A.

DASAR TEORI

Pewarnaan spora pada kegiatan pewarnaan spora dilakukan untuk mengetahui ada
atau tidaknya spora pada bakteri. Spora dapat terbentuk saat kondisi tidak memungkinkan
pertumbuhan bakteri. Spora juga mampu mengikat warna lebih cepat dan sukar
melepaskannya (Fardiaz 1989). Spora bakteri merupakan bentuk bakteri yang sedang dalam
keadaan mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari lingkungan luar.Bakteri dalam
bentuk spora merupakansuatu fase dimana kedua mikroorganisme itu berubah bnetuk untuk
melindungi diri terhadapfaktor lingkungan luar yang tidak menguntungkan (Dwidjoseputro,
2005).
Menurut Pelczar (1986) menyatakan bahwa spora merupakan bagian dari tubuh bakteri
yang secara metabolik mengalami dormansi dan dihasilkan pada saat fase lanjut dalam
pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti induknya (asalnya) yaitu sel vegetatif, selain itu
spora memiliki sifat yang tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi. Pada beberapa
spesies bakteri memiliki kemampuan untuk membentuk spora, dimana spora ini dihasilkan
di bagian dalam tubuh vegetatifnya. Berdasarkan letaknya spora dapat ditemukan di bagian
tengah (sentral), ujung (terminal), dan tepi. .

Spora bakteri umumnya disebut endospora, karena spora dibentuk di dalam sel. Ada
dua tipe sel spora yang terbentuk, yang pertama terbentuk di dalam sel, yang disebut
dengan endospora dan spora yang terbentuk di luar sel yang disebut eksospora. Spora
bakteri tidak berfungsi untuk perkembangbiakan. Terdapat beragam bentuk spora yaitu
bulat atau bulat memanjang yang mana hal tersebut tergantung pada jenis spesiesnya.
Ukuran endospora lebih kecil atau lebih besar daripada diameter sel induknya. Kebanyakan
bakteri pembentuk spora adalah penghuni tanah, tetapi spora bakteri dapat tersebar dimana
saja (Jutono,1980).

Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri diperlukan
pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang
dimaksudkan oleh Volk & Wheeler tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau
malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetative juga diwarnai dengan
larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative ini berwarna merah. Dengan demikian ada
atau tidaknya spora dapat teramati. Zat pewarna yang digunakan pada pewarnaan spora ini
tidak terlepas dari sifat kimiawi dinding spora itu sendiri.Semua spora bakteri mengandung
asam dupikolinat.Yang mana subtansi ini tidak dapat ditemui pada sel vegetatif bakteri,
atau dapat dikatakan, senyawa ini khas dimiliki oleh spora.Dalam proses pewarnaan, sifat
senyawa inilah yang kemudian dimanfaatkan untuk di warnai menggunakan pewarna
tertentu, dalam hal ini larutan hijau malakit. Sedangkan menurut pelczar (1986), selain
subtansi di atas, dalam spora bakteri juga terdapat kompleks Ca2+dan asam dipikolinan
peptidoglikan.
Proses pembentukan spora di dalam sel vegetatif bakteri, terjadi dalam beberapa
tahapan, secara singkat bagan proses pembentukan spora bakteri di atas dapat dijelaskan
sebagai berikut:
a. Terjadi kondensasi DNA pada bakteri yang akan membentuk spora.
b. Terjadi pembalikan membran sitoplasma, sehingga, lapisan luar membran kini
menjadi lapisan dalam membran (calon) spora.
c. Pembentukan korteks primordial (calon korteks)\
d. Pembentukan korteks
e. Spora terlepas dan menjadi spora yang bebas, pada tahap 5 ini,jika spora
mendapatkan lingkungan yang kondusif, maka ia bisa tumbuh menjadi satu sel
bakteri yang baru

Apabila pewarnaan spora bakteri berhasil , maka sel vegetatif bakteri akan berwarna
merah. Dan apabila sel membentuk spora, maka spora hasil pewarnaan akan berwarna
hijau(Hastuti, 2015).
B. ALAT DAN BAHAN

Alat Bahan

1. Mikrosokop 1. Biakan murni bakteri

2. Kaca benda 2. Aquades steril
3. Lampu spiritus 3. Larutan hijau malakit 5%
4. Mangkuk pewarna 4. Larutan safranin
5. Kawat penyangga 5. Kertas lensa
6. Pipet 6. Alkohol 70%
7. Pinset 7. Lisol
8. Botol penyemprot 8. Sabun cuci
9. Korek api
10. Lap
11. Kertas tissue

C. PROSEDUR

D. Kaca benda bersih dilewatkan di atas nyala api lampu spiritus lalu ditetesi dengan
E. aquades steril

Inokulum bakteri yang akan diperiksa diambil secara aseptik lalu diletakkan di atas
F.
tetesan aquades
G.

H. Inokulum bakteri yang sudah diambil diratakan perlahan dan ditunggu sampai
I. kering

J.
Sediaan inokulum bakteri yang sudah kering difiksasi dengan cara dilewatkan di
K.
atas nyala api lampu spiritus dengan cepat
 Sediaan ditetesi dengan larutan hijau malakit lalu dipanaskan di atas nyala api
spiritus selama 3 menit menggunakan pinset (Jika sediaan mengering, ditambahkan
dengan tetesan larutan hijau malakit )

Sediaan yang telah dipanaskan diletakkan di atas mangkuk pewarna menggunakan

kawat penyangga dan dibiarkan sampai dingin

Kelebihan laurtan hijau malakit dicuci dengan air kran yang dimasukkan pada botol
penyemprot

Sediaan yang telah dicuci ditetesi dengan larutan safranin dan dibiarkan selama 3
menit

Kelebihan larutan safranin dicuci dengan air keran yang dimasukkan pada botol
penyemprot

Sediaan yang telah dicuci dikeringkan dengan kertas penghisap dan diamati dengan
mikroskop

Hasil
D. HASIL PENGAMATAN

Kode Ada/tidak ada

Bentuk spora Letak spora Gambar
Koloni spora

A Ada Bulat Bebas

B Ada Oval Bebas

E. ANALISIS

Kedua koloni bakteri yang telah diamati pada praktikum pewarnaan spora bakteri ini
menunjukkan hasil yang sedikit berbeda pada bentuk spora antara bakteri koloni kode A
dan bakteri koloni kode B. Setelah dilakukan pewarnaan terhadap kedua bakteri tersebut, di
dapatkan hasil bahwa koloni bakteri kode A mempunyai spora berbentuk bulat dan terletak
bebas. Sedangkan pada koloni bakteri kode B mempunyai spora dengan bentuk oval dan
terletak bebas. Menurut teori yang ada, adanya spora ditandai dengan perubahan warna sel
vegetatif menjadi merah dan spora berwarna hijau.

F. PEMBAHASAN

Pada praktikum pewarnaan spora bakteri, biakan yang digunakan adalah biakan yang
sudah berumur lebih kurang 1 minggu. Hal ini dilakukan karena spora akan terbentuk pada
kondisi lingkungan yang sangat tidak mendukung kehidupan bakteri, seperti kekurangan
nutrisi dan perubahan temperatur. Ketika umur medium sudah mencapai ± 1 minggu,
bakteri mulai memasuki fase stationer dimana ketersediaan nutrisi sudah mulai berkurang
dan hasil metabolisme sekunder seperti toksik dan pigmen mulai banyak diproduksi oleh
sel bakteri. Beberapa bakteri akan mengalami kematian dan beberapa bakteri mampu
membentuk spora untuk melindungi dirinya dari keadaan yang kurang menguntungkan
tersebut. Spora pada bakteri tidak berwarna sehingga perlu dilakukan pewarnaan khusus
untuk melihat dan mengidentifikasinya.
Prinsip dari percobaan ini adalah pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora
sehingga zat warna utama dapat masuk masuk ke dalam spora sehingga berwarna hijau.
Melalui pendinginan warna utama akan terperangkap di dalam spora,dengan pencucian zat
warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas sehingga pada saat pewarnaan kedua
(safranin), sel vegetatif akan berwarna merah (Dwidjoseputro, 2005).
Ada 2 jenis bakteri yang dapat membentuk spora:
1. Clostridium adalah bakteri yang bersifat anaerob.
2. Bacillus adalah bakteri yang bersifat aerob.
Stuktur endospora berbeda-beda untuk setiap spesies, Clostridium botullinum:
sporanya subterminal, Clostridium tetani: sporanya terminal, Bacillus anthracis: sporanya
central. Endospora bakteri merupakan struktur yang paling tahan terhadap lingkungan yang
ekstrim misalnya kering, kepanasan, dan keadaannya asam. Pewarnaan spora tidak dapat
diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein
adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Untuk pewarnaan spora, perlu
dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora (Razali, 1987).
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri
terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik bagi mereka, maka
pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora juga disebut endospora yang masih
terletak didalam sel bakteri. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk
daripada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif, Sporulasi (proses pembentukan
spora) dapat dicegah apabila selalu diadakan pemindahan biakan ke medium yang baru
(Margareth, 1998).
Pewarnaan endospora dengan larutan hijau malakit, bakteri penghasil endospora akan
menunjukkan reaksi positif yaitu larutan hijau malakit akan berikatan dengan spora
sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup atau safranin tidak bisa
diikat oleh endospora. Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora maka
larutan hijau malakit tidak dapat diikat (Pearce, 2009).
 Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore
coat, yang terdiri dari cross-linked keratin. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih
besar daripada sel, dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak
endosporanya. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan
untuk identifikasi. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang
letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian letak el vegetatif diantara ujung
dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah
dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupun kecil dari sel
vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin (Peleszar dan Chan,
2008).
Berdasarkan data hasil pengamatan pada bakteri koloni A berbentuk coccus dan
berwarna merah dengan beberapa gumpalan kecil berbentuk bulat dan berwarna hijau di
sekitar sel bakteri letak spora bebas. Bentukan bulat yang berwara hijau merupakan spora
dari koloni bakteri yang diakibatkan oleh pewarna hijau malakit sedangkan bentukan
coccus yang berwarna merah merupakan sel dari koloni bakteri diakibatkan oleh pewarna
safranin. Pada bakteri koloni B berbentuk bacil dengan bentuk oval dengan letak spora
bebas. Pada pewarnaan spora bakteri ini digunakan pewarna hijau malakit dan safranin.
Dalam prosesnya, larutan hijau malakit diteteskan pada sediaan yang telah difiksasi
kemudian dipanaskan. Proses pemanasan ini menyebabkan lapisan luar dari spora
mengembang sehingga pori-pori dapat membesar dan zat warna (larutan hijau malakit)
meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri dan menjadikan spora bakteri nampak
hijau (Pelczar, 1986). Setelah dipanaskan, dilakukan pendinginan yang bertujuan untuk
melekatkan warna hijau pada spora bakteri. pewarna kedua (safranin) dapat meresap pada
sel vegetatif. Adanya pewarnaan kedua ini menyebabkan sel vegetatif bakteri berwarna
merah.
G. KESIMPULAN
1. Pewarnaan endospora dengan larutan hijau malakit, bakteri penghasil endospora akan
menunjukkan reaksi positif yaitu larutan hijau malakit akan berikatan dengan spora
sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup atau safranin tidak
bisa diikat oleh endospora. Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora
maka larutan hijau malakit tidak dapat diikat.
2. Bakteri A yang berbentuk coccus memiliki spora berbentuk bulat dan letaknya bebas.
Bakteri B yang berbentuk basil memiliki spora berbentuk oval dan letaknya bebas.
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Fardiaz S. 1989. Mikrobiologi pangan. Pusat antaruniversitas. IPB: Bogor

Jutono, dkk.1980. Pedoman praktikum Mikrobiologi umum (Untuk Perguruan Tinggi).

Yogyakarta : UGM Press
Margareth, F. W. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Pearce, E. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Terjemahan dari: Anatomy and
Physiology for Nurses (Halaman 200). Penerjemah: Yuliani Sri. Jakarta: PT Gramedia
Pustaka Utama.
Pelczar, M. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Universitas Indonesia. Halaman: 2-
3, 140-142.
Pelezsar, M. dan Chan, ECS. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2. Jakarta: Universitas
Indonesia Press.
Razali, U. 1987. Mikrobiologi Dasar. Bandung: FMIPA UNPAD.
Volk, W.A., dan Wheeler, M.F. 1988. Mikrobiologi Dasar. Jilid II. Terjemahan
Soenartomo Adisoemarto. Penerbit Erlangga. Jakarta.
 LAPORAN PRAKTIKUM
“ PEWARNAAN SPORA BAKTERI”

Untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Mikrobiologi

Yang dibimbing oleh Bapak Agung Witjoro, S.Pd, M.Kes
Disusun Oleh :

Kelompok 6 Offering B 2016

Amalia Nurul A 160341606078

Devi Septiani 160341606082

Laila Nur A 160341606022

Lingga Mofa D.L 160341606034

Moniq Indah 160341606083

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN PENGETAHUAN ALAM

JURUSAN BIOLOGI

Februari 2018