Aporte nutricional de las macromoléculas
OBJETIVOS
 Determinar experimentalmente el punto isoeléctrico de la caseína.
 Observar el perfil de proteínas de las diferentes fracciones obtenidas durante un procedimiento para la purificación de
caseína en geles de electroforesis SDS-PAGE y determinar la concentración de proteína en la leche.
 Cuantificar el nitrógeno total presente en la caseína purificada.
INTRODUCCIÓN
La nutrición es la toma y uso de alimentos por un
organismo. Este es el proceso por el cual, los seres
vivientes obtienen energía de los alimentos y bebidas con
el propósito de crecer y mantenerse. La nutrición es
interpretada como un estudio de los procesos orgánicos
por los cuales un organismo asimila y usa los alimentos
para el funcionamiento normal, crecimiento y
mantenimiento. La nutrición es un proceso de tres partes:
la primera, consumo de comidas y bebidas, la segunda el
rompimiento de esos alimentos o bebidas en nutrientes y
la tercera, el viaje de esos nutrientes a través del torrente
sanguíneo a diferentes partes del cuerpo para ser usados
como “combustible” y para otros propósitos. Para un
organismo obtener una adecuada nutrición, éste debe
comer y beber comidas que contengan nutrientes claves.
Los alimentos pueden ser clasificados con base en su
valor nutritivo, este viene dado por la cantidad de
nutrientes que aportan a un organismo cuando son
consumidos. Estos nutrientes pueden ser lípidos, glúcidos,
proteínas, vitaminas y minerales. El valor nutritivo es
diferente en cada grupo de alimentos, algunos alimentos
poseen más o menos nutrientes que otros. Es por eso, que
para clasificarlos se debe tomar en cuenta el nutriente que
más abunda en su composición.
Los alimentos también cumplen distintas funciones en el
organismo. De acuerdo a su función los alimentos se
clasifican en:
 Energéticos: Estos alimentos son los glúcidos y los
lípidos
 Reparadores: Los alimentos más importantes de este
grupo son las proteínas
 Reguladores: Estos alimentos contienen sustancias
que utiliza el organismo en cantidades muy pequeñas
para asimilar correctamente los alimentos y así
contribuir a coordinar el funcionamiento del cuerpo.
Se considera que estos alimentos no aportan calorías
al organismo. En este grupo se encuentran las
vitaminas; también se incluyen los minerales y el agua
Uno de los alimentos más importantes que deben estar en
la dieta de un organismo como el ser humano es la leche
que contiene macromoléculas como los glúcidos y los
lípidos que la hacen ser un alimento energético,
adicionalmente cuenta con una cantidad considerable de
proteínas formando parte de los alimentos reparadores.
Se entiende como leche al producto integral del ordeño
total e ininterrumpido, en condiciones de higiene que da la
vaca lechera en buen estado de salud y alimentación. Esto
además, sin aditivos de ninguna especie. Agregado a esto,
se considera leche, a la que se obtiene fuera del período
de parto. La leche de los 10 días anteriores y posteriores
al parto no es leche apta para consumo humano. Siempre
el ordeñe debe ser total, de lo contrario al quedar leche en
la ubre, la composición química de esta cambiará.
Leche fluida entera
Leche a granel higienizada, enfriada y mantenida a 5°C,
sometida opcionalmente a terminación, pasteurización y/o
estandarización de materia grasa, transportada en
volúmenes de una industria láctea a otra para ser
procesada y envasada bajo normas de higiene.
La leche fluida entera puede ser sometida a
procedimientos de higienización por calor. Procesos de
ultra alta temperatura (UAT ó UHT), que consisten en
llevar la leche homogenizada a temperaturas de 130°C a
150°C durante 2 a 4 segundos, permiten higienizarla de
forma apropiada y de manera que estas puedan llegar en
forma segura al consumidor. Las leches pueden ser
modificadas en su contenido graso.
La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina,
riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K),
minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en
pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo todos los
aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos.
Los únicos elementos importantes de los que carece la
leche son el hierro y la vitamina C.
Las proteínas se pueden clasificar de manera general en
proteínas globulares y fibrosas. Las proteínas globulares
son aquellas que tienden a agregarse en formas
esferoidales y no establecen interacciones
intermoleculares como son los puentes de hidrógeno
(característicos de las proteínas fibrosas) siendo
solubilizadas en suspensiones coloidales. En la leche hay
tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto
globulinas (todas globulares).
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo
fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y
forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo
de proteínas que están químicamente unidas a una
sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la
mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos
hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína
en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato
cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de
las proteínas presentes en la leche y el 2.7% en
composición de la leche líquida.
La caseína está formada por alpha(α1), alpha(α2)–
caseína, β–caseína, y kappa–caseína formando una
micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son
solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la
kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas
por separado se forma un complejo de caseína que es
solubilizado en forma de micela. Esta micela está
estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y
beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de
iones calcio.
La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos
fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella.
También tiene todos sus residuos de serina y treonina con
sus correspondientes grupos hidroxilo, así como los
carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie
por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en agua
gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de
su superficie se une fácilmente a las alfa y beta caseína
insolubles, lo que da lugar a la formación de la micela.
La propiedad característica de la caseína es su baja
solubilidad a pH 4.6. El pH de la leche es 6.6
aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada
negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se
añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie
de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan)
y la proteína neutra precipita.
La conformación de la caseína es similar a las proteínas
desnaturalizadas globulares. El alto número de residuos
de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en
la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte
y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene
puentes disulfuro. De igual manera la falta de estructura
secundaria es importante para la estabilidad de la caseína
frente a la desnaturalización por calor. La carencia de
estructura terciaria facilita la situación al exterior de los
residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre
unidades proteicas y la convierte en prácticamente
insoluble en agua. En cambio es fácilmente dispersable en
álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato
sódico y acetato sódico.
La función biológica de las micelas de caseína es
transportar grandes cantidades de Ca y P altamente
insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un
coagulo en el estomago para favorecer una nutrición
eficiente. Además de caseína, Ca y P la micela formada
también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas
plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6 – 12%
del volumen total de la leche.
Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante cuando
se precipita la caseína en medio ácido son proteínas
globulares, hidrofílicas y fácilmente solubles en agua así
como susceptibles de desnaturalización por calor. Las
principales son β–lactoglobulina, α-lactalbumina, bovine
serum albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig).
La caseína se emplea en la industria para la fabricación de
pinturas especiales y en el apresto de tejidos, la
clarificación de vinos, la elaboración de preparados
farmacéuticos y la fabricación de plásticos. La pintura de
caseína ha sido usada desde la antigüedad por los
egipcios.
Punto isoeléctrico
Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una
carga cuando se dispersan en agua. Una característica de
las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que
adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta
dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y
de los aminoácidos que la componen, así como de las
cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la
proteína de forma covalente (irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína,
los radicales libres pueden existir en tres formas
dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y
aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta
positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente
ácido debido a que los grupos COOH de los aminoacidos
aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los
grupos amino de arginina y lisina estarían protonados (–
NH3+).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con
un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en
este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados
(COO–) y los grupos amino estarían en su forma neutra
(NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH
característico al cual su carga neta es cero. A este pH se
le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico
(pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y
negativas por lo que la proteína presenta su máxima
posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad
y facilitar su agregación.
Si suponemos una proteína formada únicamente por
aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga neta
de la proteína dependería exclusivamente de la
protonación/desprotonación de los grupos amino y
carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están
formadas por multitud de aminoacidos unidos mediante
enlaces peptídicos y la carga va a depender de los grupos
ionizables que poseen los aminoacidos que la componen
y del pH del medio.
Determinación colorimétrica del contenido de
proteínas en leche de vaca
Con frecuencia se nos presenta el problema de tener que
analizar proteína en una muestra de alimento, como puede
ser la leche de vaca entera. En este tipo de casos es
bueno saber el contenido aproximado de proteína de la
muestra (en el caso de la leche de vaca está en torno al 2-
3% p/v) para hacer las diluciones pertinentes que nos
permitan encajar la muestra en la recta patrón. Lo que se
pide en este caso es que el alumno haga precisamente
eso y obtenga un valor exacto del contenido proteico de
una muestra de leche de vaca.
Electroforésis
La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de
poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis en
poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis)
es sin duda alguna una de las técnicas más ampliamente
usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas.
La electroforesis en poliacrilamida es un método
conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues
se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de
proteína.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se
encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de
su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de
desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La
velocidad de migración es proporcional a la relación entre
las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga
por unidad de masa más rápida será la migración.
Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y
aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a
los electrodos se pueden determinar diferencias de carga
neta (carga total/masa) entre proteínas. Este método se
denomina electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida
no es un buen soporte para este método pues la migración
de las proteínas en su seno no sólo es proporcional a la
carga neta sino también al tamaño y forma de las
proteínas.
Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es
que son químicamente inertes, transparentes y estables
en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica.
Algunas características destacables de la electroforesis en
geles de poliacrilamida son:
Los geles de poliacrilamida se forman por la
polimerización de la acrilamida por acción de un agente
entrecruzador (cross – linking), la bis-acrilamida en
presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador
se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y
como catalizador el ión persulfato (S2O8 –) que se añade
en forma de persulfato amónico. En algunas situaciones,
como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la
presencia de persulfato puede interferir con la
electroforesis se emplean riboflavina y TEMED.
Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el
oxígeno es un inhibidor de la polimerización. Además,
durante la polimerización se libera calor que podría
provocar la formación de burbujas en el seno del gel. La
velocidad de polimerización viene determinada por la
concentración de persulfato (catalizador) y TEMED
(iniciador).
La porosidad del gel la determina las proporciones
relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo menor
el poro cuanta más bisacrilamida vs acrilamida se use.
El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina
el rango de separación del gel. Habitualmente los geles se
denominan en función del % de acrilamida/bisacrilamida
que contienen. Así, la mayoría de las proteínas se separan
bien en el rango 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor
tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran
tamaño.
En función del estado de las proteínas (nativo o
desnaturalizado) a lo largo del proceso electroforético
éstas se clasifican en electroforesis nativas o
desnaturalizantes.
Una electroforesis desnaturalizante, la más común, es la
que somete a las proteínas a migración asegurando la
completa desnaturalización (pérdida de la estructura
tridimensional). En esta situación la migración es
proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no
a su forma. El agente desnaturalizante más empleado es
el sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.
Una electroforesis nativa es la que somete a las proteínas
a migración sin desnaturalización. En esta situación las
proteínas migran en función de su carga, de su tamaño y
de su forma. Además se mantienen en ciertos casos las
interacciones entre subunidades y entre proteínas,
separándose los complejos. Los sistemas tampón
empleados en estos caso son: tris-glicina (rango de pH 8.3
a 9.5), tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-acetato
(rango de pH 7.2 a 8.5).
Método de determinación de nitrógeno mediante el
método kjeldhal
Este método, diseñado para la determinación de nitrógeno
total. Para la determinación de nitrógeno presente en la
muestra, es necesario realizar la digestión del compuesto
hasta CO2 e iones NH4+, por tratamiento en caliente con
ácido sulfúrico concentrado en presencia de mezcla
catalizadora. Si se trata de determinar el nitrógeno de
compuestos que contengan grupos N-N, NO y NO2,
previamente debe practicarse tratamiento con agentes
reductores para convertirlos en grupos amino.
La concentración de amonio producido se determina
agregando un exceso de álcali a la solución, con lo cual se
desplazan los iones de bisulfato amónico a la forma de
hidróxido de amonio. Estos últimos son arrastrados por
destilación con vapor de agua en un sistema cerrado y
absorbidos en una solución de ácido bórico. El borato
ácido de amonio producido se titula con solución de ácido
fuerte de concentración conocida (HCl).
El método de Kjeldahl se recomienda para determinar
nitrógeno en mezclas crudas y relativamente grandes,
pero no es aconsejable aplicarlo a gran número de
muestras puras, ya que el método en general es
dispendioso y consumidor de tiempo. El método utilizado
se ha ajustado a la técnica micro. Las reacciones que
ocurren durante todo el proceso son:
a. DIGESTION.
𝑪𝒂𝒕𝒂𝒍𝒊𝒛𝒂𝒅𝒐𝒓
𝑪𝒂𝒍𝒐𝒓
𝑵 − 𝒐𝒓𝒈𝒂𝒏𝒊𝒄𝒐 + 𝑯𝟐 𝑺𝑶𝟒 → 𝑵𝑯𝟒 𝑯𝑺𝑶𝟒 + 𝑪𝑶𝟐 + 𝑺𝑶𝟐
+ 𝑺𝑶𝟑
b. DESTILACION.
𝑵𝑯𝟒 𝑯𝑺𝑶𝟒 + 𝑵𝒂𝑶𝑯 → 𝑵𝑯𝟒 𝑶𝑯 + 𝑵𝒂𝑯𝑺𝑶𝟒
c. ABSORCION.
𝑁𝐻4 𝑂𝐻 + 𝐻3 𝐵𝑂3 → 𝑁𝐻4 𝐻2 𝐵𝑂3 + 𝐻2 𝑂
d. TITULACION.
𝑁𝐻4 𝐻2 𝐵𝑂3 + 𝐻𝐶𝑙 → 𝑁𝐻4 𝐶𝑙 + 𝐻3 𝐵𝑂3
MATERIALES Y REACTIVOS
Los siguientes materiales y reactivos son de uso general:
 Soluciones buffer pH 4.0 y 7.0 para calibrar el
potenciómetro
 Potenciómetro
 Espectrofotómetro Lavar el precipitado con 20mL de etanol y centrifugar
 3 Leches de diversas marcas (1 litro) nuevamente.
 Cámara de electroforesis
 Fuente de poder Retirar el sobrenadante (guardar una parte de este
 Reactivo de Biuret sobrenadante como solución B) y a continuación adicionar
 Patrón de albúmina de huevo 0.02 mg/ml 10 mL de éter etílico y centrifugar.
 Un juego de micropipetas
 Equipo Kjeldahl Al finalizar queda un precipitado blanco de fácil
 Manto calefactor manipulación, el cual es la caseína.

Preparación de solución de caseína

MATERIAL
REACTIVOS Colocar aproximadamente 250mg de caseína en un vaso
CANTIDAD TIPO de precipitado de 50mL. Agregar 20mL de agua destilada
Vaso de precipitado y 5mL de NaOH 1N, agitar hasta completar la disolución
10 Agua destilada
de 25 ml total de la caseína.
Vaso de precipitado
2 Acetato de sodio 0.1 N
de 50 ml Una vez disuelta la caseína se vierte a un matraz aforado
vaso de precipitado de 50mL, adicionar 5mL de ácido acético 1N y diluir con
1 Ácido acético 0.01 N
de 250ml agua destilada hasta 50mL. La solución debe ser clara y
10 tubos de ensayo Ácido acético 0.1 N limpia.
1 Probeta de 50ml Ácido acético 1.0 N
Matraz aforado de 50 Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína
1 NaOH 1N
ml Colocar en 10 vasos limpios y secos los siguientes
pipeta graduada de volúmenes de los reactivos:
1 Éter etílico
5.0 ml
pipeta graduada de Acetato Ácido
Ácido pH
1 Etanol al 70% acético resultante
1.0 ml Tubo de sodio acético
0,01N aproximado
pipeta graduada de 0,1N (ml) 0,1N (ml)
(ml)
1
10.0 ml 1 0,5 9,5 - 3,2
Embudo de vidrio 2 1,0 9,0 - 3,6
1
mediano 3 1,5 8,5 - 3,8
1 Termómetro 4 2,0 8,0 - 4,0
Papel de filtro 5 3,0 7,0 - 4,2
6 4,0 6,0 - 4,5
Nota: Las soluciones que se requieren para la 7 6,0 4,0 - 4,7
electroforesis se adjuntan en el Anexo 1, estas soluciones
8 8,0 2,0 - 5,1
ya han sido previamente preparadas para la práctica en el
9 6,0 - 4,0 5,5
laboratorio
10 8,0 - 2,0 6,1
Tabla 1: Volúmenes a utilizar de cada uno de los reactivos para
determinación del pI
PROCEDIMIENTO
Aislamiento de caseína Medir los pH de los vasos, los cuales debían cubrir un
Calentar en un vaso de precipitado 100mL de agua rango aproximado entre 3,0 y 6,5. Anotar los valores, que
destilada a 38°C, añadir 50mL de leche. Luego agregar deben ser semejantes a los expresados anteriormente.
gota a gota con bureta y con agitación ácido acético 1N,
hasta que se observe un precipitado, es decir, la leche se Añadir 1mL de la solución de caseína a cada vaso. (Para
corte. esto usted gastara 10ml de la solución de caseína). La
fracción sobrante, se debe guardar como solución C.
Precipitar, centrifugar y guardar el sobrenadante para
utilizar en procedimiento de electroforesis (solución A).
Agitar suavemente y esperar aproximadamente 3 minutos,
luego medir la absorbancia de cada muestra a 640nm con
cubetas de colorimetría de 1cm de paso óptico. Anotar los
resultados a fin de representar la absorbancia frente al pH
y determinar el pI aproximado de la caseína.
Cuantificación de proteínas de la leche
Preparar las siguientes reacciones en 10 tubos de ensayo:
Muestra de
de proteínas sometidas a electroforesis por tanto lo
atraviesan con relativa rapidez.
Una vez preparado y polimerizado el gel de corrida, se
prepara, en la parte superior de este el gel concentrador.
Bajo la acción del campo eléctrico, la mezcla proteica,
colocada sobre el gel de apilamiento o concentrador,
comienza a migrar hacia el polo positivo.
Cuando las proteínas atraviesan el gel concentrador, se
encuentran con la resistencia ejercida por el gel de corrida

Reactivo de
Albumina en

leche (ml)

Biuret (ml)
Agua (ml)

problema
1mg/ml (ml)

solución
de manera que aquellas proteínas retardadas puedan
solución
Tubo

(ml)
alcanzar al resto y todas inicien la separación desde el
mismo punto, mejorando así la calidad de la corrida. El gel
concentrador se prepara siempre a una concentración de
B 1,8 - - - 1,2 acrilamida 4%, mientras que el gel de separación o gel de
1 1,6 0,2 - - 1,2 corrida se prepara según el rango óptimo de resolución:
2 1,4 0,4 - - 1,2
3 1,2 0,6 - - 1,2 Gel de corrida
4 1,0 0,8 - - 1,2 Ensamblar, según instrucciones, el cassette que consta de
5 0,8 1,0 - - 1,2 soportes, vidrios y separadores. Preparar el gel de corrida.
Leche 1,6 - 0,01 - 1,2 El volumen del gel de corrida deberá calcularse
Sln A - - - 1,8 1,2 dependiendo del grosor del gel. Por lo general se preparan
Sln C - - - 1,8 1,2 10ml de acrilamida 10% así:
Tabla 2: Volúmenes a utilizar de cada una de las soluciones en la
cuantificación de proteínas
Solución Volumen
Agua destilada 4mL
Agitar suavemente y esperar 15min a que se desarrolle el
Acrilamida-bisacrilamida 30% 3.3mL
color en la oscuridad y medir la absorbancia de cada tubo
Tris/HCl 1.5 M pH 8.8 2.5mL
a 550nm.
SDS 10% 100µL
Persulfato de amonio 10% 100µL
TEMED 4µL
Tabla 3: Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del
gel de corrida

Electroforesis de las proteínas de la leche
Geles de corrida y concentración
La técnica de separación comúnmente utilizada se
denomina electroforesis discontinua. En esta se preparan
2 geles, el de corrida, donde se separan las proteína y el
de apilamiento o concentrado, que como su nombre lo
indica, concentra la mezcla.
El gel de corrida que separará las muestras debe tener
mayor concentración de Acrilamida (10%) y pH más
básico (8.3) de manera que ofrezca mayor resistencia en
la corrida a los polipéptidos.
El gel de apilamiento posee baja concentración de
acrilamida (4%) en tampón ligeramente ácido (Tris/HCl 1M
pH 6.8), de forma que ofrezca poca resistencia a la mezcla
Verter cuidadosamente la solución de acrilamida con una
pipeta Pasteur en el contenedor representado por 2 vidrios
sujetos al cassette y distanciados por unos separadores.
Dejar aproximadamente 1,5cm de distancia entre la
solución de acrilamida y el vidrio frontal.
Luego de añadido el gel de corrida y previo a la
polimerización, añadir suavemente agua destilada para
evitar que el borde del gel polimerice de manera irregular.
Esperar unos 15min para una polimerización total del gel.
Gel concentrador o de apilamiento
Luego de polimerizado el gel de corrida, descargar el agua
de la superficie del mismo y preparar 4ml del gel de
apilamiento (4%) según se muestra a continuación:
 Solución Volumen en una solución colorante (1g de azul de Coomassie,
Agua destilada 2.7mL 459ml de metanol, 450ml de agua destilada y 100ml de
Acrilamida-bisacrilamida 30% 0.67mL ácido acético glacial) por 3 horas. Transcurrido el tiempo,
Tris/HCl 1M pH 6.8 0.5mL sumergir el gel en una solución decolorante (100ml
SDS 10% 40µL metanol, 100ml de ácido acético glacial, 800ml de agua
Persulfato de amonio 10% 40µL destilada) o en agua en ebullición durante 10 minutos para
TEMED 4µL eliminar las asociaciones inespecíficas del gel al colorante.
Tabla 4: Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del Observar las bandas proteicas.
gel de apilamiento
Análisis del gel de electroforesis (se realiza en la
Verter suavemente el contenido del gel de apilamiento tercera sesión).
sobre el gel de corrida polimerizado y colocar el peine
cuidadosamente para que no se formen burbujas. Esperar Ya desteñido el gel realizar la gráfica log PM vs distancia
unos 10min hasta que polimerice la acrilamida. recorrida del marcador de peso molecular para determinar
el peso molecular de las bandas de las muestras
Colocación de las muestras problema.
Cuando el gel concentrador o de apilamiento haya
polimerizado, colocar el cassette en el tanque de Determinación de nitrógeno total
electroforésis con aproximadamente 500mL del buffer de
corrida en el cual se encuentran los electrodos Digestión (se realiza uno o dos días antes de la
sumergidos. Quitar cuidadosamente el peine para que titulación junto con la destilación y absorción)
quedaran libres los pozos del gel. Se colocaron En un balón de digestión coloque en su orden lo siguiente:
cuidadosamente las muestras con una micropipeta.
Muestra exactamente 0.5 g de caseína
Muestras: pesada: seca
 Leche diluída 2µL (De una dilución previamente Mezcla catalizadora: 0.15 g de dióxido de
realizada de 10 µL de leche y 90 µL de agua). titanio, 0.15 g de
Buffer de carga de muestra 18µL sulfato de cobre y
 Solución A 10µL 5.2 g de sulfato de
Buffer de carga 10µL potasio.
 Solución B 10µL H2SO4 Concentrado:
Buffer de carga 10µL
Lleve los balones al digestor.
 Solución C 10µL
Caliente al principio suavemente aproximadamente
Buffer de carga 10µL durante unos 10 minutos con el fin de eliminar por
. evaporación la mayor parte de la humedad que acompaña
la muestra. Suba gradualmente el calor hasta una
Someterlas a ebullición (92°C) por 3 minutos e temperatura tal que los vapores de SO3 (vapores irritantes
inmediatamente sacarlas a hielo, luego sembrar 20µL de producidos por descomposición del H2SO4) no alcancen
las muestra en los pozos de los geles de la electroforesis. sino la mitad del cuello del balón de digestión.
Incluir un estándar de peso molecular en uno de los pozos Mantenga estas condiciones, hasta obtener una solución
(5µL). de color verde esmeralda.
Deje enfriar los balones.
Someter las muestras a electroforesis aplicando una
corriente de 30mA por gel y observar la corrida por 40 Destilación y Absorción
minutos. Colocar en el equipo de destilación el tubo de digestión
con la muestra. Programe el equipo para realizar una
Finalizada la corrida extraer los vidrios del cassette destilación con los siguientes parámetros:
cuidadosamente y separarlos de manera tal que el gel
quedara posado sobre uno de los vidrios. Sumergir el gel Agua: 50 ml
Ácido bórico: 75 ml al 2%
NaOH: 80 ml al 32% o una densidad de 1.34
Tiempo de destilación: 5 min
Iniciar la destilación automática.
Titulación (se realiza en la tercera sesión)
Titule con HCl de concentración conocida (depende de la
muestra cuando con 0.1 N se consumen más de 10 ml en
la titulación, este se puede remplazar por una solución de
titulación de 0.5 a 1 N), con indicador de Taschiro hasta
que produzca un viraje de color o hasta obtener
nuevamente el valor inicial del pH del ácido bórico (pH: 4.3
a 4.5).
Registrar el volumen y concentración de ácido gastado en
la valoración para cada una de las muestras trabajadas.
Resultado a reportar y analizar: contenido de nitrógeno por
gramo de composición de caseína.
Nota: Para la tercera sesión de laboratorio llevar
computador pues se mostraran bases de datos
disponibles en internet de proteínas y herramientas de
análisis.
CUESTIONARIO (para incluir como resultados y/o
discusión de resultados en el informe)
1. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia para
la determinación del punto isoeléctrico de la caseína?
2. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína?
Determínelo con los datos de su experimento y
compárelo con el obtenido por bioinformática.
3. ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el
pI?
4. ¿Cuál es el peso aproximado de las proteínas de la
caseína?
5. ¿Cuál es la concentración de la solución de caseína?
6. ¿A qué se debe la diferencia del pH teórico de las
soluciones preparadas para la determinación del
punto isoeléctrico y el pH medido experimentalmente?
BIBLIOGRAFÍA
Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de
Laboratorio. Limusa Wiley, México
Bollag D.M., Edelstein S.J., (1.994) “Protein methods”.
WileyLiss Publications. USA. 229 pp
Cooper T. (1.984) “Instrumentos y Técnicas Bioquímicas”.
Editorial Reverté. España. 442p
A.O.A.C. Official Methods of Analysis 13 th Edition, 1984.
FAO Food and Nutrition Paper 14/7 Roma, 1986
Bernal de Ramírez,I. 1993. Análisis de alimentos,
Academia Colombiana de ciencias exactas, físicas y
naturales Colección Julio Carrizosa Valenzuela, No 2.
Bogotá
ANEXO
1. Tris/HCl 1,5M pH 8.8, 100 ml:
Pesar 18,15 g de Tris, disolver el Tris en 50ml de agua
destilada, añadir gota a gota HCl concentrado hasta que
el pH baje a 8.8, completar con agua destilada hasta el
volumen final (100ml)
2. Tris/HCl 1 M pH 6.8, 100ml:
Pesar 12,1 g de Tris, disolver el Tris en 50ml de agua
destilada, añadir gota a gota HCl concentrado hasta que
el pH baje a 6.8, completar con agua destilada hasta el
volumen final (100ml)
3. SDS 10% (p/v), 100ml:
Pesar 10 g de SDS, añadir agua destilada hasta completar
el volumen de 100ml, información de seguridad: El SDS
es un polvo fino neurotóxico, por lo tanto se debe usar
máscara, guantes y lentes de protección para su
manipulación.
4. Glicerol 50% (v/v), 100 ml:
Tomar un volumen de 50ml de glicerol al 100%, añadir
50ml de agua destilada
5. Azul de Bromofenol 1% (p/v), 10ml:
Pesar 100mg de azul de bromofenol, completar con agua
destilada hasta 10ml y mezclar hasta disolver, filtrar la
solución en papel Whatman No 1 (o cualquier papel de
filtro) para eliminar el colorante no disuelto
6. Acrilamida 30% (100ml):
La solución de acrilamida al 30% (p/v) es una mezcla de
acrilamida (29,2g) y Bisacrilamida (0,8g), pesar ambos
reactivos y añadir agua destilada hasta 100ml, filtrar en
papel de filtro Whatman No.1
Información de seguridad: La acrilamida en polvo y en
solución es neurotóxica, por lo tanto se debe usar
máscara, guantes y lentes de protección para su
manipulación.

7. Persulfato de amonio al 10% (p/v), 5 ml:

Pesar 0,5g de persulfato de amonio, disolver en 5ml de
agua destilada

8. Solución Tampón de corrida, 1 L:

Pesar 3 g de Tris (25mM), pesar 14,4g de glicina (192mM),
pesar 1g de SDS (0,1%), añadir agua destilada hasta
completar 1 litro

NOTA: El pH debería ser de aproximadamente 8,3. Se

puede preparar una solución 10 veces concentrada y diluir
el volumen necesario en el momento de la corrida
electroforética. Esta solución puede almacenarse
indefinidamente a Temperatura ambiente.

9. Buffer de carga de muestra 5X, 10 ml:

0,6ml de Tris/HCl 1M pH 6,8 (solución 2) 60mM , 5ml de
Glicerol 50% (solución 4) 25%, 2ml de SDS 10% (solución
3) 2%, 0.5ml de 2 mercaptoetanol 14.4mM, 1ml de azul de
bromofenol (solución 5) 0,1% 0.9ml de agua destilada

NOTA:
Las soluciones 1, 2 y 6 son estables por meses a 4°C. Las
soluciones 7 y 9 deben ser almacenadas a –20°C. El resto
a temperatura ambiente.

Corregido por: Diana Ximena Hurtado Varela

Jorge Cortázar