“Año de la Inversión para el Desarrollo

Rural y Seguridad Alimentaria”

TINCIÓN DE GRAM

Curso : Microbiología
Especialidad : Enfermería Técnica
Docente : Carlos Eduardo Albarrán Gil
Alumnos :
Pajares Aysanoa, Andrea Geraldine
Palomino Pariona, Lizbeth
Cruz Orosco, Indira Gandi
Castro Revollar, Jennifer
Leandro, Yosaida
Guevara Taipe, Nathalie
Tenorio Gómez, Eunice
Juárez Ordoñez, Jhonatan
Ruiz Satalaya, Sthepanie
Jiménez Ramos, Lorena
Villar Alcantara, Ana
Ciclo : II
Turno : Mañana
 TINCIÓN GRAM

I ) INTRODUCCIÓN:

La tinción de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología para la

visualización de las bacterias, debe su nombre al bacteriólogo danés Christian
Gram que desarrolló un método de tinción en 1884.

Por mas de una centuria las bacterias han sido clasificadas a la reacción de
Gram, la habilidad de retener un complejo de iodo violeta cuando se trata con
con un solvente orgánico tal como el alcohol o la acetona , las bacterias Gram
positivas retienen la tintura y aparecen de color violeta, mientras que las Gram
negativas no lo pueden retener y se tiñen de color rojo para ser vistas con el
microscopio

En esta práctica de microbiología se va a realizar la técnica de Tinción Gram

para poder examinar las células bacterianas que se encuentran en el yogurt
determinar al tipo al que pertenecen.

II) OBJETIVO:

1. Emplear técnicas bacteriológicas simples.

2. Conocer el fundamento estructural de la Tinción de Gram.
3. Utilizar colorantes y comprender su utilización.
4. Utilizar el microscopio con el objetivo de inmersión.
5. Observar células procariotas

Lograr el óptimo procedimiento para poder aprender la técnica de Tinción Gram

de todos los integrantes del grupo y comprender la importancia y la diferencia
entra las estructuras de las diferentes bacterias .
III) MATERIALES Y MÉTODOS

Instrumentos

03 Portaobjetos
Goteros,
Pipetas,
Mechero,
Microscopio con lente de inmersión.

Reactivos
Agua destilada.
Cristal violeta,
Gotas de Yogurt
Solución de Lugol
Alcohol 95º
Solución Fucsina o Safranina para contrateñir

IV) PROCEDIMIENTO

 SIEMBRA: Preparar un porta

bien limpio y Coger una porción
pequeña de yogur con un palillo
o una aguja enmangada y hacer
una extensión sobre el porta.

o
 FROTIS: Se fijo las células de ida y vuelta – hasta que se desagrego -
hasta la mitad del portaobjetos.
 FIJACIÓN: con esto evitamos que cualquier sustancia infecte nuestra
muestra y luego, que nuestra muestra permanezca en el porta objeto
(Se fijo por calor – a mechero
 TÉCNICA DE TINCIÓN: Sobre el frotis fijado se vertió la solución de
violeta y se deje en reposo 1 minuto siempre que colocamos un
colorante o mordiente es recomendable deshacerse de los excesos de
líquido ya que pueden interferir cuando apliquemos otra sustancia.
Cubrir con lugol durante 3´. El Lugol actúa como "mordiente", vale decir,
cristaliza la solucion Violeta de Genciana formando un complejo
insoluble en H2O pero soluble en alcohol-acetona.El Lugol forma un
complejo cristal violeta-iodo). Si hay excedente se lava. En este caso
hubo exceso
 DECOLORACIÓN con alcohol al 95 % durante 1 min moviendo el
portaobjetos en ambos lados o a cada extremo, hasta que desaparezcan
los chorros gris violáceos del colorante. Después lave con agua.
. Este paso es fundamental porque en el reside la respuesta diferencial
de las Gram + y las Gram –
. Sabemos que el alcohol deshidrata y contrae las células por contacto.
Sabemos también que los poros de las Gram + son mas pequeños que
los de las Gram -
Entonces, la solución alcohol, contrae los poros de las bacterias
cerrando completamente los de las Gram + y parcialmente los de las
Gram -. El resultado es que dicha solución ingresa en estas últimas
decolorándolas. Hasta aquí tenemos las Gram + violetas y cerradas y
las Gram - incoloras y abiertas.

 CONTRATINCIÓN: Sobre el frotis se echo 2 gotas de Safranina básica

es parcialmente soluble en H2O e ingresará sólo en las Gram - ya que
las otras continúan cerradas por efecto del alcohol-acetona. La safranina
Básicamente interactúa con la membrana celular y forma un complejo
insoluble en H2O. para realizar la contra tinción y realizar frotis. Al cabo
 de 1 ó 2 minutos se vierte el colorante, el preparado se lava con agua si
es que hay exceso, y se deja secar.
 ELIMINAR EL EXCESO y lavar con H2O para eliminar restos de
colorante. Si bien los colorantes ahora son insolubles en agua
(recordemos que el Violeta de Genciana fue “fijado” con lugol), el agua
actúa lavando el exceso de arriba del portaobjetos por arrastre. La
explicación más simple de esto es usando la analogía de la mancha de
aceite en la vereda: si quisiéramos limpiarla usando agua vamos a notar
que es imposible disolver el aceite pero si uso una manguera a presión
puedo “empujar” la mancha a otro sector. Esto es lo que hacemos en el
porta objeto: empujamos el exceso de colorante hacia fuera del
portaobjetos, para poder ver lo que hay debajo
 Observar en el microscopio

MARCO TEÓRICO

TÉCNICA DE TINCION GRAM

Existen variaciones de esta técnica, pero en términos generales, la tinción
Gram involucra estos pasos:

1. Tinción inicial: Las células se tiñen con cristal-violeta. En este paso

todas las células se tiñen de morado.

2. Mordente: Se adiciona yoduro lugol que reacciona con el cristal violeta y

forma el complejo: cristal violeta-yoduro. Las células continúan moradas.
3. Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, que actúa lavando el
complejo cristal violeta-yoduro de las células Gram negativas (estas
quedan incoloras). Este es el paso crítico, pues si se exagera, decolora
las Gram positivas o de lo contrario, no decolora a las Gram negativas.

4. Contratinción: Se vuelve a teñir con Safranina o fucsina, de manera

que las bacterias Gram negativas, que habían quedado incoloras, se
 tilen de rosado a fucsia, en tanto que las Gram positivas no se afectan
con la contratinción.

Basándonos en la reacción a esta tinción de las bacterias, éstas se han

clasificado, taxonómicamente hablando, en grampositivas y gramnegativas.
Las gramnegativas son constantes en su reacción, mientras que las
grampositivas pueden presentar respuestas variables frente a determinadas
condiciones, son gram lábiles. Para explicar el mecanismo de tinción se han
propuesto varias hipótesis, fundadas en la naturaleza química de la pared

V) RESULTADOS

Observación
Realizar una tinción de Gram: mediante esta coloración se pueden diferenciar
las bacterias típicas del yogur (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus
thermophilus), que son Gram (+), de las bacterias
VI.- DISCUSIONES

 Busca en la literatura, a los microorganismos observados en la práctica y

compara tus resultados con lo reportado.

 Si observaste alguna diferencia en cuanto a morfología o reacción a la

tinción de Gram, trata de buscar alguna explicación.

 Investiga qué tipo de variables pueden ocasionar que se obtengan

resultados no deseables cuando se realiza una tinción de gram (por ejemplo
que una bacteria Gram negativa se colore de morado).

VII.- CONCLUSIÓN

Hemos podido reconocer a través del método de tinción Gram, en este caso se
identifico bacterias y sus formas y los lactobasilos del yogurt, en nuestro caso
se juntaron las bacterias de streptococcus y los lactobasilos estando unidos en
el portaobjetos y diferenciándose por los colores rosa y los lactobasilos eran
gran positivas y de color rosa y los streptococcus eran vien la observación del
microscopio se pudo apreciar su formas bien definidas y diferenciadas. Gram +
violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas.

VIII.- BIBLIOGRAFÍA

 Cavallini, E. R. (2005 ). Bacteriología General: Principios Y Prácticas de

Laboratorio. Costa Rica: Universidad de Costa Rica.

 EUNED. (2004). Introducción a la microbiología.

 Reverte. Forbes, B. A. (2009). Diagnostico Microbiologico. Médica

Panamericana.
 ANEXOS

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un

portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de
separar lo más posible los microorganismos, ya que si
aparecen agrupados en la preparación es muy difícil
obtener una imagen clara y nítida.

Esta solución es fijado al vidrio del portaobjetos para

poder aplicar los métodos habituales de tinción que
permiten la observación al microscopio de las bacterias
sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos
lavados La fijación de una extensión bacteriana hace
que las bacterias queden inactivadas y adheridas al
vidrio alterando lo menos posible la morfología y
bacteriana y las posibles agrupaciones de células que
pudiera haber.

GRAN POSITIVAS
LACTOBACILOS Y
STREPTOCOCCUS YOGURT
actobasilos

MEDIANTE LA
TÉCNICA DEL
FROTIS SE
COMBINARO LAS
DOS BACTERIAS.