Professional Documents
Culture Documents
INTRODUCCIÓN
La marihuana (Cannabis sativa) es una de las drogas que más se consume en Corea, solo superada
por la metanfetamina [1]. La historia de la marihuana se originó en BC 4,000 China a partir de
fibras de cáñamo. En la medicina oriental, las semillas descortezadas de cannabis, que no
contienen ningún compuesto alucinógeno, se han utilizado para aliviar el estreñimiento. El efecto
alucinatorio generalmente se mejora cuando se seca o cuando se quema la flor, el tallo, la semilla
y el cannabis [2].
I. Preparación de MSCs
Las células p53-WT H460, con un gen p53-WT, y las células p53-nulas H1299, que carecen del gen
p53, se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC; HTB-177TM y CRL-5803TM,
respectivamente). Estas células se cultivaron en RPMI1640 suplementado con 5% de suero fetal
bovino (FBS), penicilina (100 unidades / ml) y estreptomicina (100 μg / ml) a 37ºC en una
atmósfera de 5% de CO2 / 95% de aire bajo humedad de saturación.
Para evaluar la genotoxicidad de las MSC, se realizó el ensayo de electroforesis en gel de células
individuales in vitro (ensayo cometa) según lo descrito por Singh et al. [dieciséis]. Las células H460
y H1299 (20 x 104 células / pocillo) se plaquearon en placas de 6 pocillos y el cultivo se mantuvo a
37ºC en un 5% de CO2. Después de 24 horas de incubación, las células se expusieron a MSC
durante 24 horas. Las células tratadas se tripsinizaron para producir una suspensión de células
individuales, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y se
resuspendieron en agar 0,7% de punto de fusión bajo (Quantum Biotechnologies Inc., Quebec,
Canadá) en PBS a concentración de 5 × 104 células / ml. Se pipeteó una alícuota de 150 μL de esta
suspensión sobre portaobjetos de vidrio prerrecubiertos, se cubrieron con un cubreobjetos de
vidrio y luego se dejó que el agar se fijara a 4 ° C. La muestra se colocó en solución de lisis. Para el
ensayo de cometa alcalino, las células se lisaron en una solución de lisis de pH 10 (NaCl 2,5 M,
Na2EDTA 100 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton X-100 al 1%) a 4ºC durante 60 minutos. Y el
portaobjetos se cubrió con 0,7% de agar de bajo punto de fusión y el agar se dejó fraguar a 4 ℃.
Las células lisadas se lavaron y permitieron un tiempo de relajación de 30 minutos en tampón de
electroforesis (Na2EDTA 1 mM, NaOH 300 mM, pH 13). Luego se llevó a cabo la electroforesis
durante 30 minutos a 25 V en hielo y las células se neutralizaron con Tris-HCl 0,4 M (pH 7,5)
durante 10 minutos. Las células se tiñeron con bromuro de etidio (2 μg / ml) justo antes del
análisis de imagen. La migración del ADN se evaluó mediante microscopía de fluorescencia (filtro
de excitación 515 a 560 nm y un filtro de barrera de 590 nm; Leica DMLB, Leica, Wetzlar,
Alemania) junto con una cámara digital. Las imágenes se evaluaron mediante un sistema de
análisis automático de imágenes (Komet versión 5.0, Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, Reino Unido).
El momento de cola de aceituna (distancia de cola × porcentaje de ADN en la cola) se utilizó para
cuantificar el daño en el ADN, con base en la puntuación aleatoria de 100 núcleos por
portaobjetos.
Para evaluar el efecto macro-genotóxico de las MSC, se realizó el ensayo de micronúcleo con
bloque de citocinesis in vitro (CBMN), que ofrece una buena alternativa a la técnica de aberración
cromosómica convencional [17]. En el ensayo de micronúcleos (MN), las células p53-WT H460 y
p53-nulo H1299 se sembraron en portaobjetos de 8 cámaras a una densidad de 1,8 × 104 células /
pocillo y se cultivaron durante 24 horas hasta que alcanzaron el 70% -80% confluencia. El medio de
tratamiento se preparó añadiendo MSCs a medio. Para cada prueba independiente, se prepararon
al menos dos diapositivas. Para restringir el análisis a las células que habían pasado por su primera
división, las células se incubaron en un medio de crecimiento que contenía 3 μg / ml de
citocalasina B [18]. Un ciclo después de que se añadió citocalasina B, el medio de crecimiento se
eliminó del portaobjetos de la cámara de 8 pocillos por aspiración. El portaobjetos se lavó dos
veces con la misma cantidad de PBS y se dejó durante 5 minutos a 4 ° C después de añadir 1% de
citrato de sodio. El portaobjetos se colocó luego en un fijador nuevo (99: 1 = metanol: ácido
acético) durante 20 minutos a temperatura ambiente, y posteriormente se dejó en un banco
limpio para destilar aire antes de colocarlo en la ribonucleasa A (10 μg / ml en 2x solución salina-
citrato de sodio (SSC)) durante 5 minutos a 30 ℃. El portaobjetos se enjuagó luego en 2 x SSC
(citrato sódico 0,03 M, NaCl 0,3 M) y se dejó en un banco limpio para secar al aire. Después de un
secado exhaustivo al aire, el portaobjetos se tiñó con solución de Giemsa al 5% durante 14 horas.
De acuerdo con el criterio de puntuación de MN, se obtuvo una puntuación de 1.000 células
binucleadas por cultivo independiente. Los efectos mutagénicos positivos de las muestras se
definieron como un aumento de tres veces o más en la frecuencia de MN sobre el control con al
menos una de las dosis probadas [19].
Los métodos de Hussain et al. [20] y Fotakis et al. [21] se adoptaron para determinar el aumento
de las ROS intracelulares en células tratadas con MSC p53-WT H460 y p53-nula H1299. Las células
se sembraron en placas de 48 pocillos a una concentración inicial de 4x104 células / pocillo, y se
incubaron durante 24 horas. Las células se cultivaron al 80% de confluencia en placas de 48
pocillos y se expusieron a MSC durante 6 horas. Se añadió diacetato de 2 ', 7'-
diclorohidrofluoresceína (DCF-DA) durante 1 hora como un indicador de ROS intracelular. Este
ensayo requiere que el diacetato se escinda químicamente [22]. De modo que cada pocillo se lavó
dos veces con PBS y se lisó usando NaOH 0,1N. La producción de DCF (fluorescencia verde) se
midió en un fluorómetro LS50B (Perkin-Elmer, Shelton, CT, EE. UU.) Con una longitud de onda de
excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm.
VI. Apoptosis
La apoptosis en células expuestas a MSC se analizó utilizando el protocolo Cell Death Detection
ELISAPLUS (Roche Diagnostic, Montclair, NJ, EE. UU.). Aproximadamente 104 células / pocillo se
sembraron en una placa de 96 pocillos. Después de 24 horas de incubación, el medio se cambió
por medio que contenía MSCs durante 24 horas. Con referencia a las instrucciones del fabricante,
al final del período de incubación, las células se lisaron y los niveles de apoptosis se determinaron
usando el ensayo Cell Death Detection ELISA, que mide fragmentos de ADN citoplásmicos
asociados a histonas (mono y oligo nucleosomas).
Las células BEAS-2B (60 × 104 células / pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y los cultivos
se incubaron durante 6 horas a 37 ° C. Después de la exposición a las MSC, se aisló el ARN total de
las células BEAS-2B utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las especies de
ARN mensajero se pueden transcribir de forma inversa en ADNc a través de la actividad enzimática
de muchas transcriptasas inversas (RT) disponibles en presencia de dNTP y un cebador oligo dT. Se
colocó un microgramo de ARNm aislado de células en un tubo de reacción con 0,5 μg / ml de
cebadores aleatorios, 1 μl de transcriptasa inversa AMV, 4 μL de tampón RT 5X, 0,5 μL de inhibidor
de RNasa y 1 μL de dNTP 10 mM . Las condiciones de RT fueron las siguientes: temperatura
ambiente durante 10 minutos, 42 ℃ durante 50 minutos y 94 ℃ durante 5 minutos. La reacción se
realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó ADNc de cada una de las muestras.
Los cebadores específicos se diseñaron y se muestran en la Tabla 1. Los niveles de ARN ribosomal
(18s) se usaron para normalizar los resultados. La señal de fluorescencia en tiempo real producida
por el colorante de unión de ADN bicatenario no específico se analizó usando el software Smart
Cycler. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó usando 0.1 μM de los cebadores
oligonucleotídicos sentido y antisentido, 12.5 μL de 2X SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio Inc., Shiga,
Japón) y 1 μL de ADN molde en un volumen final de 25 μL. La amplificación por PCR se realizó
usando un Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Las señales de fluorescencia se leyeron
al final de cada paso de extensión. El ciclo de umbral se determinó para cada muestra usando la
fase de crecimiento exponencial, y la señal de referencia de la fluorescencia frente al número de
ciclos. Para garantizar que se amplificara un solo producto, se realizó un análisis de curva de fusión
en los productos de PCR cada vez que se realizaba una PCR.
SigmaPlot 10.0 (Jandel Science Software, San Rafael, California, EE. UU.) Y Excel 2007 (Microsoft,
Redmond, WA, EE. UU.) Se utilizaron para analizar los datos. Los datos de cada ensayo se
expresaron como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando el
programa SPSS versión 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Las diferencias entre los grupos se
probaron mediante la prueba t siguiendo el análisis de varianza de una vía (ANOVA). La
significación estadística fue aceptada a p <0.05 y 0.01.
RESULTADOS
I. Efectos genotóxicos
Con el fin de investigar los efectos genotóxicos de las MSC, realizamos el ensayo cometa y el
ensayo CBMN. Para evaluar el daño en el ADN inducido por la exposición a MSCs, se realizó un
ensayo de cometa en p53-WT H460 y p53-nulo en células H1299. Después del tratamiento con
MSCs durante 24 horas, el daño del ADN en las dos líneas celulares aumentó significativamente de
una manera dependiente de la dosis (0,04 a 5 μg / ml) (Figura 1). A todas las dosis empleadas
(0,04, 0,2, 1 y 5 μg / ml), el daño en el ADN inducido por las MSC en p53-nulo H1299 fue
estadísticamente más alto que en las células p53-WT H460. En el
En el ensayo CBMN, se observó formación significativa de MN en las dos líneas celulares tratadas
con MSC de una manera dependiente de la dosis (0,04 a 5 μg / ml) (Figura 2). La formación de MN
a la dosis más alta (5 μg / ml) en H460 y H1299 se incrementó en 2.24 veces y 3.28 veces en
comparación con las de cada grupo de control, respectivamente, mostrando la mayor sensibilidad
de p53-nulo H1299 (p <0.01) .
Para identificar el estrés oxidativo dependiente de p53 por MSC, se midió ROS en p53-WT H460 y
p53-nulo en células H1299. Como se muestra en la Figura 3, la exposición de las MSCs mejoró la
fluorescencia de DCF en las células p53-WT H460 dependiente de la dosis, mientras que no se
observó una mejora significativa en las células H1299 nulas en p53. La generación de ROS en
células p53-WT H460 tratadas con la concentración más alta de MSC fue 5 veces mayor en
comparación con el control (p <0,01) (Figura 3). Este resultado confirmó que la exposición a MSC
aumentó la generación de ROS en células p53-WT H460
Los niveles de ARNm de p53 y Bax se cuantificaron usando una PCR cuantitativa en tiempo real
muy sensible, sensible y rápida de SYBR verde (Figura 5). El tratamiento con MSC durante 6 horas
aumentó significativamente la expresión de ARNm de genes relacionados con la apoptosis, que
incluyen p53 (Figura 5A) y caspasa-3 (Figura 5B). La expresión del gen Bax apoptótico se
incrementó significativamente (Figura 6A) y la expresión del gen B-2 anti-apoptótico disminuyó
significativamente en comparación con el control (Figura 6B). Además, la relación de Bax a Bcl-2
aumentó significativamente después de la exposición a MSC (Figura 6C). En conjunto, estos
resultados indicaron que p53 y otros genes relacionados con la apoptosis están implicados en la
apoptosis inducida por MSC.
DISCUSIÓN
El gen p53 mutado se considera el factor más frecuente en el cáncer de pulmón. El mal
funcionamiento genético simultáneo en las células epiteliales bronquiales produce cambios
citomorfológicos que condujeron al cáncer de pulmón [23]. El gen p53 mutado en cánceres
humanos [24] participa en el control de la reparación del daño del ADN [25], la apoptosis [26] y la
progresión del ciclo celular [27]. El papel de p53 es anticarcinogénesis por acciones perturbadoras
como apoptosis, detención de ciclos celulares en células dañadas por ADN. Los estudios de
partículas en el daño del ADN se han centrado en extractos orgánicos como la fracción principal
[28]. Cientos de componentes son fracción orgánica consistente, incluidos algunos grupos
genotóxicos de compuestos tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos, derivados nitrados o
oxigenados [29,30]. Por lo tanto, para identificar la carcinogénesis pulmonar inducida por MSC,
determinamos los efectos genotóxicos y la apoptosis de las MSC dependientes de p53 solo en las
fracciones orgánicas.
El daño en el ADN inducido por las MSC se incrementó de forma dependiente de la dosis en células
p53-WT H460 y células H1299 nulas en p53 (Figura 1). Algunos investigadores han informado que
el humo de la marihuana induce daño en el ADN por la formación de aductos de ADN [31]. En el
ensayo CBMN con p53-WT H460 y p53-nulo células H1299 (Figura 2), MSC también estimuló un
aumento significativo de la formación de MN de una manera dependiente de la dosis. Sin
embargo, la exposición de células H1299 nulas en p53 a MSCs produjo más rotura de ADN y
formación de MN que las células p53-WT H460 expuestas a MSC. Pfeifer y col. [25] informaron que
p53 está involucrado en el control de la reparación del daño del ADN. Por lo tanto, sugerimos que
el daño significativo al ADN y a los cromosomas en células H1299 nulas en p53 expuestas a MSC
puede deberse a una insuficiencia en la vía de reparación del ADN causada por la deficiencia de
p53.
En conclusión, las CMS aumentaron significativamente las roturas del ADN y los cambios
cromosómicos en las células p53-WT H460 y p53-nulas H1299. En particular, se demostró que la
genotoxicidad era significativamente más alta en H460 que en las células H1299, a pesar de que lo
contrario era cierto para la inducción de ROS por MSCs. Esperamos que la apoptosis sea
estimulada por la regulación del gen Bax / Bcl-2 en las células H460 por este motivo. Estos
resultados sugieren que las MSCs inducen daños de ADN / cromosoma en células de cáncer de
pulmón humano, y p53 juega un papel importante en la respuesta celular de las MSC.
Figura 1. Rotura de ADN inducida por condensados de humo de marihuana (CSM) en células H460
y células H1299. Las células se incubaron con MSC (0,04-5 μg / ml) en medio de crecimiento
durante 24 horas. Los ensayos se llevaron a cabo tal como se describe en materiales y métodos.
Todos los resultados se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos
separados para cada punto de datos del momento de la cola de oliva (% de ADN en la cola ×
distancia entre centros de masa). Los valores fueron significativamente diferentes del control del
vehículo (0.1% DMSO; ** p <0.01) o cada concentración de MSC en células H1299 (++ p <0.01)
Figura 2. Formación de micronúcleos (MN) inducida por condensados de humo de marihuana
(CSM) en células H460 y células H1299. Las células se incubaron con MSC (0,04-5 μg / ml) en BEGM
suplementado con 5% de suero bovino fetal durante 24 horas. Los ensayos se llevaron a cabo tal
como se describe en materiales y métodos. La frecuencia de MN por cada 1000 celdas de control
es de 5,00 ± 0,82. Los resultados se expresan como media ± SD. Los valores fueron
significativamente diferentes de cada control (0,1% DMSO; ** p <0,01) o cada concentración de
MSC en células H1299 (++ p <0,01).
Figura 5. Expresión génica de p53 y caspasa-3 en p53-wildtape (WT) células H460 expuestas a
condensados de humo de marihuana (CSM). Las células se expusieron a MSC (1-25 μg / ml)
durante 6 horas para identificar genes relacionados con p53 que implicaban p53 (A) y Caspase-3
(B). Los resultados se expresan como media ± SD. Los valores fueron significativamente diferentes
del control (DMSO al 0,1%). * p <0.05.
Figura 6. Expresión del gen Bax y Bcl-2 en células H53 p53-wildtape expuestas a condensados de
humo de marihuana (CSM). Las células se expusieron a MSC (1-25 μg / ml) durante 6 horas para
identificar los genes relacionados con p53 que implican Bax (A), Bcl-2 (B) y Bax / Bcl-2 (C). Los
resultados se expresan como media ± SD. Los valores fueron significativamente diferentes del
control (DMSO al 0,1%). * p <0.05.