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LABORATORIO N° 3 DE MICROBIOLOGÍA I

TINCIONES BÁSICAS Y MORFOLOGÍA DE BACTERIAS


Basante Córdoba, Sofía Nathalia (217095016); Cabrera Enríquez, Susan (217095048); Enríquez López,
Ángela Gabriela (217095102); Hernández Ramirez, Anderson Javier (217095134); López López, Lina
María (217095168); Rodríguez Bucheli, Manuel Alejandro (217095272).

Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Biología - Semestre 3

sofiabasante.nb@gmail.com; susan.ce19@gmail.com; enriquezlopezangela@gmail.com


javihr2000@gmail.com; linamaria443@gmail.com; malejo2408@gmail.com.
RESUMEN: El manejo de técnicas de tinción permiten la observación y diferenciación de células
microbianas en el microscopio, en esta práctica se realizó tinción de Gram a una muestra de
Staphylococcus aureus, diferenciando las bacterias gram-positivas (con gruesa capa de
peptidoglucano) y gram-negativas (con capa menos densa de peptidoglucano), también tinción de
Wright a una muestra de Bacillus subtilis, para el reconocimiento de esporas bacterianas, y por
último tinción con tinta china a una muestra de Klebsiella pneumoniae, como método de contraste
para la observación de bacterias no teñidas que presentan cápsula, concluyendo que dichas técnicas
permitieron, identificar y diferenciar, algunas características de células microbianas, las cuales
fueron la composición de la pared celular, la producción de esporas y la presencia de cápsula en
bacterias.
Palabras clave: Tinción, morfología, bacterias, S. aureus, B. subtilis, K. pneumoniae.
INTRODUCCIÓN bacterianas o entre partes de una misma
célula.
La tinción es un proceso por el cual las
moléculas de un colorante se absorben a una Los colorantes más usados son: azul de
superficie. El uso de colorantes permite metileno, cristal violeta, safranina, estos son
cambiar el color de las células de los catiónicos y se combinan fuertemente con
microorganismos y poder realizar la componentes celulares cargados
observación en microscopio óptico. Dado que negativamente, como los ácidos nucleicos y
las bacterias son casi incoloras, no presentan los polisacáridos ácidos. Algunos colorantes
contraste con el medio en el cual se teñirán mejor solo después de que la célula
encuentran suspendidas y no pueden haya sido tratada con otra sustancia química,
observarse claramente sin algún tratamiento que no es un colorante por sí mismo. El
previo. De acuerdo a la reacción que ocurre, mordiente se combina con un constituyente
existen diferentes tipos de tinción: celular y lo altera de manera que ahora sí
podrá atacar el colorante.
- Simple: El colorante utilizado sirve solo
para denotar la morfología celular. Las células generalmente son tratadas para
- Diferencial: El colorante utilizado pone coagular el protoplasma antes de teñirlas,
de manifiesto diferencias entre células proceso conocido como fijación. Después de
esta habitualmente se realiza la tinción. La
fijación produce generalmente encogimiento Se realizó el proceso de tinción de Gram para
de las células, la tinción, por el contrario, la bacteria Staphylococcus aureus,
hace que las células parezcan mayores de lo obteniendo los siguientes resultados:
que son realmente. [1]
TABLA 1. Características de Staphylococcus
METODOLOGÍA aureus observadas en tinción Gram.
Se realizaron tres diferentes tipos de tinciones BACTERIA TINCIÓN GRAM
con el objetivo de identificar la morfología de Coloración violeta,
algunas bacterias. Gram-positiva
MORFOLOGÍA
1. Tinción Gram: Primero se colocó una - Forma grupos de
gota de agua destilada sobre un Staphylococcu células irregulares
portaobjetos, posteriormente con un aza s aureus semejantes a racimos
se transfirió y disperso una parte de la de uvas.
colonia en este caso Staphylococcus - Aparecen solos, en
aureus; se aplicó cristal violeta, se lavó pares, en racimos o
con agua, luego se aplicó lugol, se lavó en cadenas cortas.
con agua y posteriormente se aplicó
safranina y se lavó con agua. Todas las
sustancias aplicadas, fueron durante un
minuto. por último, se preparó la muestra
para observar en objetivo de aceite de
inmersión al microscopio.

2. Tinción de esporas con verde de


malaquita: Se tomó la colonia de Bacillus
subtilis, que posteriormente se cubrió con
verde de malaquita y se flameó en un
mechero la muestra durante 10 minutos
sin dejar que el colorante hierva,
posteriormente se lavó con agua y se
agregó safranina se dejó actuar dos
minutos y se lavó con agua, por último,
Figura 1. Tinción Gram de Staphylococcus
se dejó secar y se pasó a la observación
aureus observado desde un aumento total de
en el microscopio.
1000 X.
3. Tinción con tinta china: En un Staphylococcus aureus presenta una forma
portaobjetos se preparó un frotis cargado, esférica u ovoide con una tinción violeta,
al que se le adicionaron dos gotas de tinta además de observar las distintas estructuras
china y se extendió la muestra sobre el que los cocos pueden formar como: cocos
portaobjetos, posteriormente se dejó secar simples, diplococos (son dos cocos formando
a temperatura ambiente para pasar a su una pareja), estreptococos (cocos que forman
observación en el microscopio con el cadenas), tétradas (son 4 cocos agrupados), y
objetivo de inmersión. sarcina la cual está formada por paquetes en
formas cocáceas que se dividen en tres planos
DISCUSION DE RESULTADOS perpendiculares entre sí.

ENSAYO 1: Tinción de Gram.


Teniendo en cuenta la coloración violeta de la peptidoglucano. Además, la pared de las
bacteria Staphylococcus aureus, se puede gram-negativa tiene una capa externa con
concluir que es una bacteria gram-positiva. lipopolisacáridos. El cristal violeta y el yodo
Esta característica está ligada a la estructura penetran con facilidad tanto en las bacterias
de la envoltura celular, por lo que refleja un gram-positivas como las gram-negativas. En
tipo natural de organización bacteriana. el interior el cristal violeta y el yodo se
combinan para formar el complejo (CV-Y).
La pared celular de las bacterias gram
Este complejo es mayor que las moléculas de
positivas está formada en un 90% por
cristal violeta que han penetrado y por su
peptidoglucano, siendo el componente
tamaño no puede ser lavado por el alcohol a
principal que permite diferenciarlas con la
través de la capa intacta de péptidoglucano de
pared de las gram-negativas, dado que, al
las células gram-positivas. Por consiguiente,
teñirlas, es gracias al grosor que se logra
las células gram-positivas retiene el color del
mantener la coloración del cristal violeta en el
colorante cristal violeta. Sin embargo, las
interior de la célula al teñirla con la tinción
células gram-negativas el alcohol desorganiza
Gram.
la capa externa de lipopolisacáridos y lava el
En la figura 2, se indican las características de complejo (CV-Y) de la delgada capa de
una pared celular bacteriana gram-positiva. peptidoglucano. Como resultado, las bacterias
gram-negativas quedan decoloradas hasta la
tinción de contraste con safranina, que les
deja de color rosa.
ENSAYO 2: Tinción de esporas con verde
malaquita.

Algunos géneros bacterianos, entre los que


destacan Clostridium y Bacillus, producen en
su interior formas de resistencia denominadas
endosporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables
Figura 2. Comparación de las envolturas (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
celulares bacterianas Gram-positivas. (1) extremas, radiaciones, compuestos tóxicos,
membrana citoplasmática, (2) peptidoglicano, etc.) formándose una espora por cada forma
(3) fosfolípidos, (4) proteínas y (5) ácido vegetativa. Al finalizar el proceso de
lipoteicoico. esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y
libera la espora al exterior. Cuando el
Obtenido de: ambiente es favorable, la espora germina
http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4. generando una nueva forma vegetativa. La
htm capacidad de germinar perdura durante años.
Algunas de las bacterias productoras de
endosporas son patógenas para el hombre, por
Las gram-positivas no tienen espacio peri lo que su estudio y observación son de
plasmático, tienen una red de peptidoglucano enorme interés.
que está bien desarrollada y puede llegar a
Las endosporas poseen unas cubiertas
tener hasta 40 capas. Entre otras diferencias exclusivas que las hacen resistentes a los
las bacterias gram-positivas tienen una pared factores ambientales adversos. Además, estas
celular más gruesa compuesta por cubiertas hacen que las esporas aparezcan en
peptidoglucano, mientras las gram-negativas el microscopio óptico como estructuras
la tienen más delgada, aunque también con refringentes y de difícil tinción. Para la
observación de las esporas en el microscopio
se utilizó colorante verde malaquita, el cual
penetra la espora con ayuda de calor, y
además se fija a ésta por la alta
impermeabilidad de la espora.
La tinción específica de esporas requiere dos
colorantes:
a) Verde malaquita: capaz de teñir las
esporas en caliente.
b) Safranina: colorante de contraste que tiñe
las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tinción, no


perderán el colorante en el lavado con agua, y
sí lo harán las formas vegetativas, que
quedarán teñidas con el segundo colorante.
Figura N° 3 - Tinción de esporas observado
desde un aumento total de 1000 X.
Para el desarrollo de esta tinción, se fijó al
calor la muestra de una colonia de Bacillus ENSAYO 3: Tinción con tinta china.
subtilis, y se le aplicaron los diferentes tintes
mencionados anteriormente y se los volvió a En esta práctica se tomó con el asa estéril un
fijar al calor para finalmente poder observar a poco de cultivo de Klebsiella pneumoniae, el
un aumento total de 1000x. cual se lo colocó en una lámina que contenía
una gota de agua destilada. En la misma
Se pudo observar la presencia de una
coloración verde, la cual indica la presencia lámina se agregaron dos gotas de tinta china
de esporas que se encuentran fuera de la que es una suspensión de partículas de
célula (exo esporas), y se observó otras carbono coloidal, y se lo mezclo el agua
células de un color rojizo que no presentaron destilada que contiene la muestra del cultivo.
aquellos puntos verdes que indican las Inmediatamente se realizó el extendido con
esporas, por lo tanto, se podría decir que ya un portaobjetos limpio y se dejó secar a
han esporulado y las esporas ya han salido temperatura ambiente.
fuera de la célula, dichas células se
encuentran en estado vegetativo (ver figura Una vez la muestra ya seca se lo colocó en el
3). [2] microscopio y se agregó una gota de aceite de
inmersión para realizar la respectiva
observación en un aumento de total de 1000x.
Se logró observar que la tinta china no
penetra en la célula de Klebsiella
pneumoniae, cabe destacar que la tinción con
tinta china es el reverso del procedimiento de
tinción usual: las células se dejan sin teñir,
pero se colorea en cambio el medio que las
rodea, esto nos permite observar el perfil de
la célula y la presencia de una cápsula
alrededor de la célula bacteriana. Dicha
cápsula está compuesta por polisacáridos que
le permite que la tinta china no ingrese al
medio celular, esto se debe a que la
formación estructural de la Klebsiella no  La implementación de la safranina y el
soporte compuestos inorgánicos derivados de verde malaquita en la tinción de esporas
petróleo como lo es el carbón y otros tantos permitió diferenciar las bacterias y las
compuestos presentes en la tinta china que esporas presentes en la colonia.
ésta no reconoce. Cabe destacar que las
condiciones ambientales y su tipo de REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
alimentación Klebsiella pneumoniae es otro
factor el cual no lo permiten el ingreso de 1. Tortora, Funke, Case. Introducción a la
dicha sustancia. microbiología (1993). 3ra. Edición
Editorial Acribia, Zaragoza.
Aparte del paso selectivo de sustancias en el
medio, la cápsula permite la formación de 2. Microinmuno. (2018) Técnicas de
colonias y la protección contra la desecación, tinción. Disponible en:
ya que estas están propensas a muchos http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/
factores del medio (ver figura 3). [3,4] SeminarioTinciones.htm. Consultado el
14 de marzo de 2018.

3. Meynell, G. G. y Meynell, E (1969).


Bacteriología Experimental. Teoría y
Práctica. Ediciones Omega. Barcelona.

4. Microbitos. (2018) K. Oxytoca, K.


ozanae. Klebsiella pneumoniae,
Morfología, medio de cultivo,
enfermedades y más. Disponible en:
http://microbitosblog.com/2015/04/20/kle
bsiella_medio_cultivo_infeccion_gram.
Consultado el 14 de marzo de 2018.

Figura 4. Tinción con tinta china observado


desde un aumento total de 1000 X.

CONCLUSIONES
 El método de Gram es una de las técnicas
de tinción más importantes en
microbiología, no obstante, los resultados
de la tinción gram no son absolutos
porque algunas células bacterianas se
tiñen mal o no lo hacen.
 Se logró identificar con la tinción de tinta
china las cápsulas Klebsiella
pneumoniae, la cual tiñe el medio en que
se encuentra la célula y facilita su
observación puesto que es una tinción
negativa.