TECNICAS DE MICROCULTIVOS PARA HONGOS

INTRODUCCION

Los hongos se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden

encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal
sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de
algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición
de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los
hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano
es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja
humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de
almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la
irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos
fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus
derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas,
especias, etc.

Los hongos al igual que las levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas,
carbohidratos como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También
pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos
(micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c)
habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias
patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las
superficies de alimentos.

OBJETIVOS
 Aprender la técnica del microcultivo.
 Lograr el desarrollo de las estructuras somáticas y reproductivas intactas.
 Hacer el reconocimiento de las estructuras utilizadas como caracteres
utilizados.
 FUNDAMENTO TEORICO

Preparaciones para el estudio microscópico de los aislados

Existen tres métodos muy comunes para el examen al microscopio de los hongos
filamentosos.

1. Preparación en fresco
 Colocar una pequeña fracción de la colonia con cierta cantidad de agar en un
porta con azul de lactofenol
 Separar la colonia con unas pinzas y cubrir con el cubre-objetos
 Presionar suavemente con unas pinzas o el extremo de un lápiz
 Examinar la preparación primero con 10X y después con 40X. Si se observan
estructuras sospechosas se puede observar con 100X (objetivo de inmersión)

Esta técnica a menudo rompe las débiles estructuras fructificantes de los hongos
filamentosos, haciendo difícil observar las características de esporulación.

2. Preparación con cinta adhesiva transparente

Este método de preparación es útil ya que se conserva las características de
agrupamiento de las esporas de algunos hongos más delicados.
 Adherir una cinta adhesiva transparente (tipo Fixo) sobre la colonia para tomar
una porción del micelio aéreo
 Colocar una gota de azul de lactofenol sobre el portaobjetos
 Pegar un extremo de la cinta adhesiva cargada con el micelio en el extremo del
porta
 Presionar la cinta sobre el colorante para permitir que le micelio empape en la
solución y entonces cuidadosamente pegar el extremo de la cinta adhesiva al
porta con cuidado de que no se formen burbujas de aire
 Observar al microscopio de igual forma que en el método anterior excepto que
no se observa con inmersión

3. Microcultivo en porta
En los casos en los que las técnicas anteriores no den buenos resultados o
cuando se requiere mantener la preparación por algún tiempo para observaciones
posteriores, se recomienda la técnica de microcultivo en porta. Aunque es algo
más laboriosa, se consiguen preparaciones de alta calidad en las que se pueden
observar perfectamente las estructuras de diferenciación como esporas y sus
agrupamientos.
 Poner un trozo de papel de filtro o algodón en el fondo de una placa Petri
 Colocar sobre ella dos pequeños palillos de vidrio o de otro material, que
servirán de soporte para el portaobjetos
 Colocar un cilindro de medio de agar como dextrosa, patata, etc., sobre el
porta, este se puede cortar con un sacabocados
 Inocular en tres o cuatro sitios diferentes del cilindro de agar con una pequeña
porción de la colonia del hongo
 Calentar ligeramente un cubre por paso a través del mechero e
inmediatamente colocar sobre la preparación, con lo que el agar es ligeramente
fundido, lo que sella completamente el cubre contra la preparación
 Pipetear una pequeña cantidad de agua en el fondo de la placa para saturar el
papel de filtro
 Colocar la tapa de la placa e incubar a temperatura ambiente o a 30ºC durante
3-5 días
 Cuando aparezca un crecimiento visible, puede separarse el cubre suavemente
de la superficie del agar, con cuidado de no romper el micelio
 Colocar el cubre sobre una gota de lactofenol en un segundo porta
 Una vez retirado el cubre, se puede retirar también el bloque del agar y hacer
con él una segunda preparación con azul de lactofenol
 Si no puede retirarse el cubre del agar, ya que se ha pegado firmemente a él y
se ha secado lo suficiente, se puede llevar a cabo la preparación añadiendo a
los bordes del cubre la solución del colorante de lactofenol. Éste entra en la
preparación por capilaridad y tiñe las estructuras.

A pesar que existe diferentes técnicas para la observación microscópica, la

forma más sencilla de hacer preparados para la observación microscópica
consiste en tomar muestras de las colonias y colocarlas en láminas porta y
cubreobjetos, sin embargo esta técnica altera la disposición de sus estructuras
por lo cual resulta más apropiado hacer “micro-cultivos”. Los microcultivos
pueden realizarse e dos maneras: En lamina excavada y empleando “taquitos”
de agar
Las técnicas de micocultirvo permiten manejar y observar las especies sin
modificar su desarrollo, y el arreglo acomodo de sus estructuras permanece sin
alterarse.
 TECNICA DE LA LÁMINA ESCAVADA

MATERIALES
 Placas de agar con colonias de hongos
 Laminas escavadas
 Laminilla cubre objetos
 Vaselina
 Asas de siembra
 Agar fundido (45-50 0C)
 Pipetas estériles
 Cámara húmeda (placa estéril con algodón humedecido en el interior
 Claves taxonómicas

PROCEDIMIENTO
 Colocar una o dos gotas de agar fundido en el hoyo de una lámina escavada
limpia y estéril.
 Dejar que el agar solidifique.
 Con el asa de siembra colocar un inoculo de la colonia fúngica sobre el agar
solidificado.
 Aplicar vaselina alrededor del hoyo de la lámina y sobre ella colocar la laminilla
cubreobjeto previamente flameada.
 Colocar en cámaras húmedas e incubar a 25-28 oC por el tiempo necesario
para el crecimiento.
 Observar en el microscopio con objetivo de menor y mayor aumento.

TECNICA DE LOS TAQUITOS DE AGAR

MATERIALES:
 Placas de agar con colonias de hongos
 Placas con agar PDA(20-25 ml de medio en la placa)
 Laminas porta y cubre objeto
 Asa de siembra en ángulo de 90 o
 Sacabocado
 Cámara húmeda
 Claves taxonómicas
 PROCEDIMIENTO
 Con el sacabocado previamente flameado y frio extraer un trocito de agar PDA
y colocarlo sobre una lámina porta objeto limpia y estéril
 Con la asa de siembra dividir en dos el trocito de agar y separarlos ligeramente
 Con el asa de siembra tomar el inoculo de la colonia y sembrar en los bordes
de los trocitos de agar
 Cubrir los trocitos con una laminilla cubre objeto previamente flameada
 Colocar en cámara húmeda y llevar a la estufa a 25-28oC o a temperatura
ambiente por el tiempo necesario
 Observar al microscopio con lentes de 10 y 40 aumentos

INTERPRETACION

La forma, el tamaño, color y disposición de los cuerpos de fructificación

permiten la identificación de géneros y especies de hongos por lo cual la
observación microscópica debe ser minuciosa a fin de aplicar correctamente
las claves taxonómicas.
BIBLIOGRAFIA
Norma Oficial Mexicana. NOM-111-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Método
para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

Pitt J. (2001) Toxigenic Penicillium Species. In: Food Microbiology.

Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T.(Eds.)
ASM Press. USA. 467-480

Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological

Criteria. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M.
Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 71-87.