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Protocolos de
metodologias
Laboratoriais Clássicas
para o diagnóstico de
hemoglobinopatias
Julho
2003
Detalhamento Técnico -1-
Índice
Preparação de Hemolisados............................................................................................03
Hemolisado Rápido..........................................................................................03
Solução de hemoglobina com clorofórmio.......................................................03
Solução de hemoglobina com KCN 0,05%.......................................................04
Testes Seletivos...............................................................................................................04
Resistência globular osmótica..........................................................................04
Análise à fresco da morfologia eritrocitária....................................................05
Eletroforese em pH alcalino.............................................................................06
Densitometria...................................................................................................08
Transparentização............................................................................................08
Técnicas Específicas.......................................................................................................09
Eletroforese em acetato de celulose pH neutro................................................09
Dosagem de Hb H.............................................................................................10
Pesquisa de corpúsculos de Heinz e agregados de Hb H................................10
Eletroforese quantitativa em acetato de celulose –
Dosagem de Hb A2....................................................................................11
Eletroforese de diferenciação em Agar-fosfato pH 6,2....................................12
Dosagem de hemoglobina fetal........................................................................13
Testes de precipitação de Hb instáveis -
Desnaturação pelo Calor............................................................................14
Precipitação por Isopropanol......................................................................15
Coloração intra-eritrocitária de Hb Fetal.......................................................16
Dosagem e Curva espectrofotométrica de Metahemoglobina.........................17
Dosagem de Metahemoglobina..................................................................17
Curva de Metahemoglobina........................................................................18
Eletroforese de cadeias polipeptídicas.............................................................19
pH alcalino.................................................................................................19
pH ácido.....................................................................................................20
Focalização isoelétrica.....................................................................................22
HPLC................................................................................................................25
Referências Bibliográficas................................................................................27
Detalhamento Técnico -3-
Devido à expectativa de que muitos serviços poderão se utilizar desses métodos para
realizarem com segurança o diagnóstico laboratorial das hemoglobinopatias, estão relacionados
aqui aqueles que foram caracterizados pela sua eficiência técnica em nosso laboratório ao longo
destes anos, no estudo de hemoglobinas anormais.
PREPARAÇÃO DE HEMOLISADOS:
Reativo hemolisante:
Saponina P.A. 1g
Água destilada 100 mL
Procedimento:
- Em placa de Kline colocar 1 volume de sangue com 1 volume de reativo hemolisante;
- A homogeneização deve se processar até a hemólise completa da mistura;
- Utilizar o hemolisado após 5 minutos, e no máximo 24 horas depois da sua preparação.
Procedimento:
- Centrifugar 1mL de sangue colhido com anticoagulante, com solução salina a 0,85%, a
1.500 rpm, durante 5 minutos e desprezar o sobrenadante para lavar os eritrócitos de 2 a 3 vezes,
com solução salina.
- Ao volume de eritrócitos lavados, adicionar outro de água destilada. Homogeneizar, e a
seguir adicionar um volume de clorofórmio, idêntico ao do hemolisado formado. Agitar
vigorosamente e centrifugar a 2.000 rpm, por 15 minutos.
- A solução de hemoglobina sobrenadante, ou hemolisado, é retirada por meio de pipeta
Pasteur e transferida para um tubo limpo com identificação da amostra. A concentração do
hemolisado, preparado conforme a metodologia apresentada, é variável entre 10 e 15 g/dl.
Detalhamento Técnico -4-
Este procedimento é utilizado para eluir as amostras colhidas em papel de filtro. Picotar o
círculo de papel de filtro (1/8) com a amostra, e colocar em placa de Kline ou tubo de ensaio com
50 µL de solução fisiológica a 0,85% aquecida a 37ºC e 100 µL desta solução hemolisante.
Deixar eluir por no mínimo 15 minutos. O procedimento auxilia na diminuição dos resíduos de
metaHb gerados pela coleta em papel.
TESTES SELETIVOS:
Princípio:
Técnica utilizada para detectar talassemias do tipo beta principalmente na forma
heterozigota, pois nesses casos os eritrócitos microcíticos são mais resistentes à hemólise nesta
solução. A resistência globular não é específica para talassemia beta heterozigota, já que
resultados positivos são encontrados também em anemias carenciais e outras hemoglobinopatias,
como nos heterozigotos para hemoglobina C. No entanto cerca de 97% dos portadores de
talassemia beta heterozigota apresentam positividade para esse teste.
Reagentes:
Solução estoque - NaCl a 10% - pH 7,4
NaCl 9,0 g
Na2HPO4 1,36g
NaH2PO4.H2O 0,28g
Água destilada q.s.p 100mL
Solução trabalho
NaCl 10% 36 mL
Água destilada q.s.p 1000mL
Procedimento
Em tubo de hemólise colocar 2,0 mL de solução de NaCl a 0,36% e 10 µL de sangue
total. Agitar por inversão, suavemente e aguardar 10 minutos para leitura.
Interpretação
Colocar o tubo de hemólise com a amostra na solução de NaCl a 0,36% a 2,0 cm de uma
folha branca com linhas negras. A resistência aumentada à hemólise do eritrócito torna a amostra
opaca e não se visualiza as linhas negras. Em amostras com resistência normal à hemólise
visualiza-se facilmente as linhas através da solução. Submeter as amostras com resistência
aumentada a exames posteriores para o diagnóstico da talassemia beta heterozigota. Figura 1.
Detalhamento Técnico -5-
Princípio:
É uma técnica utilizada para qualificação e quantificação de hemoglobinas normais e
grande parte das anormais. As diferentes mobilidades eletroforéticas das hemoglobinas anormais
são originadas por alteração de carga elétrica, causada por substituições de aminoácidos diferentes
nas cadeias formadoras das moléculas. As hemoglobinas anormais que se originam de mutações
onde não ocorre mudança de carga elétrica, migram na posição de Hb A. Nestes casos para a
caracterização dessas hemoglobinas, usam-se outros processos eletroforéticos.
Reagentes:
Tampão TRIS-EDTA-BORATO (TEB) pH 8,6
Tris hidroximetil aminometano 10,2 g
Ácido etilenodiaminotetracético 0,6 g
Ácido Bórico 3,2 g
Água destilada q.s.p 1000 mL
Conservar em geladeira
Corantes:
Negro de amido
Negro de amido 10B 0,5 g
Álcool metílico 45,0 mL
Ácido acético glacial 5,0 mL
Água destilada 45,0 mL
Ponceau
Ponceau S 0,5 g
Ácido tricloroacético 5,0 g
Água destilada q.s.p 100 mL
Solução descorante:
Ácido acético glacial. 100 mL
Metanol 50 mL
Água destilada q.s.p 1000 mL
Procedimento:
- Embeber as fitas de acetato de celulose por 15 minutos no mínimo e no máximo por 6
horas, em tampão TEB.
- Secar as fitas entre duas folhas de papel absorvente e colocá-las na cuba de eletroforese,
conectando-as com os compartimentos eletrolíticos através de tiras de papel mata-borrão, papel
filtro ou perfex.
- Aplicar as amostras de solução de hemoglobinas a 1,0 cm da extremidade da fita que
está em contato com o pólo negativo.
- Passar 300 volts por 30 minutos.
- Analisar as frações sem coloração e posteriormente corar com Negro de amido ou
Ponceau, embebendo as fitas em um dos corantes por 5 minutos, e posteriormente em solução
descorante por 30 minutos, com agitação da vasilha. A identificação segue mapa de migração de
Hemoglobinopatias. Figura 3. Em gel de Agarose (CELM) - obedece ao mesmo princípio acima
descrito, porém o gel vem pronto para aplicação e com tampão de corrida específico. Fornece boa
separação das frações de Hemoglobinas variantes. Figura 4
Detalhamento Técnico -7-
AS CC A? AF AS AA2 A? AS
Densitometria
Transparentização
Este procedimento é realizado para possibilitar a leitura das frações de hemoglobina pelo
densitômetro. Permite a conservação das fitas de acetato para registros.
Reagentes:
Metanol P. A. 50 mL
Solução de Transparentização:
Ácido acético 14 mL
Metanol 85 mL
Glicerina 1,0 mL
Procedimento:
- Utilizando uma pinça mergulhar as fitas de acetato de celulose, após descoradas, no
metanol por no máximo 60 segundos.
- Em seguida transferi-las para a solução ácido acético:metanol:glicerina por 40 segundos.
- Colocar a fita de acetato em lâmina de vidro e leva-la a estufa à 60ºC, para secar a fita,
por um tempo aproximado de 2 minutos.
Detalhamento Técnico -9-
TÉCNICAS ESPECÍFICAS
Princípio:
É uma técnica utilizada para identificação e quantificação das hemoglobinas H e Bart’s, que
apresentam perfil de migração em pH alcalino similar a proteínas plasmáticas.
Reagentes:
Tampão pH neutro
KH2PO4 3,11 g
Na2HPO4 1,66 g
Água destilada q.s.p. 1000 mL
Conservar em geladeira
Procedimento:
- Embeber as fitas de acetato de celulose por quinze minutos no mínimo em tampão pH
neutro. Colocar o mesmo tampão nos compartimentos eletrolíticos da cuba de eletroforese.
- Secar as fitas entre duas folhas de papel absorvente e colocá-las na cuba de eletroforese
conectando-as com os compartimentos eletrolíticos através de tiras de papel mata borrão ou perfex.
- Aplicar as amostras de hemoglobina a 1,0 cm da extremidade da fita que está em contato
com o pólo negativo.
- Passar 300 Volts por 30 minutos.
- Analisar as frações sem coloração, seguido mapa específico de identificação.
Interpretação:
Consultar o mapa de traçado de eletroforeses, conforme ilustrado no esquema da figura 5.
Hb H
Hb Bart’s
Outras hemoglobinas
Orige
+ Adulto normalAdulto m
RN normal RN
anormal anormal
DOSAGEM DE HEMOGLOBINA H
(Marengo & Rowe,1965, com modificações)
Reagentes:
São os mesmos utilizados na eletroforese em acetato de celulose pH 7,0. Utilizado como
método auxiliar na identificação das formas alfa talassemicas.
Procedimento:
- Aplicar 20 µl de solução de hemoglobinas com concentração entre 8 e 12%, em fita de
acetato de celulose com 5,7 cm de largura.
- Passar 300 Volts por 30 minutos.
- Após a separação das frações de hemoglobina H e A, recortá-las com tesoura e eluí-las em
tubos de ensaio contendo 3 mL de água destilada para hemoglobina H, e 15 mL de água destilada
para Hb A.
- Deixar eluir de duas a seis horas com agitação periódica.
- Ler as densidades ópticas (D.O.) em 415 nm, usando água destilada como branco.
Interpretação:
Valor normal de Hb H é 0%.
Princípio:
Os corpúsculos de inclusão de hemoglobina H são formados por cadeias beta oriundas da
desnaturação do tetrâmero. Após coloração esses corpúsculos apresentam-se dispostos
homogeneamente no interior dos eritrócitos como pequenos pontos azulados.
Reagentes:
Solução salina:
Cloreto de sódio 0,9 g
Água destilada q.s.p. 100 mL
Solução citrato:
Citrato de sódio 2,2 g
Água destilada q.s.p. 100 mL
Procedimento:
- Colocar 50 µl de sangue total em tubo de ensaio pequeno e adicionar 50 µl de solução de
azul Cresil brilhante. Agitar o tubo suavemente.
- Incubar o material a 37ºC por 30 e 60 minutos.
Detalhamento Técnico -11-
Ret
Princípio:
O aumento de Hb A2 na grande maioria dos casos está associado às talassemias beta
heterozigóticas. Porém em algumas condições patológicas, muitas de origem adquiridas, os níveis
dessa hemoglobina estão acima dos normais.
Reagentes:
São os mesmos utilizados na eletroforese em acetato de celulose pH alcalino para análise
qualitativa de hemoglobinas.
Procedimento:
- Aplicar 20 microlitros de solução de hemoglobinas com concentração entre 8 e 12 g%,
em fitas de acetato de celulose com 5,7 cm de largura.
- Passar 300 volts por 40 minutos.
Detalhamento Técnico -12-
Cálculo:
D.O. HbA2 X 100
% HbA2 = ----------------------------------
D.O. Hb A2 +(D.O. HbA x 5)
Interpretação:
Valores normais: 2,5% a 3,5%
Princípio:
A eletroforese em gel de ágar-fosfato pH 6,2 é específica para diferenciar alguns tipos de
hemoglobinas mais lentas que a Hb A, como por exemplo: Hb S e Hb D; Hb C e Hb E que em
eletroforese alcalina, migram em posições semelhantes, dificultando a correta identificação. Por
este método, as Hb S e Hb C se separam da Hb A, enquanto as Hb D e Hb E migram na mesma
posição da Hb A. Esse método permite também a caracterização semi-quantitativa de
hemoglobina fetal.
Reagentes:
Tampão Fosfato pH 6,2 - Para uso nos compartimentos eletrolíticos e confecção do gel.
Na2HPO4 2,02 g
NaH2PO4.H2O 7,66 g
Água destilada q.s.p 1000 mL
Conservar em geladeira
Gel de Ágar-Fosfato
Ágar-agar 500 mg
Tampão fosfato pH 6,2 25 mL
Procedimento:
- Em um erlenmeyer de 250 mL aquecer os componentes do gel de ágar-fosfato até
completa dissolução.
- Pipetar 5,0 mL do gel em 5 lâminas de microscópio. Deixar gelificar à temperatura
ambiente.
- Aplicar as amostras na porção média da lâmina, inserindo o aplicador e com cuidado
para não partir totalmente o gel
- Para conexão do gel com os compartimentos eletrolíticos usar folha dupla de papel de
filtro.
- Passar 100 volts por 30 minutos.
- Analisar inicialmente sem corar.
- Para melhor interpretação das frações corar com Ponceau ou Negro de Amido.
Interpretação:
Consultar o mapa de diferenciação das disposições de hemoglobinas em eletroforese pH
ácido (Figura 3).
Detalhamento Técnico -13-
Em gel de Agarose da CELM - obedece ao mesmo princípio acima descrito, porém o gel vem
pronto para aplicação e com tampão de corrida específico. Fornece boa separação das frações de
Hb variantes. Figura 7.
Hb F
Hb A
Hb S
Hb C
Figura 7. Gel de eletroforese ácida da CELM, com padrões de hemoglobinas normais e anormais.
Princípio:
A hemoglobina Fetal é alcali-resistente, enquanto que as Hb A, Hb A2 e os tipos
anormais são facilmente desnaturáveis por soluções alcalinas.
Esse método é sensível para detectar pequenas quantidades de hemoglobina Fetal.
Concentrações acima de 1% refletem aumento de hemoglobina Fetal. Em sangue de cordão
umbilical a quantidade da hemoglobina Fetal é aproximadamente 70 a 90% e o método para sua
quantificação deve ser readequado. Em indivíduos com talassemia beta homozigota a taxa desta
hemoglobina oscila entre 60 a 98%; na interação talassemia beta/Hb S, o valor varia entre 0,5 a
21,2%. Na talassemia Beta heterozigota, a hemoglobina Fetal pode estar normal ou discretamente
aumentada.
Reagentes:
Solução de ferricianeto de potássio (Drabkin)
Ferricianeto de potássio 0,20 g
Cianeto de potássio 0,20 g
Água destilada q.s.p 1000 mL
Procedimento:
- Diluir 0,3 mL da solução de hemoglobina em tubo contendo 5,0 mL da solução de
Drabkin. Homogeneizar por inversão.
- Colocar 2,8 mL da solução de hemoglobina diluída em um tubo rotulado como "Hb F".
Adicionar 0,2 mL da solução de hidróxido de sódio 1,2N e acionar o cronômetro. Agitar
cuidadosamente por 10 segundos.
Detalhamento Técnico -14-
- Após 2 minutos exatos da adição de Solução de hidróxido de sódio 1,2N, adicionar 2,0
mL da solução saturada de sulfato de amônio. Homogeneizar por inversão e deixar em repouso
por 5 a 10 minutos, no máximo.
- Filtrar o conteúdo do tubo "Hb F" em duplo papel de filtro.
- Preparar a solução padrão, colocando em um tubo de ensaio de 0,7 mL da solução de
hemoglobina diluída, 0,3 mL de água destilada e 1,0 mL da solução saturada de sulfato de
amônio. Transferir 0,5 mL desta solução para outro tubo e juntar 4,5 mL de solução de Drabkin.
A solução de hemoglobina total é 10 vezes mais diluída que a solução de hemoglobina alcali-
resistente.
- Ler a densidade óptica dos tubos padrão e "Hb F" em 540 nm, usando solução de
Drabkin como branco.
Cálculo: D.O. Hb F
% de Hb F = ----------------------- x 100
D.O. Padrão x 10
Interpretação:
Adultos normais apresentam valores entre 0,0 e 1,0% de hemoglobina fetal.
Princípio:
As cadeias de globina e o tetrâmero normal de Hb são estruturas altamente estáveis e
dependem da força coletiva de quatro fatores: um grande conteúdo helicóide que constitui 75%
da estrutura de cada cadeia polipeptídica; o firme ligamento entre o grupo heme e o polipeptídio
(globina); a localização interna de aminoácidos não-polares e hidrofóbicos, que mantém o
"pacote" de proteção ao grupo heme; os contatos alfa1-beta1 que estabilizam a integração entre as
cadeias alfa e beta.
A diminuição da estabilidade da hemoglobina pode ser resultante da alteração de
qualquer um dos quatro fatores, geralmente sensíveis quando expostos ao calor. Em um tampão
apropriado, a hemoglobina normal dificilmente se precipita quando submetida à alta temperatura
(50°C a 60°C), por determinado período de tempo de exposição; sob as mesmas condições as
hemoglobinas instáveis se desnaturam.
Reagentes:
Solução de fosfato monobásico de sódio 0,1 M
NaH2PO4.H2O 13,8 g
Água destilada q.s.p 1000 mL
NaCl 0,85%
Detalhamento Técnico -15-
Procedimento:
- Em um tubo de hemólise colocar 1 mL de sangue fresco, coletado com anticoagulante.
Centrifugar a 1.500 rpm e desprezar o plasma. Lavar os eritrócitos com NaCl 0,85% por duas
vezes. Hemolisar os eritrócitos com 5 mL de água destilada. Homogeneizar por seis vezes por
inversão.
- Transferir o hemolisado para um tubo maior, e adicionar 5 mL do tampão fosfato (pH
7,4), homogeneizar por seis vezes por inversão e centrifugar por 10 minutos a 1.500 rpm.
- Transferir 2 mL do sobrenadante para outro tubo e incubá-lo a 50°C, em banho-maria,
por uma hora, ou a 60oC por trinta minutos.
- Observar se houve precipitação a cada 10 minutos
Controle:
É fundamental o uso de uma amostra controle, obtida nas mesmas condições da amostra
teste.
Interpretação:
Em amostras de sangue com hemoglobinas normais é possível que ocorra discreto grau
de precipitação ao final de 60 minutos. O resultado é positivo quando a precipitação é em flocos e
em grande quantidade, geralmente após 20 minutos de incubação.
Precauções:
- As amostras a serem analisadas não devem exceder 72 horas após a coleta.
- O diagnóstico da Hb instável deve ser confirmado por outros testes específicos:
a) pesquisa de corpos de Heinz;
b) eletroforese de hemoglobina;
c) dosagem de metahemoglobina.
- A temperatura e o pH 7,4 do tampão são pontos críticos nesse teste.
Reagentes:
Solução tampão Tris/isopropanol pH 7,4
Tris-hidroximetil-aminometano 12,11 g
Isopropanol 170 mL
Água destilada q.s.p 1000 mL
Procedimento:
- Colocar 2 mL do tampão Tris/isopropanol em tubo de hemólise e incubar 37°C por 5
minutos.
- Adicionar ao tampão incubado, 0,2 mL da solução de hemoglobina que se pretende
examinar, preparada com clorofórmio. Agitar o tubo por inversão, arrolhar e deixar por uma hora
a 37°C.
- Observar se houve precipitação, a cada 10 minutos.
Detalhamento Técnico -16-
Interpretação:
A presença de Hb instável causa floculação nos primeiros 10 minutos, seguida de
precipitação.
Precauções:
- As hemoglobinas normais permanecem estáveis durante o processo. Entretanto, pode
ocorrer discreta precipitação em alguns casos, após 30-45 minutos. A Hb S é mais instável que a
Hb A.
- É necessário o uso de uma amostra controle, obtida nas mesmas condições que o teste.
- A temperatura e o pH do tampão são pontos críticos nesse teste.
-O diagnóstico de Hb instável deve ser confirmado por outros testes
específicos conforme citado no teste anterior.
Principio:
Esse método é baseado na diferença da capacidade de dissociação existente entre as Hb A
e Hb Fetal, em pH abaixo de 4,0. A Hb Fetal é ácido-resistente e por isso não é eluída das células,
corando-se facilmente com eritrosina ou similar, enquanto outros tipos de hemoglobinas, por
serem eluídas, não fixam o corante. Este teste é utilizado par diferenciar condições herdáveis com
presença de Hb F aumentada.
Reagentes:
Tampão citrato-fosfato pH 3,3
Ácido cítrico 0,1 M 100 mL
Fosfato di-sódio hidratado 0,2 M 30 mL
Deve ser preparado no momento do uso.
Procedimento:
- Fazer esfregaços finos e fixá-los com etanol a 80%, por cinco minutos. Lavar, a seguir,
com água corrente e secar ao ar.
- Introduzir os esfregaços em vasilha-suporte de lâminas contendo tampão citrato-fosfato
pH 3,3 previamente aquecido a 37ºC, por cinco minutos. Lavar com água corrente e secar ao ar.
- Corar com eritrosina por dois minutos. Lavar com água corrente, secar e examinar em
microscópio com aumento de 400 vezes.
Interpretação:
Os eritrócitos contendo Hb Fetal aparecem corados internamente, enquanto os outros que
não a contém permanecem sem coloração interna.
A coloração é homogênea quando todos os eritrócitos aparecem corados e podem, ser
encontrados em sangue de cordão umbilical de recém-nascidos, e portadores de persistência
hereditária de Hb Fetal.
A coloração é heterogênea quando existem duas populações eritrocitárias distintas, ou
seja, uma corada e a outra sem coloração, e esses são os casos das diferentes formas de beta
talassemia maior, com exceção dos portadores do genótipo talassêmico β°δ/β°δ. A figura 8 ilustra
uma lâmina de eritrócitos com hemoglobina fetal aumentada.
Detalhamento Técnico -17-
Princípio:
A presença de metahemoglobina pode ser originada por: excessiva formação de
metahemoglobina; diminuição da reconversão de metahemoglobina para globina; anormalidade
da porção globínica devido à substituição da histidina proximal ou distal por outro aminoácido.
As duas primeiras causas são evidenciadas por aumento de metahemoglobina normal,
enquanto a terceira se caracteriza pela elevação quantitativa de metaHb anormal - ou Hb M.
A excessiva formação de metahemoglobina pode ser induzida por vários tipos de drogas
(sulfas, fenacetina, anilina, etc.), bem como por determinados poluentes químicos (óxidos de
nitrogênio e enxofre, nitritos, nitratos, nitro-benzeno, etc.). Esses agentes promovem a formação
de peróxido de hidrogênio intracelularmente, convertendo a hemoglobina em metahemoglobina.
A diminuição da reconversão de metaHb para oxiHb é causada por deficiência
enzimática, durante o ciclo de Embden-Meyerhof, especificamente por funcionamento
inadequado do NADH ligado à metahemoglobina-redutase ou diaforase. Essa deficiência
enzimática pode ser herdada de forma recessiva.
A anormalidade da porção globínica é devido à alteração do gene estrutural que promove
a substituição da histidina proximal, ou distal, por outro tipo de aminoácido. A intensidade das
alterações fisiopatológica é diferente para Hb M Boston, Hb M Hyde Park, Hb M Iwate, Hb M
Milwalkee, Hb M Saskatoon.
Procedimento:
- Colocar em um tubo de ensaio 10 mL de tampão fosfato M/60, 0,2 mL de sangue.
Agitar e deixar em repouso por 2 minutos. Ler a DO em 630 - D1: Leitura da metahemoglobina
- Adicionar uma gota de cianeto neutralizado. Agitar e deixar em repouso por 2 minutos.
Ler a DO em 630 - D2: Leitura da cianometahemoglobina.
- Adicionar uma gota de ferricianeto de potássio 20% e uma gota de hidróxido de
amônio. Deixar em repouso por 2 minutos. Ler a DO em 620 - D3: Leitura da sulfohemoglobina.
- Transferir 2 mL do tubo, cuja solução foi submetida as três dosagens iniciais, para
outro contendo 8 mL de tampão fosfato M/15. Deixar em repouso por 2 minutos. Ler a DO em
540 - D4: Leitura da oxihemoglobina.
Branco: 10 mL de H2O
1 gota de ferricianeto de potássio 20%
1 gota de cianeto neutralizado
Cálculo:
1.) Meta Hb = D1 - D2
------------- x 100 = g%
D4
Interpretação:
Os valores normais para metahemoglobina não ultrapassam 3%, e os de
sulfohemoglobina no máximo 1%. Assim, é aconselhável realizar o teste usando uma ou duas
amostras de sangue colhidas nas mesmas condições e com Hb normal.
Precauções:
- Não pipetar as soluções que contenham cianeto.
- Obedecer rigorosamente o tempo de repouso.
Reagentes:
Solução de ferricianeto de potássio a 5%, preparada na hora do procedimento.
Interpretação:
As metahemoglobinas por defeito na globina apresentam picos de absorção diferentes ao
da metaHb A (normal).
Detalhamento Técnico -19-
Princípio:
A caracterização estrutural das hemoglobinas anormais é realizada em condições
especiais devido ao alto custo e às dificuldades inerentes aos métodos utilizados. Para dar
seqüência ao estudo de uma hemoglobina anormal não identificável pelos métodos de
qualificação e quantificação, utiliza-se a eletroforese de cadeias polipeptídicas. A separação
eletroforética de cadeias globínicas constitui uma análise pré-molecular, muitas vezes conclusiva
para o diagnóstico de hemoglobina anormal, sem que haja necessidade de se aplicar métodos de
disposição bidimensional de peptídeos e análises de aminoácidos, ou biologia molecular.
Reagentes:
Tampão Tris-EDTA-borato pH 8,6
Corante Negro de Amido
Uréia
2-mercaptoetanol
Procedimento:
- No dia anterior ao teste preparar o tampão trabalho, misturando 36 g de uréia e 70 mL
de tampão Tris-EDTA-borato pH 8,6 (tampão Tris-uréia), em um "becker". Deixar a solução
homogeneizando em agitador magnético, até o momento do uso, em temperatura ambiente. O
tempo de dissolução deve ser superior a 12 horas.
- Preparar as amostras misturando 50 µL do tampão Tris-uréia, 50 µL de 2-
mercaptoetanol e 50 µL de hemolisado preparado com clorofórmio, em um pequeno tubo. Deixar
em repouso por 1hora à temperatura ambiente.
- Adicionar 6,4 mL de 2-mercaptoetanol ao tampão Tris-uréia restante, misturar bem e
colocar a solução tampão Tris-uréia-mercaptoetanol nos compartimentos eletrolíticos, reservar
quantidade suficiente dessa solução para embebimento do acetato de celulose por 1 hora.
- Retirar o excesso da solução tampão do acetato entre duas folhas de papel de filtro e
colocá-lo bem esticado na cuba de eletroforese, fazendo conexões com os compartimentos
eletrolíticos com papel filtro duplo.
- Aplicar as amostras na porção superior do acetato, próximo ao pólo positivo da cuba.
- Passar 110 volts por 40 minutos; após este tempo alterar a Voltagem para 220 volts e
deixar por mais 20 minutos.
- Corar as fitas com Negro de amido ou outro corante de proteínas. Colocar em solução
descorante.
Controle:
É importante realizar esse processo comparando com cadeias polipeptídicas de
hemoglobinas já caracterizadas, como por exemplo: Hb AS, Hb AC, ou Hb SC. A figura 9 ilustra
uma fita de acetato de celulose de uma eletroforese de cadeias globínicas conforme descrito para
identificação das globinas normais e anormais.
Detalhamento Técnico -20-
Interpretação:
Deve seguir mapas de migração específicos como ilustrado na figura 10.
βA
βS
βC
αA
Figura 10. Representação esquemática das mobilidades relativas de algumas cadeias globínicas
(Modificado de Dacie & Lewis, 1995).
Reagentes:
Solução estoque gel poliacrilamida 60:0,4
Acrilamida 15 g
Bis- acrilamida 0,1 g
H2O q.s.p. 25 mL
Detalhamento Técnico -21-
Uréia 8M
Uréia 12 g
H2O q.s.p. 25 mL
2 – Mercaptoetanol 1M
2 - Mercaptoetanol 35 µL
H2O q.s.p. 500 µL
Preparação da amostra:
- Centrifugar 100 µL de sangue com solução salina a 0,85%, a 1.500 rpm, durante 5
minutos e desprezar o sobrenadante. Repetir no mínimo por 4 vezes. Ao volume de eritrócitos
lavados, adicionar 10x o volume de água destilada para romper os eritrócitos e liberar a
hemoglobina.
- Preparar as amostras para aplicação misturando 1,5 µL do hemolisado, descrito acima,
com 10 µL do tampão de amostra.
Procedimento:
- Após a realização das pré-corridas trocar novamente o tampão de corrida, aplicar as
amostras e submeter a corrente constante de 50mA (200V) por 3 horas.
Detalhamento Técnico -22-
Interpretação:
A interpretação das cadeias polipeptídicas deverá ser feita seguindo o mapa representado
na figura 10.
Controle:
É importante a utilização de uma amostra controle como a Hb AC. A figura 11 ilustra um
gel de uma eletroforese de cadeias globínicas em pH ácido.
Cadeia γA
Cadeia γG
Cadeia βA
Cadeia βMutante
Cadeia δ
Cadeia αA
Figura 11. Gel de poliacrilamida 12% para eletroforese de cadeias polipeptídicas em pH ácido.
Princípio:
Método específico para o fracionamento de espécies moleculares de Hb que diferem
somente nas suas quantidades de cargas. Assim, como a separação não é devida a qualquer efeito
seletivo do tamanho da molécula, o seu transporte através do meio se faz com ótima resolução,
separando as macromoléculas por seu ponto isoelétrico com diferenças de unidades de pH de até
0,001.
Preparação do gel:
- Pesar 22 mg de agarose em um erlenmeyer de 25 ou 50 mL, e adicionar 13,2 mL de água
deionizada.
- Colocar o erlenmeyer dentro de um Becker de 100 mL com água em ebulição e rolhas de
borracha no fundo e observar constantemente a dissolução da agarose que deverá ocorrer dentro
de 5 a 10 minutos.
- Após este período adicionar as anfolinas nas seguintes proporções: 0,6 mL de pH 5-8;
0,4 mL de pH 3-10.
- Colocar o gel rapidamente em placas de vidro pois a polimerização é rápida.
- Enquanto o gel se solidifica, as amostras devem ser preparadas.
Procedimento:
- Pré-focalização: A placa com o gel deverá ser colocada em cuba refrigerada. Na
extremidade catódica da placa colocar uma tira de papel de filtro embebido em tampão NaOH. Na
extremidade anódica, o papel de filtro deverá estar embebido em tampão ácido fosfórico. A
seguir, conectar os eletrodos e aplicar corrente de 5 mA por 10 minutos, para que se forme o
gradiente de pH. Após este período, desconectar os eletrodos e remover a placa para aplicação das
amostras.
- Embeber pequenas tiras de papel de filtro com as amostras e colocar sobre o gel, em sua
porção mediana. As tiras de papel filtro devem estar unidas por fita adesiva para facilitar o
manuseio.
- Focalização: Aplicar corrente de 5 mA até que as amostras sejam transferidas do papel
para o gel. Neste momento, retirar as tiras de papel de filtro e aumentar a potência para 8 mA.
Acompanhar a migração com ajuste da miliamperagem, que deve se manter constante, até
perfeita separação das amostra, o que deverá ocorrer por volta de 40 minutos.
Interpretação:
Após o fracionamento é possível visualizar numa amostra normal as Hb A, Hb A2, Hb F
e Hb A1c, essa última com migração mais rápida que a Hb A. A resolução dessa técnica é
superior à dos métodos eletroforéticos convencionais, permitindo a separação de
metahemoglobinas e sulfohemoglobinas dentre outras. A identificação das frações segue mapa
específico de migração esquematizado na figura 12.
Detalhamento Técnico -24-
Procedimento:
A) Para Kit Beta Talassemia Heterozigota: Misturar, em um tubo, 5 µL de sangue total
com 1,0 mL de solução hemolisante fornecida no kit de análise.
B) Para Kit Sickle Cell: Misturar 5 µL de sangue total com 1 mL de água MiliQ.
Interpretação:
A) Para Kit Beta Talassemia Heterozigota: a quantificação das diferentes frações de
hemoglobina em uma amostra é realizada a partir dos valores de porcentagem e tempo de retenção
comparados com os valores de calibração específicos fornecidos pelo fabricante.
B) Para Kit Sickle Cell: a caracterização das diferentes frações de hemoglobina é realizada
comparando-se o tempo de retenção com os valores de calibração específicos fornecidos pelo
fabricante
A figura 13 ilustra cromatogramas obtidos pelo Variante BIO-RAD, nos dois Kits acima
mencionados.
Detalhamento Técnico -26-
Figura 13. Cromatogramas obtidos pelo equipamento Variant- BIO-RAD. As Setas indicam os
picos da Hb S.
Detalhamento Técnico -27-
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
ALTER B.P.; GOOF, S.C.; EFREMOV, G.D.; GRAVELY, M.E.; HUISMAN, T.H.J. Globin
chain electrophoresis: a new approach to the determination of the Gγ/Aγ ratio in fetal
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CARREL, R. W.; KAY, R. A simple method for detectetion of unstables hemoglobins. British
Journal of Hematology, v. 23, p. 615-619, 1972.
DACIE, J. V.; LEWIS, S.M. “In: Practical Haematology” 6th ed. Churchill, London, p.516,
1985.
SILVESTRONI, E.; BIANCO, I. Screening for microcytemia in Italy: analysis of data collected in
the past 30 years. Am. J. Hum. Genetic, v. 27, p. 198, 1975.
Detalhamento Técnico -28-
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p. 440-442, 1968.