que los bacilos de la enfermedad lechosa.

La Patente U.S.A. n◦ 3.503.851 de Srinivasan está dirigida a un método in vitro para la producción
15
de esporas B. polilliae que comprenden el cultivo de B. popilliae en un medio lı́quido que contiene ex-
tracto de levadura, glucosa, cloruro sódico, sulfato amónico, K2 HPO4 , MnSO4 .H2 O, CaCl2 , ZnSO4 .7H2 O,
CuSo4 .5H2 O, FeSO4 .7H2 O y una pequeña cantidad de un compuesto cloroalifático, tal como cloroaceta-
mida, cloroformo o un tricloroetanol. La proporción de esporulación obtenida de este modo se ha indicado
tener valores de la magnitud de 80%.
20
En primer lugar, la utilización de compuestos cloroalifáticos es poco deseable por dos razones:

(a) estos compuestos son volátiles y requerirı́an una reposición constante en un medio de cultivo aireado,
lo cual aumenta los costes de producción; y
25 (b) estos compuestos son tóxicos, sus vapores constituirı́an un peligro para el personal de la fábrica y
las cantidades residuales que permanecieran en el producto serı́an liberadas hacia el medio ambiente
contaminando las cosechas agrı́colas. Por estas razones el proceso de Srinivasan no es practicable
ni deseable para la fabricación en escala comercial.
30
En un segundo lugar, las cepas depositadas por Srinivasan no son B. popilliae. Estas cepas se ha dicho
que han sido mal identificadas en el Agricultural Handbook, infra, Tabla 50, páginas 260 - 261 (citando
la Patente de Srinivasan antes comentada) y desde entonces se ha indentificado que son B. popilliae (B.
megaterium, B. cereus, B. polymyxa, etc.). La literatura cientı́fica contiene asimismo otros informes de
35 B. cereus y B. polymyxa que se han confundido con B. popilliae.

La Patente U.S.A. n◦ 3.950.225 de Skole está dirigida a un método de dos fases (fermentación - espo-
rulación) para B. popilliae y B. lentimorbus. El crecimiento vegetativo se logra un medio que contiene
extracto de levadura, K2 HPO4 , glucosa y triptosa. La masa celular resultante es transferida a conti-
40 nuación a agua de desperdicio de negro animal de refinerı́a de caña de azúcar e incubada en la misma
como medio de esporulación. La Patente sostiene que se obtuvo una proporción de esporulación de 100%
por este procedimiento pero no indica la base de cálculo para esta cifra. La Patente no indica nada con
respecto a los contages de esporas sobre una base de a’ por unidad de volumen (de medio de cultivo).
Además, en el único ejemplo, la Patente indica que se transfirió una masa celular de 6,5 ± 0,5 g de 75 ml
45 de medio de crecimiento vegetativo a 5 litros de agua de desperdicio de negro animal. Esto representa
más de 66 veces de aumento en volumen, lo cual serı́a muy poco práctico a escala comercial. Finalmente,
la Patente Skole no contiene datos de ineficacia en cuanto a las esporas producidas in vitro.

Ası́ pues, muchos investigadores han publicado o patentado protocolos detallados para la inducción
50 de esporulación de B. popilliae in vitro. No obstante, ninguno de esos procedimientos se ha desmostrado
capaz de cumplir las exigencias básicas de un proceso eficaz para la producción de esporas de B. popilliae
adecuado para la producción en gran escala.

Estas exigencias son:

55
* producción de grandes poblaciones de células por unidad de volumen de fermentación;
* un elevado procentaje de las células deberı́a esporular;

60
* el crecimiento y la esporulación deberı́an tener lugar en condiciones que se pudieran conducir al
proceso en gran escala;
* las esporas resultantes deberı́an ser capaces de germinación y deberı́an ser infectivas.

3
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En la actualidad la B. popilliae var. popilliae (que puede contener pequeñas cantidades de la variedad
lentimorbus) es el único bacilo de la enfermedad lechosa producido comercialmente y se produce sola-
mente in vivo.

5 El fracaso de las técnicas anteriores en conseguir un proceso eficaz (especialmente un proceso acep-
table para escala comercial) para la producción de esporas de la enfermedad lechosa in vitro que va
acompañado (o posiblemente provocado) por ciertas opiniones con respecto a la morfologı́a y propiedades
de los bacilos de la enfermedad lechosa y en particular de la B. popilliae y sus variedades. Estas opinio-
nes son mantenidas ampliamente por los técnicos en la materia como queda evidenciado por numerosas
10 referencias en la literatura constituyendo la “opinión aceptada” en este campo.

La B. popilliae se caracteriza de manera universal en la literatura como un patógeno obligado de

los insectos formado en un esporangio hinchado que no se autolisa para liberar esporas libres (ver por
ejemplo R.J. Milner, infra, p.46). Esta bacteria es catalasa - negativa e incapaz de crecer en un caldo de
15 cultivo. Se considera que tiene unas exigencias extremadamente engorrosas para su crecimiento.

La opinión aceptada en la literatura con respecto a las esporas B. popilliae es que quedan casi siempre
retenidas en un esporangio excepto en casos raros cuando los bacilos son cultivados en el medio sólido in
vitro y de manera muy rara in vivo. De este modo, la apariencia de un esporangio es aceptada como un
20 marcador importante para la identificación de la especie. En realidad, conocidos investigadores han indi-
cado que las esporas cultivadas en un cultivo lı́quido que no tienen esporangio no son B. popilliae. Ver de
manera general el Agriculture Handobook, N◦ 427, R.E Gordon y otros (Agricultural Research Service,
U.S.D.A., 1973) y R. J. Milner, “Identification of the Bacillus popilliae Group of Insect Pathogens”in
Micr. Contr. of Pest and Plant Diseases, Burges, H.D. (Editor) 1981 Academic Press, pp. 45 - 59. Ası́
25 pues, aunque algunos investigadores habı́an observado esporas desnudas de la enfermedad lechosa (libres
de esporangio) en medios distintos de los que contienen acetato, no las identificaron como tales. Sharpe,
E.S. y otros 1984 Appl. Microbiol. 19 (4) : 681 - 688 indican la observación de esporas ocasionalmente
libres en colonias esporulantes (es medios sólidos) de la cepa NRRL - B - 2309M B. popilliae. Los mismos
investigadores obtuvieron resultados marginales en términos de proporción de esporulación in vitro y, de
30 manera más significativa, una infectividad muy reducida en ensayos. Los resultados de sus pruebas de
infectividad per os (en las cuales se inoculó el suelo con 30 × 106 esporas por gramo) fueron negativos.
Estos resultados llevaron a los investigadores a afirmar:

Aparentemente, las esporas in vitro de B. popilliae B - 2309M son incapaces de infectar las larvas del
35 escarabajo japonés por la ruta natural, el intestino del insecto. [Sharpe y otros, supra, en p. 686].

R.G. Milner, supra indica que las esporas y el cuerpo paraesporal pueden ser liberados del esporangio
por ultrasonidos con la finalidad de estudiar los detalles de la estructura superficial de las esporas, pero
esto no involucra esporas desnudas directamente recogidas de medio de cultivo lı́quido.
40
Otra conclusión ampliamente aceptada en este campo es que un bioensayo en el cual B. popilliae (o
cualquier espora de enfermedad lechosa) se administra a las larvas de escarábidos por inyección, propor-
ciona una prueba fiable sobre la infectividad de las esporas. Este bioensayo de inyección se ha descubierto
que requiere un menor nivel de dosis para la infección que los necesarios en bioensayos en los que las
45 esporas se administran per os (tal como el bioensayo de inoculación de suelo). Dado que el hecho de
los bioensayos per os son sustancialmente más difı́ciles de llevar a cabo y engorrosos en cuanto a tiempo
necesario, el ensayo de inyección se adoptó como indicador de infectividad escogido. Además, las esporas
que se ha descubierto son infectivas por inyección se han indicado frecuentemente ser no infectivas cuando
se administran per os. No se ha informado sobre lo inverso.
50
La totalidad de estas observaciones mencionadas anteriormente, sirven para inducir en los técnicos en
la materia la convinción implı́cita de que si las esporas no fueran infectivas cuando se administraron por
inyección, no serı́an infectivas administradas per os.

55 Como resumen, el estado de la técnica (en el momento en que se hizo la presente invención) aceptó
las indicaciones antes descritas en cuanto a la morfologı́a y propiedades de los bacilos de la enfermedad
lechosa, y en particular de la B. popilliae y no habı́an logrado un cultivo eficaz de la B. popilliae in vitro
en gran escala.

60 De acuerdo con lo anterior, un objetivo de la presente invención es dar a conocer un método para
promocionar la esporulación in vitro de bacilos de la enfermedad lechosa en una proporción sustancial-
mente mayor que la que se consigue en las técnicas anteriormente conocidas, especialmente en términos

4
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de rendimiento.

Otro objetivo es proporcionar un método para obtener grandes cantidades de esporas de bacilo de la
enfermedad lechosa aumentando la eficacia de la esporulación in vitro de estos patógenos.
5
Otro objetivo es proporcionar un método para la obtención de grandes cantidades de esporas viables
de la enfermedad lechosa, germinables e infectivas, especialmmente cuando estas esporas son administra-
das per os.

10 Otro objetivo es proporcionar un compuesto insecticida destinado a su utilización en combatir ma-

nifestaciones de escarábidos y otras plagas de los campos, huertos, jardines y contenedores (plantas en
maceta) que comprenden esporas de la enfermedad lechosa producidas in vitro.

Estos y otros objetivos de la presente invención quedarán evidentes a los técnicos en la materia en
15 base a la siguiente descripción, reivindicaciones y dibujos.

Figura 1

es un diagrama esquemático de los modelos de crecimiento y esporulación de B. popilliae in vivo y en

20 lı́quido y medio sólido in vitro.

Figura 2

es un gráfico de la raiz cuadrada de la infectividad percentual de las esporas B. popilliae con respecto
25 al logaritmo de la dosis de esporas administradas por inyección en un bioensayo de inyección.

Figura 3

es un gráfico de la infectividad percentual de las esporas B. popilliae según un escala de probabilidades

30 con respecto al logaritmo de la concentración de esporas en un bioensayo de inoculación de suelo.

Los números que aparecen en las figuras corresponden a las siguientes designaciones:

Figura 1
35

1. Esporas libres in vitro

2. Germinación
40 3. Ciclo crecimiento vegetativo
4. Barra
5. Muerte celulas
45
6. in vivo var popilliae
7. Var Lentimorbis
8. Esporulación
50
9. Lisis del Esporangio
10. Esporangio en desarrollo
11. Producido in vivo
55
12. Medio sólido in vitro ( - - - observación ocasional)
13. Medio lı́quido in vitro

60 14. Medio lı́quido in vitro (Observación ocasional)

15. In Vivo observación ocasional

5
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Figura 2

1. Porcentaje de larvas lechosas por ensayo

5
2. Curva de respuesta de la literatura especı́fica para esporas Reuter in vivo
3. NRRL B - 4154 (Nueva Zelanda)
4. Dosis logarı́timica esporas/inyección
10
5. Esporas de cultivo lı́quido NRRL 3391 y Nueva Zelanda
6. Esporas de Placa de hemolinfa - in vivo
7. Esporas 1182, D63, 2309 secadas por congelación
15
Figura 3

1. Porcentaje lechosas por ensayo

20
2. Mezcla
3. Concentración esporas
Un aspecto de la presente invención se dirige a un método para promover la esporulación de bacilos de
25
la enfermedad lechosa in vitro que comprende: cultivo de células vegetativas de dichos bacilos mediante
el fin de la fase de crecimiento en el medio esterilizado, aireado, con pH controlado, que comprende ex-
tracto de levadura, azúcar soluble, hipofosfato potásico y carbonato cálcico, añañdiendo en dicho medio,
como coadyuvante de esporulación, sulfato de manganeso e incubando estas células durante el tiempo
suficiente para que tenga lugar una esporulación superior al 80%. Los rendimientos obtenidos por este
30
procedimiento para cepas que muestran un crecimiento vegetativo saludable son por lo menos de unas
109 esporas/ml de medio lı́quido en un fermentador.

De manera preferente, el medio de crecimiento comprende también almidón soluble como estimula-
dor de crecimiento. Preferentemente se utiliza una resina absorbente como coadyuvante de esporulación
35
adicional.

Otro aspecto de la presente invención está dirigido a un compuesto insecticida que comprende como
ingrediente activo una cantidad efectiva desde el punto de vista insecticida de esporas de la enfermedad
lechosa libres de esporangio producidas en un cultivo in vitro.
40
Preferentemente las esporas libres de esporangio son una mezcla de esporas procedentes por lo menos
de dos cepas distintas.

De manera más preferente el compuesto de la presente invención comprende una mezcla de esporas
45 de la enfermedad lechosa libres de esporangio y que tienen esporangio, con dichas esporas libres de espo-
rangio teniendo por lo menos una participación sustancial en la infectividad per os de dicho compuesto.
No obstante, el porcentaje de esporas in vivo no es necesario que exceda 0,01% del contenido total de
esporas, lo que representará no más de 0,07% del contenido de esporas de los productos comercializados
conteniendo solamente esporas in vivo.
50
La presente invención se describe en detalle a continuación con referencia a realizaciones especı́ficas
preferentes. Un método preferente para la producción de esporas desnudas de la enfermedad lechosa in
vitro se describe en primer lugar seguido de la descripción del modelo de crecimiento y esporulación de
la B. popilliae y de su infectividad.
55
Se comprenderá, no obstante, que la presente invención no queda limitada a B. popilliae sino que es
aplicable a todos los organismos que provocan la enfermedad lechosa en larvas de escarábidos y otros in-
sectos que pueden ser infectados con estos organismos. Tampoco se limitan los compuestos de la presente
invención a esporas desnudas producidas mediante el proceso que se describe a continuación.
60
Es muy importante observar normas sanitarias estrictas en todas las fases de cultivo de las bacterias
de la enfermedad lechosa para evitar contaminación. Por las mismas razones es importante transferir las

6
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células vegetativas frecuentemente y someterlas a frecuentes exámenes microscópicos y bioquı́micos ası́

como a pruebas de viabilidad e infectividad.

Se pueden mantener las cepas por transferencia frecuente de células vegetativas o por almacena-
5 miento aséptico de esporas viables. De este modo, para el mantenimiento de las cepas, las condiciones
de crecimiento y de esporulación deben ser asépticas y para la producción las condiciones de recogida y
liofilización deben ser por lo menos sanitarias si no asépticas.

De acuerdo con la presente invención, se establecen en primer lugar cultivos de mantenimiento de los
10 bacilos de la enfermedad lechosa. Si bien se pueden utilizar cualesquiera cepas infectivas esporulantes de
bacilos de la enfermedad lechosa para la presente invención, tales como las cepas NRRL B - 2309, B -
2309 - S, B - 2309M, y sus derivados infectivos, los aislados esporulantes de cepas NRRL B - 2309T, B -
2524, B - 3195, B - 3391, y B - 4154 y sus derivados infectivos son preferentes. Las siguientes cepas de B.
popilliae son particularmente preferentes: ATCC - 53256 (RLI - 1182 - W), ATCC - 53257 (RLI - 8015 -
15 14G), ATCC - 53258 (RLI - D - 63) y ATCC - 53259 (NRRL - B - 2309 - Micro - 1). La más preferible
es ATCC - 53256 (RLI - D - 1182 - W).

Esencialmente todas las esporas resultantes de los procesos in vitro de la presente invención están
libres de esporangio recogidas al final de la esporulación. Las esporas se encuentran dentro de un espo-
20 rangio pero se autolisan en cultivo cuando madura la espora.

Cuando se inyectan en larvas de escarábidos las esporas producidas de acuerdo con la presente in-
vención tienen una infectividad sustancialmente inferior a los niveles aceptables. Además, elevadas dosis
de esporas por inyección no resultan en una infectividad elevada (ver figura 2 y la Tabla I). Comple-
25 tamente al contrario, la respuesta a la dosis alcanza rápidamente un máximo y luego disminuye. En
contraste, las esporas de la presente invención son muy ineficaces cuando se administran per os, y dosis
más elevadas resultan en una infectividad más elevada (ver figura 3 y Tabla II).

Dado que las técnicas anteriormente conocidas tienden a considerar las esporas sin esporangio no
30 como esporas de la enfermedad lechosa y a causa de que estas esporas no son suficientemente infectivas
por inyección, irı́a contra el criterio aceptado en esta técnica el utilizar estas esporas en la formulación de
compuestos insecticidas o para combatir manifestaciones de escarábidos en el campo, jardines, huertos,
pastos, prados o contenedores.

35 Se pueden establecer cultivos de mantenimiento en medios sólidos tal como es bien conocido. El medio
estéril sólido J, preferentemente modificado para que contenga de manera aproximada (en base a peso de
ingrediente por volumen del medio) 1% triptona (disponible por ejemplo de la empresa Difco, Detroit,
Michigan); aproximadamente 0,5% de extracto de levadura (Difco); aproximadamente 0,3% K2 HPO4 ;
aproximadamente 0,2% de dextrosa; y aproximadamente 1 - 2% agar (Difco) en agua destilada y medio
40 lı́quido modificado J que contiene 1,5% de levadura, 0,2% de trehalosa (o glucosa), 0,6% K2 HPO4 y
1,5% agar, son particularmente preferibles. La trehalosa u otro azúcar soluble pueden ser sustituı́dos
por la dextrosa y trehalosa, de modo preferente. Estos componentes del medio deben ser esterilizados,
preferentemente por autoclave; el azúcar es sometido a autoclave preferentemente de modo separado y se
añade asépticamente a los otros componentes esterilizados del medio.
45
La incubación del cultivo de mantenimiento vegetativo tiene lugar a 25 - 30◦ C y preferentemente a
28◦C. Son preferibles transferencias frecuentes de células (semanalmente o incluso bisemanalmente) a un
medio reciente para asegurar mantenimiento de la cepa y ayudar a impedir acumulación de sustancias
perjudiciales e inhibidoras de la esporulación que se pudieran generar por las bacterias. Se consigue el
50 mantenimiento de las cepas a largo plazo por liofilización de células vegetativas o, preferentemente, por
almacenamientop aséptico de las esporas.

Se utiliza preferentemente un cultivo lı́quido (sumergido) para conseguir un crecimiento vegetativo

pleno antes de la inducción de la esporulación. Los medios lı́quidos preferentes contienen aproximadamente
55 0,1 - 0,2 de un azúcar soluble como nutriente (preferentemente 0,1% de trehalosa puesto que otros
azúcares, especialmente la glucosa, tienen un marcado efecto inhibidor en la esporulación); aproximada-
mente 0,5 - 1,5 y preferentementre 1,0% de extracto de levadura (el hidrolizado de la caseı́na puede ser
sustituı́do por lo menos por una parte del extracto de levadura); aproximadamente 0,1 - 6,0% K2 HPO4
(0,3%más preferible); aproximadamente 0,0 - 0,3% CaCO3 (más preferible 0,2%); y agua destilada. De
60 modo preferente el medio de cultivo lı́quido contiene también aproximadamente 0,1 - 2,0% (preferente-
mente 1%) de almidón soluble. Los ingredientes deben ser esterilizados preferentemente por filtrado y
añadidos a CaCO3 que debe haber sido esterilizado previamente por acción separada del autoclave. De

7
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manera alternativa, la acción del autoclave se puede utilizar como técnica general de esterilización pero
incluso en este caso el azúcar soluble debe ser sometido separadamente a la acción del autoclave.

El pH inicial del medio de crecimiento se debe ajustar a un valor comprendido entre 6,8 y 8,1 y
5 preferentemente 7,6 ± 0,2. Sales de elementos esenciales adicionales conocidos y compuestos tales como
manganeso, cobre, hierro y zinc se pueden añadir pero se debe evitar el sodio puesto que se sabe que
inhibe el crecimiento vegetativo de algunas cepas. No obstante, el medio se compone preferentemente
de los ingredientes previamente descritos sin materiales adicionales. La utilización de este medio, no
solamente promueve el crecimiento vegetativo sino que ayuda también para conseguir valores de esporu-
10 lación mayores y una inefectividad mayor de las esporas resultantes que los conseguidos por la técnicas
convencionales. Se cree que el almidón soluble es principalmente un agente absorbente o formador de
complejos para los productos tóxicos contra la esporulación es decir, un estimulante de crecimiento en
vez de un nutriente.

15 Se prepara un inoculante bacteriano a partir del cultivo de mantenimiento preferentemente en una

muestra de medio de cultivo sumergido en condiciones asépticas. El inoculado queda listo para su utili-
zación cuando la densidad de las células es aproximadamente de 1 × 107 hasta 1,5 × 109 y preferentemente
cuando las barras se encuentran en una fase de crecimiento logarı́tmico de 1 × 109 barras/ml. Esto tiene
lugar usualmente en una noche (10 - 24 horas), pero la proporción de crecimiennto varı́a de una cepa a
20 otra. El inoculante es incubado preferentemente a 32◦ C con aireación o mezclado mecánico.

El cultivo sumergido es iniciado en un fermentador. Un volumen apropiado del inoculante (prefe-

rentemente 3 - 12% del volumen de trabajo del fermentador) se añade al medio de cultivo. El cultivo
resultante es incubado durante aproximadamente 12 - 24 horas hasta completar la fase de crecimiento
25 (evidenciado por el final del crecimiento del logaritmo de la población). Las condiciones de incubación
preferentes son 32 ± 1◦ C con mezcla mecánica contı́nua (200 - 250 rpm) y aireación (0,2 - 0,5 vvm de
aire estéril) con un pH no menor de 6,2 (preferentemente 7,2 ± 0,2 para crecimiento óptimo). El control
del pH, que es importante para hacer máximo el rendimiento celular, se puede conseguuir por añadidura
de HCl o una base libre de sodio. El valor de pH óptimo varı́a de cepa a cepa pero de manera general se
30 encuentra dentro de los lı́mites antes indicados.

La formación de espuma, que es poco deseable, tiene lugar habitualmente con velocidades de mezcla
más elevadas y/o proporciones de aire. La formación de espuma se puede controlar, si es necesario,
por añadidura de un agente inhibidor de la espuma apropiado tal como HODAG FD - 62 (un agente
35 antiespuma basado en siliconas) ) de la Hodag Chemical Corporation, Skokie, Illinois, u otro agente
antiespumante sintético o aceite vegetal o por medios mecánicos. Si se utiliza un agente de destrucción
de la espuma, se debe encontrar en emulsión estéril o en forma de solución. Es preferible tres ml/litro de
una emulsión al 5% de HODAG FD - 62 en volumen; se introduce preferentemente después de que haya
empezado la fermentación pero antes de la constituión de espuma (usualmente dentro del perı́odo de 4 -
40 6 horas a partir de la iniciación de la fermentación).

La duración del perı́odo de cultivo durante la fase de crecimiento depende de la proporción de la

división de células vegetativas pero habitualmente dura 12 - 24 horas. La densidad de células preferente
para la esporulaciónn es de 0,5 - 1,5 × 109 células/ml. Si bien la densidad celular real obtenida (especial-
45 mente a gran escala) puede ser ligeramente menor, se compara favorablemente con la densidad celular en
el hemolinfa de larvas que es usualmente de 1 - 2 × 1010 células/ml.

A continuación se añade sulfato de manganeso como coadyuvante de esporulación para inducir y pro-
mover la esporulación. Además se añade preferentemente una resina adsorbente especialmente cuando la
50 cepa no ha crecido de manera vigorosa durante la fase vegetativa. Ambos aditivos se ha descubierto que
promueven la esporulación y resultan en esporas germinables e infectivas. Si bien es preferible el MnSO4
se pueden añadir otras trazas minerales en sustitución tales como sales comunes de mineral de hierro,
zinc, cobalto o nı́quel o bien sales orgánicas de estos metales como sales de ácidos carboxı́licos alifáticos
(por ejemplo acetatos o propionatos). Otras resinas de intercambio iónico y/o resinas adsorbentes se
55 pueden utilizar individualmente o en combinación tales como resinas de intercambio catiónico Amberlite
IR - 120 (Rohm & Haas) o Dowex 50 WX4 (Dow Chemical Co.); las resinas de intercambio aniónico
Amberlite IRA - 410 o IR - 45 (ambas fabricadas por Rohm & Haas); o bien la resina de intercambio
no iónico Diaion HP - 10 (Mitsbishi Chemical Industries de Japón). Lo más preferente es la resina de
intercambio no iónico Amberlite XAD - 7 (Rohm & Haas).
60
Se puede añadir MnSO4 en cantidades comprendidas entre aproximadamente 5,0 mg/l y 250 mg/l y
preferentemente entre 50’ mg/l del volumen de fermentación de trabajo.

8
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La resina se añade a un volumen de fermentación aproximado 1 - 15 g/l, preferentemente a 3 g/l. Con-

centraciones más elevadas no resultan en una esporulación mayor, pero concentraciones menores resultan
en una esporulación sustancialmente menor con ciertas cepas. La cantidad óptima de resina depende de
5 la cepa en el hecho de que algunas cepas muestran una esporulación mayor en el extremo elevado de la
gama anteriormente indicada. Las cepas que tienen un crecimiento vigoroso no requieren resina.

Las condiciones preferentes de esporulación son generalmente las mismas que las de crecimiento vege-
tativo, excepto que el pH es preferentemente y de modo aproximado 6,8 ± 0,1 (un pH más elevado hasta
10 aproximadamente 8,1 ± 0,1 puede ser tolerado pero no es necesario). El control del pH es importante y
se puede conseguir por añadidura de HCl o una base libre de sodio, según sea necesario.

Mediante la presente invención se consiguen proporciones de esporulación desde 80 hasta más de 95%.
La proporción de esporulación indicada se basa en la densidad de células vegetativas al final de la fase
15 de crecimiento.

En caso deseado, la resina puede ser eliminada por filtrado antes de recoger las esporas.

Las esporas pueden ser recogidas por añadidura de talco (MgSiO4 ) o silicato de aluminio hidratado
20 y centrifugación. Se utiliza talco (aproximadamente 0 - 10 g/l; preferentemente 5 g/l de malla 400) para
ayudar a separar las esporas del medio de cultivo. La separación se realiza preferentemente por centrifu-
gación de alta velocidad. Los componentes principales de la pastilla son talco, resina (si se utiliza y no
se elimina previamente) esporas, y CaCO3 . La pastilla se resuspende preferentemente en agua destilada
que contiene 0,1% de trehalosa (10 g/ml) y se seca por congelación. Las cantidades indicadas en este
25 párrafo y los siguientes corresponden a producción en escala comercial.

El rendimiento en peso en seco de este producto de fermentación primaria es aproximadamente 7,7 -

12,5 g/l del medio de esporulación.

30 El producto de fermentación primaria no debe ser higroscópico; la eliminación del medio no utili-
zado y consumido por centrifugación ayuda a lograr este objetivo. De manera alternativa, las esporas
se pueden concentrar por filtrado, sin añadidura de talco, CaCO3 etc., pueden ser lavadas varias veces
con agua (para limpiarlas del medio consumido) y luego secadas por congelación o por rociado. Si no se
utiliza talco o CaCO3 , los contajes de esporas por gramos de producto de fermentación primaria deben
35 ser mayores.

La composición preferente del producto de fermentación primaria centrifugado con talco y secado por
congelación, según una realización a escala comercial de la presente invención, es la siguiente: esporas
maduras - - aproximadamente 15 × 21%;
40
CaCO3 (malla 400) - - aproximadamente 10 - 14%;
resina - - aproximadamente 28 - 0%;
talco - - aproximadamente 47 - 65%;
trehalosa - - aproximadamente 0,9 - 1,4%
45
Una densidad preferentemente de esporas es aproximadamente 0,9 - 1,5 × 1011 esporas/gramo de
producto secado por congelación que contiene talco y resina.

Tal como se ha indicado previamente, esencialmente todas las esporas de la enfermedad lechosa pro-
50 ducidas in vitro en medio lı́quido tal como se ha indicado anteriormente, no tienen esporangio en el
momento de su recogida. Dado que estas esporas son infectivas especialmente cuando se administran per
os, son esporas de la enfermedad lechosa. De acuerdo con ello, para la presente invención, el modelo de
crecimiento y esporulación de los bacilos de la enfermedad lechosa tomando como ejemplo B. popilliae se
muestra en la Figura 1.
55
La Figura 1 describre los diferentes modelos de esporulación y crecimiento de B. popilliae dependiendo
del medio ambiente en el cual se cultiva el organismo. El modelo ABCDA in vivo se muestra por la lı́nea
de cruces. El modelo ABCDA in vitro y ABCEA en medio sólido se muestran por la lı́nea seguida y por
la lı́nea interrumpida cuando sea necesario, para significar observaciones ocasionales (La esporulación es
60 dı́ficil de conseguir en medio sólido).

Finalmente, el modelo in vitro en medio lı́quido ABCEA se muestra mediante la lı́nea de cı́rculos

9
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abiertos.

Las barras bacterianas resultan de germinación de esporas en el punto A del ciclo y sufren un ciclo
vegetativo de crecimiento. Después de la imposición de condiciones ambientales adversas, las barras
5 mueren o esporulan. El inicio de la esporulación, B, queda marcado por el desarrollo de un esporangio
in vivo y in vitro tanto en medio sólido como en medio lı́quido. Progresivamente, serán evidentes la
formación de endosporas y cuerpos paraesporales. Las esporas in vivo y en medio sólido madurarán en
el punto D formado o bien una espora tipo B. popilliae que contiene un cuerpo paraesporal o una espora
tipo B. lentimorbus que no contiene cuerpos paraesporales retráctiles. En medios lı́quidos, al esporangio
10 efectuará eventualmente lisis en el punto E (en el momento de maduración de las esporas) y no se obser-
vará, excepto de modo raro, cuerpos paraesporales retráctiles. Ocasionalmente, este tipo de crecimiento
también se observará en medios sólidos.

La ruta de maduración de esporas, no se asoció anteriormente a la B. popilliae antes de la presente

15 invención, o aún si lo hubiera sido, no se habrı́a asociado con las esporas de la enfermedad lechosa que
fueran infectivas en administración per os. Por lo tanto, antes de la presente invención, las esporas libres
de esporangios no se hubieran considerado (por los técnicos en la materia) capaces de constituir la base de
un compuesto insecticida para su aplicación en el campo, jardines, huertos, pastos, prados y contenedores
(a los cuales se hace en algunos casos referencia colectivamente como “este campo”).
20
No obstante, la infectividad de las esporas desnudas de la presente invención ha sido confirmada. De
hecho las esporas desnudas en la presente invención se han observado ser las más infectivas (con respecto
a las esporas que poseen esporangio producidas in vivo) en caso de quue se administren per os en vez de
serlo por inyección.
25
Haciendo referencia particularmente a la Figura 2, los resultados de los ensayos de inyección según la
literatura especı́fica se compararon con los obtenidos con las esporas producidas in vivo (con esporangio),
y una serie de esporas producidas in vitro. Cuando la raiz cuadrada del porcentaje de larvas de escarabajo
Japonés que dieron resultado lechoso en el ensayo, se indica en gráfico con relación al logaritmo de la
30 dosis de esporas por inyección, se indica en la literatura especı́fica una respuesta según una lı́nea recta
con un margen de 102 esporas que aumentan progresivamente a 100 por cien de lechosidad para una dosis
aproximada de 105 .

Las pruebas especı́ficas in vivo conducidas como controles positivos en los experimentos a los que se
35 hace referencia (marcados por cı́rculos oscuros) se encontraron dentro de la gama de infectividad indicada
en la literatura especı́fica para dosis de hasta 105 esporas/inyección. No obstante, para dosis mayores,
la proporción de infección adicional disminuyó como función de la dosis de esporas adicional y even-
tualmente la infectividad disminuyó substancialmente Esto indica que hay una dosis de umbral máximo
después de la cual declina la infectividad por inyección.
40
Cuando se comprobaron las esporas producidas in vitro según la presente invención en cuanto a infec-
tividad por inyección, la infectividad fué invariablemente menor que la indicada en la literatura especı́fica
para esporas in vivo para la misma dosis y fué substancialmente menor que la indicada en la literatura
especı́fica para esporas in vivo para la misma dosis y fué substancialmente menor que la prueba de control
45 positivo. Para cualquier dosis determinada la infectividad de las esporas in vivo fué varias veces mayor y
para dosis más elevadas la diferencia de infectividad aumentó varias veces en vez de reducirse. Además,
las esporas del cultivo lı́quido (marcado mediante x para la variedad NRRL B - 4154 y los cuadrados
abiertos para la variedad NRRL B - 3391) fueron en general más infectivas que las esporas secadas por
congelación de otras variedades para dosis comparables.
50
Es evidente de los resultados anteriores, que si el ensayo de inyección hubiera sido la única prueba
de infectividad llevada a cabo, los resultados hubieran sido considerados como poco satisfactorios. Los
resultados indican que en muchos casos cada larva tendrı́a que haber sido infectada con decenas de miles
hasta millones de esporas para desarrollar un porcentaje substancial de enfermedad por inyección. Esta
55 infectividad baja podrı́a quedar fácilmente enmascarada por niveles de fondo. A partir de estos resulta-
dos, los técnicos en la materia podrı́an llegar a la conclusión, de que las esporas producidas in vitro de
acuerdo con la presente invención, no tendrı́an utilidad substancial en compuestos insecticidas a utilizar
en este campo. De acuerdo con ello, si los inventores de la presente patente hubieran continuado acep-
tando la opinión ampliamente sustentada de que el bioensayo por inyección proporciona una infectividad
60 mayor para una dosis determinada que un bioensayo per os, hubieran abandonado cualesquiera esfuerzos
adicionales en utilizar esporas producidas in vitro en compuestos insecticidas.

10
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Con particular referencia a la Figura 3 y a la Tabla II, se describen a continuación los resultados de
los bioensayos de inoculaciónn de suelos.

Estos resultados muestran que en un bioensayo de inoculación de suelos en los que se introdujeron
5 esporas in vitro en un recipiente de suelo conjuntamente con larvas de tercera fase de escarabajo japonés,
las esporas producidas in vitro mostraron una menor infectividad que las esporas in vivo para la misma
concentración. A diferencia de los ensayos de inyección, no obstante, para concentraciones mayores de
esporas, la infectividad continuó incrementando y alcanzó los niveles de la infectividad de esporas in vivo
para concentraciones comprendidas aproximadamente entre 6 y 18 veces la concentración de esporas in
10 vivo.

Además, una mezcla de material USDA - std in vivo, ATCC - 53256 y ATCC - 53259 (Formulación
Z) mostró ser mucho más infectiva que mezclas de USDA std in vivo y cualesquiera de ATCC - 53256
ó ATCC - 53259 con proporciones comparables de material in vivo. La Formulación Z tiene una infec-
15 tividad comparable a la del producto in vivo para una concentración 6,4 veces la del material in vivo
mostrada en la Figura 3. Una formulación conteniendo 0,006% de la norma USDA (esporas in vivo),
3,906% de ATCC - 53258, 48,044% de ATCC - 53256 y 48,044% de ATCC - 53259 corresponde a esta
concentraciónn y es particularmente preferible. Este contenido de esporas se traduce aproximadamente
en 3 × 1011 esporas/1b de la formulación.
20
Las lı́neas mostradas en la Figura 3 corresponden aproximadamente a la mejor adecuación por los
puntos de datos (excepto por el material que contenı́a ATCC - 53256 a 4 × 109 esporas/gramo).

Una importante caracterı́stica de las presentes formulaciones es que contienen cantidades muy pe-
25 queñas de esporas producidas in vivo. Si bien son posibles proporciones mayores de esporas producidas
in vivo, éstas son innecesarias e ineconómicas. Ası́ pues, si bien en principio la única exigencia para la
formulación de la presente invención es que contenga una cantidad de esporas producidas in vitro tal
que substancialmente contributya a la infectividad de la formulación, en la práctica, es preferible utilizar
formulaciones que contienen cantidades mı́nimas de esporas producidas in vivo de manera tal que (cuando
30 se combinan con las esporas producidas in vitro) resulten en formulaciones producidas económicamente
con infectividad aceptable.

Desde luego, se comprenderá que en tanto la infectividad de las esporas depende de la cepa, las gamas
anteriormente indicadas sirven como norma únicamente, y no se puede generalizar para cada cepa de
35 esporas producidas in vitro ó in vivo. En cada caso en que se utilicen esporas producidas in vivo e in
vitro en combinación, no obstante, el compuesto tiene suficientes esporas producidas in vitro para tener
un efecto substancial (de incremento) en la efectividad del compuesto como conjunto.

Los compuestos insecticidas finales de acuerdo con la presente invención incluyen asimismo preferen-
40 temente un portador o diluyente. Son preferibles los grupos de sólidos en forma de polvo, granulares,
pastillas o de cebo. Entre los portadores sólidos se incluye (sin que sirva de limitación, el talco, car-
bonato cálcico, silicato de aluminio hidratado, caolı́n, salvado de maiz, dermiculita y sus mezclas. Son
particularmente preferentes el silicato de aluminio hidratado (para formulaciones en polvo) y el salvado
de maiz (para formualciones granulares). Preferentemente el portador o producto de carga comprende
45 aproximadamente desde 98,5% hasta más de 99,9% en volumen del compuesto, cuando el ingrediente
activo adopta la forma de un producto de fermentación primaria, tal como el produucto del Ejemplo 1
que se indica más adelante.

Los compuestos lı́quidos comprenden generalmente las mismas cantidades de ingrediente activo sus-
50 pendido en un diluyente lı́quido, tal como una mezcla de aceite mineral y agua (preferentemente con una
proporción 1:9).

Los compuestos de lı́quido rociable contedrán también un agente humectante (por ejemplo, 0,5 -
1,0%de wetanol de la firma Glycol Chemicals, Inc., New York, N.Y.), un agente emulsificante (por ejem-
55 plo, 0,1 - 0,5% de Tween 80 polisorbato de ICI Ameriocas, Wilington, DE) y un agente dispersante (por
ejemplo, 2 - 4% Blancol de la firma GAF, Chattanuga, Tenn., ó 3%Lomar - TW de Hopco Chemical Co.,
Newark, N.J.). El ingrediente activo se utilizará en forma de un polvo humectante que contiene el equi-
valente de 7 - 12 gramos de producto primario de fermentación/libra de peso seco y también conteniendo
una cantidad de carga adicional (tal como talco o silicato de aluminio hidratado, etc.) como agente de
60 cuerpo para mejorar las caracterı́sticas de suspensión de los compuestos sólidos.

La presente invención se describe de manera adicionnal a continuación mediante ejemplos particulares

11
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destinados a ilustrar la presente invención sin limitar la misma.

Ejemplo 1

5 Método de Fabricación de Esporas de Enfermedad Lechosa In Vitro.

Se dispusieron cultivos de inseminación viables de cepa NRRL - B 2309 B. popilliae sobre placas de
agar. la lı́nea celular se mantuvo en un medio J con un contenido de 1% de triptona (Difco), 0,5% de
extracto de levadura (Difco), 0,3% K2 HPO4 , 0,2%trehalosa y 1,5% de agar (Difco) en agua destilada. El
10 medio antes de la añadidura de trehalosa se sometió a autoclave a 120◦/15 psi durante 15 - 20 minutos.
El azúcar fué sometido a autoclave separadamente y luego añadido a los otros ingredientes sometidos a
autoclave. Se inocularon placas o tubos inclinados de cultivo B 2309 y se incubaron a 25◦C. Las células
fueron transferidas por lo menos semanalmente a un medio nuevo.

15 A partir de los cultivos de mantenimiento se prepararon cultivos sumergidos. En primer lugar se

preparó un medio lı́quido conteniendo 1,0% de almidón soluble; 0,1% de trehalosa (Kodak); 0,5% de ex-
tracto de levadura (Difco); 0,3% K2 HPO4 ; 0,1% CaCO3 (malla 400); y agua destilada (pH inicial 7,6). El
medio se sometió a autoclave a 12◦ C/15 psi durante 15 - 20 minutos. Se sometió a autoclave la trehalosa
separadamente con respecto a los dos componentes. No fué necesario ajustar el pH por añadidura de HCl.
20
Se inoculó asépticamente un frasco con agitador de 1 litro conteniendo 300 ml del medio lı́quido an-
terior con un cultivo iseminado mediante el cultivo de mantenimiento y luego se incubó en una tabla de
agitaciónn a 32◦ ± 1◦ C aproximadamente a 250 rpm durante 14 horas.

25 Cuando los contajes microscópicos alcanzaron aproximadamente 1 × 10◦ barras por ml, se añadió
3,3%de medio inoculante a 10 litros del medio anteriormente indicado. La incubación tuvo lugar a 32◦C
con mezcla mecánica a 250 rpm y aireación estéril za 0,2 volúmenes de aire por volumen de medio por
minuto (vvm). Después de 4 horas de cultivo se añadieron asépticamente 30 ml de antiespumante 5%
HODAG HD - 62 (sometido a autoclave a 120◦C/15 psi durante 15 - 20 minutos). El pH no se reguló
30 por añadidura de KOH ó HCl y disminuyó de 7,6 al inicio de la incubación a 6,25 al final de la fase de
crecimiento logarı́tmico.

La curva de crecimiento fué controlada microscópicamente cuando el número de células alcanzó 1,2 ×
109 barras/ml (aproximadamente a las 18 horas de post - inoculación) el pH aumentó a 6,8 por añadidura
35 estéril de KOH y se añadieron los coadyuvantes de esporulación.

Los coadyuvantes de esporulación se esterilizaron separadamente por acción de autoclave a 121◦ C (15
psi) durante 15 - 20 minutos y se añadieron asépticamente al fermentador con las proporciones siguientes:

40
1. MnSO4 en solución a 50 mg/ml de agua destilada; añadido con una proporciónn de 1 ml/l de
volumen de trabajo del fermentador.

2. Resina absorbente (amberlite XAD - 7), completamente lavada con metanol y agua destilada, se
45 añadió antes de someter a autoclave con una proporción de 3 gramos (peso de resina seca) por litro
de volumen de trabajo del fermentador hasta un contaje final de 30 g de resina en 300 ml de agua.

Las condiciones de la fase de esporulación son: temperatura - - 32 ± 1◦ C; mezcla mecánica - - 250

rpm; mezcla con aire estéril a 0,5 vvm., presión de 0,5 psig. No se ajustó el pH después de la añadidura
50 de los coadyuvantes elevándose lentamente en toda la fase de esporulación hasta un valor final de 8,0. Un
valor de pH de 8,2 es permisible pero es innecesario puesto que no es acompañado por una esporulación
máxima. El perı́odo de esporulación se completó aproximadamente en 20 horas desde la añadidura de
coadyuvantes de esporulación. La terminación de la esporulación (95%) se determinó al microscopio.
55 La recogida de las esporas después de la eliminación de la resina por filtrado tuvo lugar por centri-
fugación de alta velocidad, de paso continuo, para la eliminación de todos los componentes solubles del
medio consumido y producción de un producto de fermentación primario no higroscópico. Se añadió
silicato de aluminio hidratado al volumen de cultivo a una proporción de 5 gramos/litro, malla 400, antes
de la centrifugación. Este material ayudó en la separación de las esporas B 2309 juntamente con el carbo-
60 nato cálcico no disuelto y la resina del sobrenadante. La centrifugación tuvo lugar en una centrifugadora
de mesa Sharples Modelo N◦ T1 - P (fabricada por Penwalt Corp.)

12
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La pasta en pastillas es decir la mezcla de componentes esporas - talco - sólido, se suspendió nue-
vamente en trehalosa 0,1% y agua destilada (10 ml/gramo de la pastilla) y la suspensión se secó por
5 congelación. La pasta tenı́a un peso de 81,4 gramos y el rendimiento en peso seco de la mezcla de esporas
fué de 48,8 gramos. El rendimiento real de esporas a partir de 10,6 litros de medio de cultivo/esporulación
fué de 1,21 × 1013 esporas. Esto corresponde a un contenido de esporas de 95% basado en el número de
células al final de la fase de crecimiento. El producto de fermentación primaria preparado de este modo es
sometido a envejecimiento, puesto que la germinabilidad de las esporas recién hechas es substancialmente
10 menor que la de las esporas envejecidas y se constituye en un compuesto adecuado para aplicación en el
campo.

Ejemplo 2

15 Método de Producción de Esporas de Enfermedad Lechosa In Vitro

Se utilizó el procedimiento del Ejemplo 1 sin añadidura de resina como agente esporulante. La
utilización de resina se ha descubierto que mejora la proporción de esporulación en ciertas cepas, tales
como ATCC - 53258 y ATCC - 53259, pero no tenı́a efectos sensibles en la esporulación de ATCC - 53256.
20
Ejemplo 3

Bioensayo de Inyección

25 Los bioensayos de inyección fueron llevados a cabo de acuerdo con el procedimiento de Dutky y otros
descrito en la Patente USA N◦ 2.293.890 que se incorpora a la presente a tı́tulo de referencia.

Excepto en el caso en que se indica de otro modo en la siguiente Tabla I, se inyectaron 40 larvas por
prueba con una muestra de esporas reposadas procedentes de un cultivo lı́quido refrigerado o una mues-
30 tra obtenida de placas de hemolinfa para el material in vivo o se reconstituyeron preparados de esporas
secadas por congelación en agua destilada. El volumen de inyección fué de 0,003 ml por inyección y se
administró solamente una inyección a cada larva. La dosis en esporas por inyección y las cepas B.popilliae
utilizadas se indican en la siguiente Tabla I.

35 Después de la inyección, las larvas se monitorizaron dos veces a la semana para investigar sı́ntomas
de lechosidad. Las larvas que mostraban sı́ntomas de lechosidad se ensayaron mediante observación mi-
croscópica al igual que las larvas muertas. Al final de un perı́odo de siete semanas se sacrificaron las
larvas restantes y también se sometieron a ensayo.

40 Los resultados se indican en la siguiente Tabla I.

45

50
(Ver Tabla I en la página siguiente)

55

60

13
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TABLA I

5
Procedencia de Dosis Resultados %Infectividad
las esporas Esporas/Larva N◦ Lechosas/
Total Ensayos
10

in vivo 6.62 × 106 22/39a 56.41

(placa hemolinfa 6.62 × 105 32/40 80.00
esporas) 6.62 × 104 26/40 65.00
15 6.62 × 103 13/14 32.50

in vitro 1.02 × 106 6/39b 15.30

ATCC - 53256 1.02 × 105 5/40 12.50
20 1.02 × 104 4/40 10.00
1.02 × 103 1/40 2.50

in vitro 1.36 × 106 1/40 2.50

ATCC - 53259 1.36 × 105 4/40 10.00
25 1.36 × 104 3/39b 7,50
1.36 × 103 0/30 0.00

in vitro 9.10 × 106 0/40 0.00

30 ATCC - 53258 9.10 × 105 1/40 2.50
9.10 × 104 0/39 0.00
9.10 × 103 2/40 5.00
9.10 × 102 3/40 7.50
35
in vitro 1.91 × 106 0/40 0.00
NRRL B - 2519 1.91 × 105 0/40 0.00
1.91 × 104 0/40 0.00

40 in vitro 2.51 × 106 13/40 32.50

NRRL B - 3391 2.51 × 105 5/40 12.50
2.5 × 104 1/39b 2.56

45 in vitro 6.29 × 105 5/18a 27,78

NRRL B - 4154 6.29 × 104 1/18a 5.56
6.29 × 103 2/29a 7.00

Inyección H2 O 0 0/20 0.00

50
0 0/20 0.00

Sin inyección 0 0/40 0.00

0 1/20 5.00
55

Siendo:

a. - 1 ausente
60
b. - 1 adulto

c. - 1 pupa

14
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Ejemplo 4

5 Bioensayo de Inoculación de Suelo

Se llevaron a cabo bioensayos de inoculación de suelo realizados de acuerdo con el método desarrollado
por Dutcky y descrito en Schwartz, P.H. y otros 1970 J. invert. Pathol. 15; 126 - 128 (se incorpora a
tı́tulo de referencia), del modo siguiente: Se prepararon en primer lugar concentrados de esporas por
10 mezcla de las esporas con carbonato cálcico y con suelo que contenı́a raices de alfalfa germinada. Las
muestras de suelo se colocaron en bandejas de plástico cada una de las cuales contenı́a dos cucharadas
de suelo. El suelo fué humedecido con formaldehı́do (solución 40%USP) y diluı́do con agua a 1:1000. Se
añadió una larva a cada bandeja.

15 El suelo fué humedecido y la alfalfa germinada fué sustituı́da en caso necesario a lo largo de las
pruebas. Los resultados se indican en la siguiente Tabla II.

20

(Ver Tabla II en la página siguiente)

25

30

35

40

45

50

55

60

15
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TABLA II

5
procedencia proporción inocu - Resultados Infectividad
esporas lación/kg suelo N◦ Lechosas/ (%)
Total Ensayos

10
USDA - std 2.0 × 109 18/28a 64.29
(in vivo) 0,5 × 109 21/34a 61.76
1 × 108 esporas/g 2.0 × 109 12/26a 46.15
15 2.0 × 109 21/26a 00.77
0.5 × 109 19/31a 61.29
0.1 × 109 10/28a,b 35.71
2.0 × 109 17/31a 54.84
20
punta in vivo 2.0 × 109 23/25a 92.00

ATCC - 53258 2.0 × 1012 19/40 47.50

concentrado en 2.0 × 1010 8/27a 29.63
25 bruto 2.0 × 109 2/10a 20.00

ATCC - 53258 2.0 × 1012 25/32a 81.25

concentrado 2.0 × 1010 15/30a 50.00
30 2.0 × 109 2/35a 5.71

Formulación A 2.0 × 1010 10/26a 38.46

2.0 × 109 5/23a 21.74
2.0 × 1010 12/29a 41.38
35 2.0 × 109 6/32a 18.75

Formulación B 2.0 × 1010 27/34a 79.40

2.0 × 109 13/31a 41.90
40
Formulación C 2.0 × 1010 20/27a 74.07
2.0 × 109 12/25a 48.00

Formulación D 2.0 × 1010 19/28a 67.86

45
2.0 × 109 9/23a 39.13

ATCC - 53256 2.0 × 1012 10/36a 27.78

2.0 × 1010 20/37a 54.05
50 2.0 × 109 4/35a 11.43

ATCC - 53259 2.0 × 1010 14/31a 45.16

2.0 × 109 7/35a 20.00
55 2.0 × 108 2/39a 5.26

control 0.0 0/25a 00.00

0.0 0/19c 00.00
0.0 0/20 00.00
60
0.0 0/31a 00.00

(Ver continuación de la Tabla II en la página siguiente)

16
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Continuación de la Tabla II

5
procedencia proporción inocu - Resultados Infectividad
esporas lación/kg suelo N◦ Lechosas/ (%)
Total Ensayos
10

Formulación X1 2.0 × 109 4/30a 13.33

Formulación X2 4.0 × 109 7/36a 19.44
Formulación X3 8.0 × 109 13/34a 38.24
15
Formulación Y1 2.0 × 109 3/29a 10.34
Formulación Y2 4.0 × 109 5/29a 17.24
Formulación Y3 8.0 × 109 14/35a 40.00
20
Formulación Z1 2.0 × 109 5/28a 17.86
Formulación Z2 4.0 × 109 5/39a 12.82
Formulación Z3 8.0 × 109 15/34a 44.12
Formulación Z4 16.0 × 109 24/39a 61.54
25

Siendo:

a. - Resto de 40 descompuesto
30
b. - 1 adulto

c. - Resto de 20 descompuesto
35 Se utilizó la norma USDA para la inoculación a una concentración de 1 × 108 esporas por gramo.

El “punta in vivo” fué material in vivo obtenido a partir de una mezcla secada por congelación de
larvas infectadas y carbonato cálcico conteniendo 2,4 × 104 esporas por gramo.
40 El concentrado en bruto ATCC - 53258 fué un producto de fermentación primaria secado por conge-
lación preparado de acuerdo con la presente invención y conteniendo 0,825 × 1011 esporas/gramo.

El concentrado ATCC - 53258 fué una mezcla de concentrado en bruto ATCC (99,96% en peso) y
punta in vivo (0,04%) en peso.
45
La Formulación A consistió en un concentrado ATCC - 53258 diluı́do con silicato alumı́nico hidratado
hasta un contaje de 1 × 108 esporas por gramo.

La Formulación B fué la misma que la Formulación A excepto que contenı́a 99,2 en peso de concen-
50 trado en bruto ATCC - 53258 y 0,8% de punta in vivo. Esta formulación se diluyó a su vez con silicato
de aluminio hidratado hasta un contaje de 1 × 108 esporas por gramo.

La Formulación C fué la misma que la Formulación B excepto que contenı́a 99,6% de concentrado en
bruto ATCC - 53258 y 0,4% de punta in vivo. Se diluyó con silicato de aluminio hidratado hasta un
55
contaje de 1 × 108 esporas por gramo.

La Formulación D era la misma que la Formulación C excepto que contenı́a 99,8% de concentrado en
bruto ATCC - 53258 y 0,2% de punta in vivo diluı́da con silicato de aluminio hidratado hasta un contaje
de 1 × 108 esporas por gramo.
60
El ATCC - 53256 fué producto de fermentación primaria secada por congelación producida de acuerdo
con la presente invención y conteniendo 1,34 × 1011 esporas por gramo.

El ATCC - 53259 fué producto de fermentación primaria secado por congelación producido de acuerdo

17
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con la presente invención y conteniendo 1,53 × 1011 esporas por gramo.

5 Las Formulaciones X, Y y Z contenı́an diferentes cantidades de concentrado en bruto ATCC - 53258,

según norma USDA y uno o ambos de los ATCC - 53256 y ATCC - 53259 en las siguientes proporciones:

Porcentaje del Producto de Esporas (En Peso)

Concentrado en bruto
10

Formulación X USDA - std ATCC - 53258 ATCC - 53256 ATCC - 53259

15 X1 0.032 19.944 79.974 ---

X2 0.018 11.109 88.873 ---
X3 0.009 5.882 94.109 ---

20
Formulación Y

25
Y1 0.032 19.994 --- 79.974
Y2 0.018 11.109 --- 88.873
Y3 0.009 5.882 --- 94.109

30 Formulación Z

Z1 0.032 19.994 39.987 39.987

35 Z2 0.018 11.108 44.437 44.437
Z3 0.008 5.882 47.055 47.055
Z4 0.005 3.030 48.482 48.482

40
Si bien la presente invención ha sido descrita anteriormente haciendo referencia a una realización pre-
ferente, los técnicos en la materia comprenderán fácilmente que se pueden introducir muchas adiciones,
supresiones o modificaciones dentro del campo de la presente invención y de las reivindicaciones siguientes.

Todo cuanto no afecte, altere, cambie o modifique la esencia del método descrito, será variable a los
45
efectos de la actual Patente.

50

55

60

18
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REIVINDICACIONES

5
1. Método para la producción de esporas de bacilos de la enfermedad lechosa in vitro que comprende:

Cultivo de células vegetativas de dicho bacilo en un medio lı́quido el cual comprende:

desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 2,0% de almidón soluble;

10
desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 0,2% de trehalosa;

desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 1,5% de extracto de levadura;

15
desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 0,6% K2 HPO4 ;

desde aproximadamente 0,0 hasta aproximadamente 0,3% CaCO3 ; y en condiciones aeróbicas con pH
controlado; y

20
añadiendo, en forma de coadyuvante de esporulación desde aproximadamente 5 hasta aproximada-
mente 250 mg/lb de sulfato de manganeso al final de la fase de crecimiento vegetativo e incubando dicho
cultivo hasta que tiene lugar la esporulación.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende la añadidura de una resina adsorbente asimismo

25
como coadyuvantes de esporulación en el que dicha resina se selecciona del grupo que consiste en Amber-
lite IR - 120, Dowex 50 WX4, Amberlite IRA - 410, Amberlite IR - 45 y Diaion HP - 10, en cantidades
comprendidas entre aproximadamente 1 y 15 mg/lt.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho bacilo es B. popilliae y dicho medio lı́quido

30
comprende: 1.0% de almidón soluble; 0,1% de trehalosa; 0,5% de extracto de levadura; 0,3% K2 HPO4 ; y
0,2%de CaCO3 en peso; comprendiendo dicho coadyuvante de esporulación 50 mg/l MnSO4 .

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicho coadyuvante de esporulación comprende además

3 g/l de resina adsorbente.
35
5. Procedimiento in vitro para la producción de esporas B. popilliae hasta un grado mı́nimo de
aproximadamente 80% de las células presentes en el cultivo, comprendiendo:
proporcionar cultivos de inseminación de dicho bacilo;
40 constituir un inoculante a partir de dichos cultivos por transferencia aséptica de células vegetativas
de dicho bacilo a un medio de cultivo lı́quido;
inoculación aséptica con dicho inoculante de un medio esterilizado previamente que comprende
aproximadamente 0,1 - 2,0% de almidón soluble; aproximadamente 0,1 - 2,0% de nutriente de
45 azúcar soluble; aproximadamente 0,5 - 1,5% de extracto de levaduura; aproximadamente 0,1 - 0,6%
K2 HPO4 ; aproximadamente 0,0 - 0,3% CaCO3 ; y agua destilada y teniendo un pH comprendido
aproximadamente entre 6,8 y 8,1;
fermentar dicho medio de inoculación en un fermentador aproximadamente a 32 ± 1◦ C, 0,5 psig
con un pH comprendido entre 7,2 y 7,4 aproximadamente, bajo mezcla mecánica y suministro de
50 aire estéril aproximadamente a 0,2 - 0,5 vvm hasta que la densidad de células de dichas células
vegetativas alcanza aproximadamente 1 × 109 barras/ml;
añadidura aséptica de un coadyuvante de esporulación esterilizado a dicho cultivo fermentado de
células vegetativas, comprendiendo dicho coadyuvante por lo menos uno de los siguientes productos:
55 solución de MnSO4 en agua destilada hasta una concentración final aproximada de 0,5 - 250 mg/l
y una resina adsorbente de intercambio iónico en una proporción de 1 - 15 g/l en base al peso seco;
y
incubando dicho cultivo aproximadamente a 32 ± 1◦ C, 0,5 psig, con mezcla mecánica, en presencia
60 de aireación estéril aproximadamente de 0,5 vvm y con un pH aproximadamente igual o superior a
6,8 durante el tiempo suficiente para completar la esporulación.
6. El método de la reivindicación 5, en el que dicha resina se selecciona del grupo que comprende
Amberlite IR - 120, Dowex 50 WX4, Amberlite IRA - 410, Amberlite IR - 45 y Diaion HP - 10.

19
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7. El método de la reivindicación 5, en el que dicho medio comprende; 1,0% almidón soluble; 0,1%tre-
halosa; 0,5% extracto de almidón;: 0,3% K2 HPO4 y 0,2% CaCo3 en peso; y dicho coadyuvante de
5 esporulación comprende por lo menos uno de los productos siguientes: 50 mg/l MnSO4 y 3g/l resina
adsorbente Amberlite XAD - 7.

8. El método de las reivindicaciones 1 - 7, para la preparación de compuestos insecticidas a utilizar

en el control de escarábidos, que comprende la preparación de esporas libres de esporangio de patógenos
10 de la enfermedad lechosa procediendo según las reivindicaciones anteriores y mezclando dichas esporas
con un portador o diluyente y opcionalmente con esporas que llevan esporangio, de tipo convencional, de
manera que el compuesto tenga una cantidad efectiva de esporas.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dichas esporas son esporas de B. popilliae.

15
10. El método de la reivindicación 8, en el que dicho portador es seleccionado del grupo que comprende
talco, calcio, carbonato, silicato de aluminio hidratado, caolı́n, tusa de maiz, vermiculita y mezclas de los
mismos.

20 11. El método de la reivindicación 8 en el que dichas esporas libres de esporangios están constituı́das
por una mezcla de, como mı́nimo, dos cepas de la misma especie de dicho patógeno.

12. El método de la reivindicación 8, que comprende el ajuste de las proporciones de dichas esporas
libres de esporangios y portadoras de esporangios, de manera que la cantidad de esporas libres de espo-
25 rangios contribuirá por lo menos substancialmente a la infectividad por via oral de dicho compuesto.

13. El método de la reivindicación 8, en el que dichas esporas libres de esporangios se encuentran

presentes en aproximadamente 6 - 18 veces la cantidad que se habrı́a añadido si se hubieran utilizado
solamente esporas libres de esporangios.
30
14. El método de la reivindicación 12, en el que las esporas libres de esporangios comprenden por lo
menos 99,99% del contenido total de esporas de dicho compuesto.

15. El método de la reivindicación 8, en el que dicha cantidad efectiva es suficiente para conseguir
35 por lo menos 50% de la infectividad, medida por dicho bioensayo de inoculación.

16. El método de la reivindicación 8, en el que dichas esporas libres de esporangios son una mezcla
de cepas ATCC - 53259 y ATCC - 53256.

40 17. El método de la reivindicación 8, en el que dichas esporas libres de esporangios son una mezcla de
3,9% de ATCC - 53258 y el resto de dichas esporas libres de esporangios está constiuı́do por una mezcla
al 50% de ATCC - 53259 y ATCC - 53256.

45

50

55

60

20
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21
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