UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

EFICACIA DE UN DESINFECTANTE BIODEGRADABLE A BASE DE

RESIDUOS DE NARANJA Y QUINUA EN EL CONTROL DEL CRECIMIENTO
DE Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

TESIS

Presentado por el Bachiller:

CORILLA FLORES, Denis Dante

Para Optar el Título Profesional de:

INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

HUANCAYO - PERÚ

2017
 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

JURADO EXAMINADOR

______________________________ _____________________________
Dra. Nora Marina Veliz Sedano Ing. Wagner Vásquez Orihuela
Presidente Secretario

_______________________________ _____________________________
M.Sc. Victoria Ancasi Concha Dr. Rodolfo Tello Saavedra
Jurado Jurado

______________________________
M.Sc. Norma Gamarra Mendoza
Jurado

HUANCAYO PERÚ

2017
ASESOR

Ing. M.Sc. Emilio Fredy Yábar Villanueva

DEDICATORIA

A mis padres

Quienes permanentemente me apoyaron con espíritu alentador, contribuyendo

incondicionalmente a lograr las metas y objetivos propuestos.
Por ese inmenso amor, único, incomparable mi motor.
AGRADECIMIENTO

Mi gratitud, principalmente está dirigida al dios todopoderoso por haberme dado la

existencia y permitido llegar hasta este punto de mi carrera.

A la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del

Centro del Perú, por acogerme en sus aulas dándome la oportunidad de estudiar y ser un
profesional.

A mi asesor de tesis, MSc. Emilio Fredy Yábar Villanueva, por su dedicación ya que,
gracias a sus conocimientos, experiencia, paciencia y su motivación se logró terminar esta
investigación.

A todas las personas que contribuyeron para el logro de esta investigación, agradezco de
forma sincera su valiosa colaboración.

"El agradecimiento es la memoria del corazón." – Lao-tse

 ÍNDICE

Pág.

RESUMEN
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 1
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...................................................................... 3
2.1. Características de la naranja (citrus sinensis) .............................................. 3
2.1.1. Partes del fruto................................................................................... 4
2.1.1.1. Flavedo o epicarpio ............................................................ 4
2.1.1.2. Albedo o Mesocarpio.......................................................... 4
2.1.1.3. Endocarpio .......................................................................... 4
2.1.1.4. Semillas y cortezas ............................................................. 5
2.1.2. Composición química de los residuos de naranja ............................ 5
2.1.2.1. Composición química de la harina de cáscara de naranja .. 5
2.1.2.2. Composición química de la semilla de naranja .................. 6
2.1.3. Características de la cáscara y semilla de naranja ............................ 7
2.1.3.1. Extractos cítricos ................................................................ 8
2.1.3.2. Metabolitos secundarios ..................................................... 9
2.2. Características de la quinua ......................................................................... 11
2.2.1. Saponinas........................................................................................... 12
2.2.1.1. Química de las saponinas ................................................... 12
2.2.1.2. Actividades antifúngica y antilevaduras ............................. 13
2.2.1.3. Actividad antibacteriana ..................................................... 13
2.3. Microorganismos indicadores de higiene .................................................... 14
2.3.1. Escherichia coli ................................................................................. 15
2.3.1.1. Hábitat ................................................................................ 16
2.3.1.2. Incidencia de E. coli en alimentos ...................................... 16
2.3.1.3. Características de crecimiento y supervivencia de
Escherichia coli ................................................................. 17
2.3.1.3.1. Temperatura....................................................... 17
2.3.1.3.2. pH ...................................................................... 18
2.3.1.3.3. Refrigeración ..................................................... 18
2.3.1.3.4. Desinfectantes ................................................... 18
 2.3.2. Staphylococcus aureus ...................................................................... 18
2.3.2.1. Hábitat ................................................................................ 19
2.3.2.2. Incidencia de S. aureus en alimentos .................................. 20
2.3.2.3. Características de crecimiento y supervivencia de
Staphylococcus aureus ..................................................... 20
2.3.2.3.1. Temperatura....................................................... 20
2.3.2.3.2. pH ...................................................................... 21
2.3.2.3.3. Refrigeración ..................................................... 21
2.3.2.3.4. Desinfectantes ................................................... 21
2.4. Desinfección ................................................................................................ 22
2.4.1. Factores que influyen en la desinfección .......................................... 22
2.4.1.1. Tipo de desinfectantes ........................................................ 22
2.4.1.2. Temperatura ........................................................................ 23
2.4.1.3. pH ....................................................................................... 23
2.4.1.4. Formulación ........................................................................ 24
2.4.1.5. Número de Microorganismos ............................................. 24
2.4.1.6. Naturaleza del organismo ................................................... 24
2.4.1.7. Tiempo ................................................................................ 25
2.5. Desinfectantes ............................................................................................. 25
2.5.1. ¿Cómo escoger un desinfectante? ..................................................... 26
2.5.2. Mecanismos de acción de los agentes desinfectantes ....................... 26
2.5.3. Grupos de desinfectantes ................................................................... 27
2.5.3.1. Halógenos y sus compuestos .............................................. 27
2.5.3.1.1. Cloro .................................................................. 28
2.5.3.1.2. Yodo .................................................................. 28
2.5.3.1.3. Compuestos de Amonio cuaternario ................. 28
2.5.3.1.4. Compuestos fenólicos........................................ 28
2.5.3.1.5. Alcoholes ........................................................... 29
2.6. Los ácidos orgánicos y su actividad antimicrobiana ................................... 29
2.7. Escala de Mc Farland .................................................................................. 30
2.8. Análisis químico de plantas aromáticas ...................................................... 31
2.8.1. Lieberman Burchard ........................................................................... 31
2.8.2. Prueba de Baljet.................................................................................. 32
2.8.3. Prueba de Hidroxamato férrico .......................................................... 32
 2.8.4. Prueba de Shinoda .............................................................................. 33
2.8.5. Prueba de cloruro férrico ................................................................... 33
2.8.6. Prueba de antrona .............................................................................. 34
2.8.7. Prueba de Dragendorff ...................................................................... 35
2.8.8. Prueba de espuma .............................................................................. 35
2.8.9. Desinfectante biodegradable Kilol L-20 ........................................... 35
III. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 36
3.1. Lugar de ejecución ...................................................................................... 36
3.2. Equipos y materiales .................................................................................. 36
3.2.1. Equipos de laboratorio....................................................................... 36
3.2.2. Materiales .......................................................................................... 36
3.2.3. Materia prima, reactivos y medios de cultivo ................................... 37
3.3. Métodos de análisis ..................................................................................... 38
3.3.1. Preparación del desinfectante
A base de residuos de naranja.......................................................... 38
3.3.1.1. Extracción ........................................................................... 38
3.3.2. Medición de parámetros .................................................................... 39
3.3.3. Preparación del desinfectante
A base de residuos de quinua .......................................................... 39
3.3.3.1. Extracción ........................................................................... 39
3.3.4. Medición de parámetros .................................................................... 40
3.3.5. Caracterización química de los extractos .......................................... 40
3.3.6. Preparación del cultivo axénico ........................................................ 42
3.3.7. Preparación del inóculo ..................................................................... 42
3.3.8. Evaluación del desinfectante
A base de residuos de naranja y quinua ........................................... 43
3.3.9. Lectura e interpretación ..................................................................... 44
3.4. Metodología experimental ........................................................................... 46
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES ................................................................. 50
4.1. Análisis de los solventes antes y durante la extracción ............................... 50
4.2. Obtención de los extractos .......................................................................... 51
4.3. Pruebas químicas preliminares .................................................................... 56
4.4. Evaluación de la eficacia del desinfectante ................................................. 60
4.4.1. Escherichia coli ................................................................................. 60
 4.4.1.1. Desinfectante a base de etanol al 70% y éter de petróleo ... 60
4.4.1.2. Ensayo control con el desinfectante Kilol L-20 ................. 63
4.4.2. Staphylococcus aureus ...................................................................... 68
4.4.2.1. Desinfectante a base de etanol al 70% y éter de petróleo ... 68
4.4.2.2. Ensayo control con el desinfectante Kilol L-20 ................. 70
V. CONCLUSIONES ............................................................................................ 77
VI. RECOMENDACIONES .................................................................................. 79
VII. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 80
VIII. ANEXOS……………………………………………………………………..90
 INDICE DE TABLAS

Tabla1. Composición químico proximal de la harina de cáscaras de naranja ........... 5

Tabla 2. Contenido de micronutrientes de harinas de cáscara de naranja ................. 6

Tabla 3. Fibra dietética en harinas de cáscara de naranja .......................................... 6

Tabla 4. Cantidad de aceite de semilla de naranja ..................................................... 7

Tabla 5. Cantidades de aceite y ácidos de semilla de naranja ................................... 7

Tabla 6. Mecanismo de acción de agentes desinfectantes ......................................... 27

Tabla 7. Análisis químico de los solventes de extracción ......................................... 50

Tabla 8. Resultado de la medición periódica de los extractos ................................... 50

Tabla 9. Peso obtenido y rendimiento de los residuos de quinua de

la fracción etérea ......................................................................................... 52

Tabla 10. Peso obtenido y rendimiento de cáscara de naranja

de la fracción etérea .................................................................................... 53

Tabla 11. Peso obtenido y rendimiento de la semilla de naranja

de la fracción etérea .................................................................................... 53

Tabla 12. Peso obtenido y rendimiento de los residuos de quinua

de la fracción etanólica .............................................................................. 54

Tabla 13. Peso obtenido y rendimiento de cáscara de naranja

de la fracción etanólica ............................................................................... 54
Tabla 14. Peso obtenido y rendimiento de semilla de naranja
de la fracción etanólica ............................................................................... 55

Tabla 15. Resultados de las pruebas químicas preliminares a cada extracto .......... 56

Tabla 16. Ufc de Escherichia coli residual tratados con el desinfectante

natural con etanol al 70% ......................................................................... 61

Tabla 17. Ufc de Escherichia coli residual tratados con el desinfectante

natural obtenido con éter de petróleo ....................................................... 62

Tabla 18. Ensayo control con el desinfectante Kilol L-20 para E. coli ..................... 63

Tabla 19. Análisis de varianza del porcentaje de inhibición E. coli.......................... 64

Tabla 20. Ufc de Staphylococcus aureus residual tratados con el desinfectante

natural obtenido con etanol al 70% ........................................................... 68

Tabla 21. Ufc de Staphylococcus aureus residual tratados con el desinfectante

natural obtenido con éter de petróleo ........................................................ 70

Tabla 22. Ensayo control con el desinfectante Kilol L-20 para E. aureus ................ 70

Tabla 23. Análisis de varianza del porcentaje de inhibición S. aureus ..................... 71

 INDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Sección transversal de una fruta cítrica. ..................................................... 3

Figura 2. Fórmula molecular del isopreno................................................................. 10
Figura 3. Fórmula estructural de fenol ...................................................................... 11
Figura 4. Quinua de la variedad blanca Junín ........................................................... 12
Figura 5. Vista microscópica de Escherichia coli...................................................... 15
Figura 6. Colonias de Escherichia coli ...................................................................... 17
Figura 7. Vista microscópica de Staphylococcus aureus ........................................... 19
Figura 8. Colonias de Staphylococcus aureus ........................................................... 20
Figura 9. Reacción química de la prueba de Lieberman y Burchard ........................ 31
Figura 10. Reacción química de la prueba de Baljet ................................................. 32
Figura 11. Reacción química de la prueba de Hidroxamato férrico .......................... 32
Figura 12. Reacción química de la prueba de Shinoda.............................................. 33
Figura 13. Reacción química de la prueba de cloruro férrico ................................... 34
Figura 14. Reacción química de la prueba de antrona ............................................... 34
Figura 15. Reacción de la prueba de Dragendorff ..................................................... 35
Figura 16. Procedimiento para la evaluación de la eficacia del desinfectante .......... 45
Figura 17. Esquema del diseño experimental para E. coli......................................... 47
Figura 18. Esquema del diseño experimental para S. aureus .................................... 48
Figura 19. Método de extracción del desinfectante natural en E. coli....................... 65
Figura 20. Carga microbiana de E. coli residual ....................................................... 66
Figura 21. Desinfectantes utilizados en E. coli ......................................................... 66
Figura 22. Tiempo de acción del desinfectante en E. coli ......................................... 67
Figura 23. Método de extracción del desinfectante natural en S. aureus .................. 72
Figura 24. Carga microbiana de S. aureus residual ................................................... 73
Figura 25. Desinfectantes utilizados en S. aureus ..................................................... 73
Figura 26. Tiempo de acción del desinfectante en S. aureus ..................................... 74
 RESUMEN

El presente trabajo realizado en el laboratorio de Microbiología de Alimentos de la

Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro
del Perú, buscó determinar la eficacia del desinfectante biodegradable a base de
residuos de naranja y quinua sobre cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Además, se determinó cuál de los extractos hidroalcohólicos a base de residuos de
naranja y quinua fue más efectivo y los tiempos de contacto óptimos en el tratamiento
de desinfección sobre diferentes cargas microbianas de estos microorganismos. Se
aplicaron 3 extractos hidroalcohólicos y 4 mezclas con 2 tipos de solventes de
maceración (etanol al 70% y éter de petróleo), sobre tres cargas microbianas de ambas
especies por separado, frente a dos tiempos de contacto (5 y 10 min). Para Escherichia
coli, el estudio reveló que el mejor efecto antimicrobiano del desinfectante se logró con
una maceración de etanol al 70%, frente a la carga microbiana baja (6 x108 ufc/mL),
con el extracto hidroalcohólicos de semilla y cáscara (naranja), con un tiempo de
contacto de 10 minutos. Para el caso del Staphylococcus aureus el estudio reveló que el
mejor efecto antimicrobiano del desinfectante se logró con una maceración de etanol al
70%, frente a la carga microbiana baja (6 x108 ufc/mL), con el extracto hidroalcohólicos
de semilla con un tiempo de contacto de 10 minutos.
 INTRODUCCIÓN

Actualmente existe en el mercado una amplia gama de desinfectantes no sólo para

usos domésticos, sino también para áreas contaminadas de alto riesgo; los más
utilizados para limpiar estas áreas son el cloro, los compuestos fenólicos, el alcohol e
hipoclorito de sodio entre otros. Estos desinfectantes quimicos poseen un buen poder
desinfectante, sin embargo, la tendencia actual es sustituirlos por productos no tóxicos,
no corrosivos, ecológicos y biodegradables.

Un desinfectante según la Food and Drug Administration (FDA), es una sustancia

que, depositada sobre un material inerte, destruye en 10 o 15 minutos como máximo
todos los microorganismos patógenos, alterando lo menos posible el sustrato donde
residen y abarcando todas las formas vegetativas de bacterias, además de los hongos y
virus.

Por otro lado, los microorganismos indicadores son aquellos que determinan la
calidad sanitaria de los alimentos y advierten oportunamente de un manejo inadecuado
o contaminación, que incrementan el riesgo de presencia de patógenos en alimentos.

Escherichia coli es el indicador más confiable de contaminación fecal en alimentos,

especialmente aquellos que han recibido algún tratamiento antimicrobiano severo
(Fernández, 1997).

Otro microorganismo de importancia en alimentos es Staphylococcus aureus que

está presente en piel de animales y personas, además en sus fosas nasales y garganta.
Los manipuladores de alimentos pueden favorecer su rápida extensión, por lo cual es
fundamental su supervisión y control a nivel de industria elaboradora de alimentos
(Griffin & Tauxe, 1991).

La calidad sanitaria de los alimentos se ha convertido en los últimos años en un

requisito imprescindible para el consumidor, se han identificado enfermedades
transmitidas por alimentos debido a contaminantes microbiológicos, por lo tanto las
plantas de procesamiento de alimentos deben emplear recursos en programas que
ayuden a garantizar la calidad del producto, como el programa de limpieza y

1
desinfección además de utilizar como insumos desinfectantes biodegradables para
superficies que están en contacto con alimentos.

Por tal razón es de suma importancia tener en cuenta la correcta utilización de las
sustancias destinadas para este proceso ya que, con el uso indebido de estas, no
podremos asegurar la calidad dentro de nuestro proceso de desinfección y generaremos
una ineficacia a largo plazo, debido que los microorganismos pueden ir adquiriendo
resistencia a los productos utilizados.

Es así, como este trabajo pretende evaluar la eficacia del desinfectante biodegradable
a base de residuos de naranja y quinua, sobre cepas de Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, teniendo en cuenta el tipo de solvente utilizado para la
maceración, los extractos hidroalcohólicos, las diferentes cargas microbianas y el
tiempo de contacto entre microorganismo y desinfectante.

Fueron objetivos de la investigación:

Objetivo general:

 Evaluar la eficacia de un desinfectante biodegradable a base residuos de naranja

y quinua sobre el crecimiento de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Objetivos específicos:

 Determinar cuál de los extractos hidroalcohólicos a base de cítricos y saponina

es de uso más efectivo como desinfectante biodegradable sobre diferentes cargas
microbianas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

 Determinar cuál de los solventes, etanol al 70% o éter de petróleo, es más

efectivo para extraer el desinfectante biodegradable.

 Determinar los tiempos de contacto más efectivos de un desinfectante

biodegradable a base de residuos de naranja y quinua sobre diferentes cargas
microbianas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

2
 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. CARACTERÍSTICAS DE LA NARANJA (Citrus sinensis).

La naranja pertenece a la familia de las Rutáceas, que contiene unas 1700

especies de plantas que crecen en países de clima cálido y templado, de esta
familia la especie más conocida es la de los cítricos (Yáñez y Parada, 2007).
Entre las especies que pertenecen al género Citrus, se encuentran la naranja
común (Citrus sinensis), la naranja china (Citrus japónica), la naranja amarga
(Citrus auratium), la mandarina (Citrus reticulata), el limón (Citrus limón), entre
otros (Weiss, 1997).

Los cítricos se caracterizan por que sus frutos contienen gran cantidad de
ácido cítrico de formula C3 H4 OH (COOH)3 proporcionando un sabor ácido,

característico del género según (Jorgensen y Yánez, 1999).

En el aceite esencial se puede encontrar hidrocarburos alicíclicos y

aromáticos, así como sus derivados: alcoholes, aldehídos, cetonas, esteres
sustancias azufradas y nitrogenadas. Los compuestos más frecuentes derivan del
ácido mevalónico, catalogados como terpenos, siendo el más abundante
monoterpenos (C10) y los sesquiterpenos (C15). (Yánez, 2005).

Figura 1. Sección transversal de una fruta cítrica.

Fuente: Yánez, (2005)

3
2.1.1. PARTES DEL FRUTO

2.1.1.1. Flavedo o epicarpio

Es el tejido exterior que está en contacto con la epidermis y en él

abundan vesículas que contienen la mayor parte de los pigmentos y los
aceites esenciales de la naranja, estos últimos se encuentran en
numerosos sacos o glándulas cuyo diámetro varía de 0,4 a 0,6 milímetros
(Primo, 1998).

Los pigmentos son carotenoides y estos al igual que los aceites

esenciales se encuentran en gran cantidad en el flavedo, la cantidad de
carotenoides (20-30mg/ 100g) y la de los aceites esenciales es de (0.05 a
1ml por 100cm2 de superficie). También existe una cutícula externa
formada por ceras y otros lípidos (Ruiz y Saavedra, 2007).

2.1.1.2. Albedo o mesocarpio

Debajo del flavedo está el albedo, un tejido esponjoso y blanco, forma

el eje central del fruto que proporciona agua y materiales nutritivos. El
albedo puede constituir del 20 % al 60% de la totalidad del fruto,
variando el grosor de la corteza por ejemplo en las naranjas varía de 4mm
a 12mm. El albedo fresco contiene de un 75% a 80% de agua,

Mientras que sus principales componentes, calculados en relación a la

materia seca, son el 44% de azúcares, 33% de celulosa y 20% de
sustancias pépticas (Primo, 1998).

2.1.1.3. Endocarpio

Es la parte comestible de los cítricos, está formado por carpelos,

separados por las membranas intercarpelares, que forman una especie de
sacos que contienen el jugo. Al prensar estos sacos se separa el jugo
compuesto por componentes solubles, como colorantes y pectinas
(Primo, 1998).

4
 2.1.1.4. Semillas y cortezas

Las semillas tienen una cubierta dura lignocelulósica y están

compuestas por una importante cantidad de proteínas (10-12% en semilla
sin secar). Su harina seca y desengrasada contiene cerca del 40 % de
proteínas que constituyen un excelente pienso. Lo mismo se puede
obtener de la corteza junto con otros residuos, con un contenido proteico
del 6 y 7% (Ruiz y Saavedra, 2007).

2.1.2. COMPOSICIÓN QUIMICA Y COMPUESTOS BIOACTIVOS DE LOS

RESIDUOS DE NARANJA Y QUINUA:

2.1.2.1. Composición química de la harina de cáscara de naranja (citrus

sinensis)

A continuación, en las tablas 1,2 y 3 se presentan los contenidos de:

Composición proximal, micronutrientes y fibra dietética en harinas de
cáscara de naranja (citrus sinensis).

Tabla 1. Composición químico proximal de harinas de cáscaras de

naranja (composición por 100 g de porción de muestra seca).

NARANJA (citrus sinensis)

HUMEDAD 3.31 ± 0.19
CENIZA 4.86 ± 0.02
GRASA 1.64 ± 0.13
PROTEINA 5.07 ± 0.25

Fuente: Rincón, 2005

Los valores presentados son el promedio ± desviación estándar (n=3).

5
 Tabla Nº 2. Contenido de micronutrientes en harinas de cáscaras de
naranja (citrus sinensis) mg/100g de muestra seca:

Harina de cáscara de
naranja
Calcio 27.34 ± 0.31

Magnesio 8.64 ± 0.40

Zinc 0.38 ±0.11

Ácido ascórbico 16.25 ± 1.43

Carotenoides totales 2.25 ± 0.17

Fuente: Rincón, 2005

Tabla Nº 3. Fibra dietética en harinas de cáscara de naranja (Citrus

sinensis). Composición g/ 100g de muestra seca.

Cáscara de naranja

FDI 48.03 ± 2.04

FDS 1.77 ± 0.02
FDT 49.78 ± 2.04

Fuente: Rincón, 2005

Cada valor es el promedio ± desviación estándar (n =3); FDI = Fibra dietética

insoluble; FDS = Fibra dietética soluble; FDT = Fibra dietética total.

2.1.2.2. Composición química de la semilla de naranja (citrus sinensis)

A continuación, en las tablas 4,5 y 6 se presentan los contenidos de:

cantidades manejadas durante el proceso, cantidades de aceites, esteres
y ácidos obtenidos en las semillas de naranja (citrus sinensis).

6
 Tabla 4. Cantidades de aceite de semillas de naranja con el método
Soxhlet de la ciudad de Lima.

Masa de Masa de Masa de % (p/p) % (p/p) % (p/p)

residuo semillas semillas aceite en aceite en aceite en
inicial (g) húmedas secas (g) semillas semillas material
(g) secas húmedas inicial
1176 236 148 42,7 24,8 5,1

Fuente: Escalante, 2012

Tabla Nº 5. Cantidades de aceites y ácidos de semillas de naranjas con

Soxhlet (n-hexano) e hidrólisis de la ciudad de Lima.

M semillas * M Aceite Rend. M mezcla Rend.

(g) (g) Aceite** ácidos Ácidos***
(%) (g) (%)
Exp. 1 45,812 19,156 41,81 7,425 87,65

Exp. 2 45,052 19,329 42,90 6,041 73,26

Exp. 3 45,472 19,922 43,81 6,423 80,24

Promedio 45,5±0,4 19,5±0,4 42±1 6,6±0,7 80±7

Fuente: Escalante, 2012

* M semillas= masa de semillas secas extraídas

** El rendimiento fue calculado considerando la masa del aceite obtenido en relación a

la masa de la semilla seca.

*** Valores aproximados considerando que los esteres metílicos tienen en promedio
residuos carboxilato –O-CO-C18H35

2.1.3. CARACTERÍSTICAS DE LA CÁSCARA Y SEMILLA DE NARANJA.

Las cáscaras y semillas de naranja (Citrus sinensis) contienen altas

concentraciones de fenoles incluyendo flavononas y flavonas, glicósidos de

7
 flavonas y otros glicósidos fenólicos y se ha demostrado que estos
metabolitos secundarios están relacionados con la actividad antioxidante de
este género; así como también flavonas altamente oxigenadas inhiben la
actividad enzimática de la proteína gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa
de Tripanosoma cruzi (Manthey, 2004).

En ensayos de actividad alelopática frente al arroz rojo (maleza) de

glúmelas negras, a partir de extracto etanólico de cáscara y semillas de
naranja (Citrus sinensis) se obtuvieron resultados positivos (Nogueira, et al.,
2007).

2.1.3.1. Extractos cítricos

Los extractos cítricos son fundamentalmente aceites esenciales

obtenidos de semillas de diferentes variedades de cítricos. Los extractos
cítricos dentro del fruto tienen funciones biológicas específicas que al
ser extraídos tienen diversos usos en la industria, entre ellos ser un
agente bactericida y fungicida. De manera general los extractos cítricos
contienen: ácido cítrico, ácido ascórbico (Vitamina C) con ascorbatos,
con alto nivel de disponibilidad unidos a bioflavonoides cítricos
(naringina, hesperidina, quercetina, entre otros), ácidos grasos
insaturados (ácidos grasos omega: linoleico, linolénico y oleico), ácidos
orgánicos y monosacáridos.

En el proceso de maceración la temperatura facilita la disolución de

las sustancias extraíbles, la temperatura contribuye al desplazamiento
de la constante de equilibrio de saturación y aumenta la eficiencia del
proceso. Sin embargo, muchos principios activos son termolábiles y
pueden ser destruidos, total o parcialmente, a temperaturas elevadas
(Sharapin, 2000).

De acuerdo con (Fonnegra y Jimenez, 2007) la maceración es un

proceso que se realiza a temperatura ambiente (15 a 25 ºC).

8
 Entre los solventes generales, los más utilizados son los alcoholes
alifáticos de hasta tres carbonos o mezclas de estos con el agua. Estos
solventes logran extraer la gran mayoría de las sustancias naturales de
interés como alcaloides, flavonoides y terpenos. El alcohol etílico al
70% y al 80% es el solvente por excelencia para la extracción de las
partes leñosas de la planta, raíces y semillas (Sharapin, 2000).

Los mecanismos de acción de los extractos cítricos son: el

rompimiento de la pared celular, precipitación de proteínas, oxidación
de protoplasma e inactivación enzimática, proporcionando un amplio
espectro de acción (Liñan, 2013). Estos mecanismos se activan por
contacto, lo que los hace seguros ya que generan un mínimo de
resistencia bacteriana. Poseen características sistémicas con acción
preventiva y curativa, creando más fitoalexinas que son el mecanismo
natural de defensa de la planta (Liñan, 2013). Su acción desinfectante
cubre un amplio espectro germicida permitiendo la eliminación de
bacterias gram positivas, gram negativas, hongos y levaduras, entre
otros.

En el mercado se pueden encontrar productos elaborados a partir de

extractos cítricos, entre estos se puede mencionar: Desfan 100, Citrik
Max, que actúan como desinfectantes, Bio 150, SEMIC, ZITRON,
BESTCURE y OLITEC, los cuales actúan como bactericidas,
fungicidas y alguicidas (Liñan, 2013). NICON PQ y NICON LQ son
preservantes de alimentos que eliminan y destruyen una amplia
variedad de hongos y bacterias, no son tóxicos y son aptos para el
consumo humano (Infoagro, 2007).

2.1.3.2. METABOLITOS SECUNDARIOS.

Las plantas tienen distintas formas de responder a estímulos

ambientales y a organismos, una de ellas es la producción de
metabolitos secundarios.

9
 Los metabolitos secundarios de las plantas son compuestos químicos
sintetizados por las plantas que cumplen funciones no esenciales en
ellas, de forma que su ausencia no es fatal para la planta, ya que no
intervienen en su metabolismo primario. Los metabolitos secundarios
de las plantas intervienen en las interacciones ecológicas entre la planta
y su ambiente.

Los metabolitos vegetales se dividen en tres grupos químicamente

diferentes: terpenos, fenoles y compuestos que tienen nitrógeno
(Lincoln y Zeiger, 2007).

a) Terpenos.

Llamados también terpenoides, constituyen el mayor grupo de

productos secundarios. Los diferentes compuestos de esta clase son
generalmente insolubles en agua. Son biosintetizados a partir del
acetil CoA o de intermediarios glicolíticos.

Figura N° 2. Fórmula molecular del Isopreno

Fuente: Manthey, (2004).
Los terpenos son toxinas llamados aceites esenciales, que
producen un olor característico y actúan también como repelentes
para insectos y mamíferos que se alimentan de plantas por lo que
desempeñan un papel importante en la defensa de las plantas.
(Lincoln y Zeiger, 2007).

b) Compuestos fenólicos.

Entre los productos secundarios producidos por las plantas se

encuentran aquellos que contienen el grupo fenol, un grupo
funcional hidroxilo en un anillo aromático, a estos se los denomina
compuestos fenólicos (Ver gráfico 2). Estos compuestos forman un
grupo de unos 10.000 compuestos, algunos solubles solo en
solventes orgánicos, otros en ácido carboxílicos y glicosídicos

10
 solubles en agua, mientras que otros son grandes polímeros muy
insolubles.

Figura N° 3. Fórmula estructural del fenol.

Fuente: Lincoln y Zeiger, (2007)
Estos compuestos se encuentran muy extendidos en las plantas
vasculares y funcionan de distintas maneras. Entre los compuestos
fenólicos se encuentran las ligninas y flavonoides (Lincoln y Zeiger,
2007).

c) Compuestos que contienen nitrógeno.

En esta clase se encuentran incluidas las defensas contra

herbívoros conocidas como alcaloides y glicósidos cianogénicos que
son de gran interés por su toxicidad en el hombre y por sus
propiedades medicinales. Los alcaloides actúan como defensa ante
los predadores, especialmente mamíferos, debido a su toxicidad y
capacidad de disuasión. Los glicósidos cianogénicos tienen una
función protectora en algunas plantas, liberan un veneno muy
conocido que es el gas de cianuro de hidrógeno (HCN). La presencia
de glicósidos cianogénicos evita que determinadas plantas sean el
alimento de insectos y otros herbívoros como caracoles y babosas
(Lincoln y Zeiger, 2007).

2.2. CARACTERÍSTICAS DE LA QUINUA (Chenopodium quinoa).

La quinua (Chenopodium quinoa) es un nutritivo pseudocereal que se cultivó

en forma tradicional en el área andina desde la época incásica. Fue ampliamente
usada en la alimentación de los pueblos antiguos de Sudamérica como uno de los
alimentos básicos. En la actualidad la quinua se cultiva en Argentina, Chile,
Colombia y Ecuador a nivel de pequeño agricultor y para autoconsumo. En

11
 Bolivia y Perú el cultivo está difundido en zonas marginales donde no hay otras
alternativas agrícolas (Wahli, 1990).

Figura N° 4. Quinua de la variedad blanca Junín

Fuente: Wahli, (1990).
2.2.1. Saponinas

El contenido de la saponina en la quinua es de entre 0-6% dependiendo de

la variedad. Son compuestos glucósidos que se identifican por su sabor
amargo, formación de espuma estable en soluciones acuosas y alta toxicidad
para especies acuáticas de sangre fría como peces y anfibios porque
permeabiliza sus membranas (Wahli, 1990).

En la quinua la saponina está ubicada en la capa más externa del

epispermo del grano y al microscopio se presenta como una membrana
rugosa formada por células sin núcleos, quebradiza, seca y fácilmente
desprendible de las otras. Estas rugosidades se asemejan a las celdas de un
panal y albergan una sustancia blanca, opaca y amarga que se asume sea la
saponina (Tapia, 2000).

2.2.1.1. Química de las saponinas

Las saponinas son compuestos que se encuentran en muchas plantas.

Deben su nombre a la característica distintiva de formar espuma, su
nombre probablemente proviene de la planta Saponaria, cuyas raíces se
han usado históricamente para formar jabón (del latín sapo=jabón)
(Woldemichael y Wink, 2011).

Químicamente, son glucósidos con una aglicona (porción libre de

glucósido) policíclica que puede ocurrir en la forma de un esteroide o

12
 colina triterpenoide ligada a través del carbono C3 por medio de un
enlace etéreo a una cadena lateral de azúcares. Comúnmente también se
refiere a la aglicona como sapogenina, mientras que también se refiere
comúnmente al subconjunto de saponinas esteroides como sarapogenina.
Las saponinas son anfipáticas debido a su función aglicona liposoluble y
su cadena de sacáridos que, a su vez, es hidrosoluble. Esta característica
es la base de su capacidad para formar espuma. Las saponinas son
percibidas como amargas, y esto reduce las características organolépticas
y palatabilidad de los productos ricos en ellas. Sólo algunas
(generalmente aquellas con agliconatriterpenoica) tienen un buen sabor,
que recuerda a la raíz de regaliz (Woldemichael y Wink, 2011).

2.2.1.2. Actividad antifúngica y antilevaduras:

Se ha informado que las saponinas triterpenoides de las semillas de

Chenopodium quinua Willd. (Chenopodiaceae) tienen actividad
antifúngica (Woldemichael y Wink, 2001). En un estudio realizado por
(Bader, et al., 2000) se demostró que la actividad antifúngica de las
saponinas frente a diferentes cepas de Candida albicans puede ser
influenciada por la variación de las unidades de carbohidratos enlazados
eterglicosídicamente y el oligosacárido enlazado acilglicosídicamente en
C-28 de la aglicona. Sin embargo, sólo una mezcla de saponinas crudas
inhibió el crecimiento de Candida albicans. Los compuestos puros
demostraron poca o ninguna actividad, lo que sugiere un posible efecto
sinérgico entre estas saponinas. Saponinas modificadas en laboratorio
tienen efecto contra el hongo Botrytis cinerea (Stuardo y San martín,
2008).

2.2.1.3. Actividad antibacteriana

También se ha reportado que las saponinas tienen actividad

antimicrobiana (Killeen, et al., 1998). Las saponinas solubles en alcohol
han demostrado tener actividad antimicrobiana tanto en organismos
procariotas como eucariotas, pero sólo en bajas densidades celulares. Las

13
 saponinas no inhibieron el crecimiento microbiano de poblaciones
densas. Extractos de semillas de quinuas procedentes de Chile han
mostrado efecto antibacteriano (Miranda y Delatorre, 2014).

2.3. MICROORGANISMOS INDICADORES DE HIGIENE

Tortorello (2003), menciona que los organismos indicadores se definen como

bacterias que son utilizadas como una señal de calidad o higiene en agua,
alimentos y en ambientes de procesamiento.

Según la Norma Sanitaria Sobre Criterios Microbiológicos de Calidad Sanitaria

e Inocuidad para los Alimentos y Bebidas de Consumo Humano (2008), los
microorganismos indicadores de higiene, son aquellos que no deben estar
presentes en el alimento o bebida en límites superiores a los especificados en
dicha norma. El exceso de estos microorganismos indica que las condiciones de
higiene en el procesamiento de los alimentos o bebidas son deficientes; estos
productos deben ser rechazados, debiendo establecerse las medidas sanitarias
que el caso amerite.

Entre los microorganismos indicadores de higiene, tenemos:

 Escherichia coli

 Staphylococcus aureus

Los microorganismos indicadores dan una idea de las condiciones higiénicas

bajo las cuales se ha elaborado un alimento. La presencia en los alimentos de
algunos como E. coli, sugiere que el alimento se contaminó con heces. Los
coliformes son microorganismos indicadores, ya que su presencia en el alimento
sugiere falta de higiene (Fernández, 1997).

Los grupos microbianos indicadores de mayor uso en los alimentos son:

bacterias aerobias, organismos coliformes totales, coliformes termotolerantes
(fecales), E coli, enterococos, la familia enterobacteriaceae, Staphylococcus
aureus, así como hongos y levaduras (Fernández, 1997).

14
2.3.1. Escherichia coli

Este microorganismo fue aislado por primera vez en heces de niños y fue
descrito por el bacteriólogo alemán Theodor Escherich. E. coli es una bacteria
que habita normalmente en el intestino del hombre y animales de sangre
caliente, y desempeña un importante papel en la fisiología del intestino. Por
ser un habitante regular y normal del intestino se usa desde hace un siglo
como el mejor indicador de contaminación de los alimentos con materia fecal
(Mossel y Moreno, 1990).

Microscópicamente es una bacteria en forma de bacilo, aerobia y aerobia

facultativa, que consta de una pared celular delgada debida a una capa de
peptidoglucano, por lo que impide que el reactivo de tinción (cristal violeta),
sea retenido en el interior de la célula clasificándola como gram negativa;
estructuralmente la mayoría forman fimbrias y pilis los cuales les sirven para
desplazarse, así como también micro cápsulas (García, 2000).

Según García, (2000) esta bacteria se caracteriza por ser un patógeno

intestinal capaz de causar enfermedad diarreica en el hombre y en los
animales. Cuando la Escherichia coli se encuentra habitando en tejidos fuera
del intestino, induce a procesos inflamatorios febriles, cuyos síntomas a
menudo se pueden confundir con los ocasionados por otras bacterias
entéricas.

Figura N° 5. Vista microscópica de Escherichia coli

Fuente: García, 2000.

15
2.3.1.1. Hábitat

La mayoría de las cepas pertenecientes a la especie Escherichia coli,

forman parte de la microflora normal del intestino del hombre y de los
animales de sangre caliente, encontrándose habitualmente en las heces.
En los animales, desde las primeras horas después del nacimiento, una
sucesión de cepas de E. coli habitan la parte más distal del íleon y todo el
colon. E. coli representa el uno por ciento o menos de las bacterias
presentes en el colon; sin embargo, la bacteria es la especie anaerobia
facultativa más numerosa en el tracto gastrointestinal sano de los
animales domésticos (Scanlan, 1991).

Se pueden hallar en el suelo, agua y otros lugares, aunque su

procedencia parece ser siempre intestinal. Es el indicador más confiable
de contaminación fecal en alimentos, especialmente aquellos que han
recibido algún tratamiento antimicrobiano severo (Fernández, 1997).

2.3.1.2. Incidencia de Escherichia coli en alimentos

E. coli se ha convertido en la actualidad, en uno de los tipos de

bacteria enteropatógena de mayor preocupación en la industria
alimenticia, debido a que se le ha catalogado como uno de los principales
agentes causales de epidemias por contaminación de alimentos,
provocando en el humano, severos trastornos gastrointestinales,
principalmente en niños y ancianos (Feng, 1996).

La transmisión de E. coli es más común por vía fecal-oral y el

vehículo más frecuente de infección humana es la carne de bovino,
fundamentalmente las hamburguesas poco cocidas. También se ha
documentado la infección asociada a consumo de carne de pavo, salami,
leche, yogurt, mayonesa, ensalada, vegetales crudos y agua. (Griffin y
Tauxe, 1991).

La transmisión de estas bacterias a los humanos puede ocurrir por

medio de alimentos contaminados, por manipuladores de alimentos

16
 infectados que practican una defectuosa higiene personal o por contacto
con agua contaminada de aguas residuales humanas. Las medidas
importantes para prevenir la intoxicación alimentaria incluyen la
formación de operarios en técnicas de manipulación inocua de alimentos
e higiene personal (García, 2000).

Figura N° 6. Colonias de Escherichia coli

Fuente: García, (2000)

2.3.1.3. Características de crecimiento y supervivencia de Escherichia coli

2.3.1.3.1. Temperatura

Un estudio detallado del crecimiento de E. coli con respecto a la

temperatura, demuestra que la temperatura óptima en un medio rico
y complejo es de 39ºC, la máxima es de 48ºC y la mínima es de 8ºC,
estos valores están sujetos a pequeñas diferencias según los medios
empleados (Madigan y Martinko, 1999).

Es importante tener en cuenta que, a temperaturas bajas el

metabolismo celular es lento y las células paran de crecer; aunque
suelen morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la
óptima, se produce la muerte celular rápidamente y las células no
pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la
temperatura (Kirsop y Snell, 1984).

17
 2.3.1.3.2. pH

Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya

que cada tipo de microorganismo tiene un rango de pH en el que
puede vivir adecuadamente. La mayoría de las bacterias como
Escherichia coli tienen su óptimo de crecimiento a pH 7 (neutro), el
pH interno se mantiene en un valor muy cercano a 7,6 siendo el
valor óptimo para su metabolismo. Escherichia coli, al igual que la
mayoría de las demás bacterias, pueden realizar reacciones
metabólicas vitales sólo dentro de un intervalo de pH limitado,
porque muchas de sus enzimas funcionan adecuadamente sólo en un
intervalo estrecho de pH (Atkinson, 1986).

2.3.1.3.3. Refrigeración

A temperatura de refrigeración (3 - 7 ºC), E. coli patógeno

generalmente sobrevive bien en los alimentos. En carne picada de
vacuno, en poblaciones de E. coli después de haber permanecido
durante 9 meses a –20 ºC, se observa una pequeña modificación o no
se observa modificación alguna, mientras que las poblaciones de E.
coli no patógeno después de haber permanecido 38 semanas a –25,5
ºC se reducen 10 veces (ICMSF, 1998).

2.3.1.3.4. Desinfectantes

E. Coli es más resistente a los desinfectantes que otras bacterias y

por lo tanto se utilizan como organismos indicadores. (ICMSF,
1998)

2.3.2. Staphylococcus aureus

El Staphylococcus aureus es un coco inmóvil, de 0.8 a 1 micrómetro de

diámetro, que se divide en tres planos para formar grupos de células
irregulares semejantes a racimos de uvas. Son inmóviles y carecen de

18
 esporas. Morfológicamente se parecen al género Micrococcus pero tienen
características metabólicas diferentes (Pascual y Calderón, 2000).

Son Gram positivas, crece en anaerobiosis y muestra un metabolismo

anaerobio facultativo. Es muy sensible al calor y a los desinfectantes. Su
presencia o la de sus toxinas en los alimentos es signo evidente de falta de
higiene. Cuando sus toxinas se encuentran en los alimentos, pueden ser causa
de intoxicación (Pascual y Calderón, 2000).

Este patógeno es el agente causal de muchas infecciones oportunas en los

humanos y los animales (Yugueros, et al., 1999). Las infecciones debidas al
S. aureus es de mayor importancia en la medicina veterinaria y humana
(Zadoks, et al., 2000). En el humano el S. aureus es un patógeno responsable
de la septicemia, endocarditis y el síndrome del shock tóxico y en animales es
el responsable de ocasionar la mastitis en las vacas y ovejas (Fitzgerald, et al.,
2001).

Figura N° 7. Vista microscópica de Staphylococcus aureus.

Fuente: Zadoks, et al., (2000)

2.3.2.1. Hábitat

La principal fuente del S. aureus es el hombre (nariz, garganta, yema

de los dedos, brazos, piel afectada con erosión o forúnculos, ojos y tracto
intestinal), pero también son los animales en especial las vacas con
mastitis, las cuales contaminan la leche y sus derivados. De manera

19
 consecuente, los alimentos implicados en la intoxicación son aquellos
que cumplen con los parámetros de crecimiento del microorganismo tales
como productos cárnicos, aves, leche, productos de pastelería con crema
y huevo, fundamentalmente (Nickerson y Sinskey, 1998).

2.3.2.2. Incidencia de Staphylococcus aureus en alimentos

La intoxicación estafilocócica aparece muy frecuentemente cuando un

alimento cocido es contaminado por una persona colonizada y después se
guarda en un ambiente caliente (20 - 40 ºC) durante varias horas. Con
frecuencia están implicados los productos de panadería rellenos de nata,
las carnes cocidas (especialmente el jamón), el marisco y otros platos
preparados con mucha antelación al consumo (Roberts, 1982).

Entre los alimentos implicados contaminados más frecuentemente se

encuentran: ensaladas de papas y huevos, pastelería, jamón, pollo, cremas
heladas (Roberts, 1982).

Figura N° 8. Colonias de Staphylococcus aureus.

Fuente: Roberts, 1982
2.3.2.3. Características de crecimiento y supervivencia de Staphylococcus
aureus

2.3.2.3.1. Temperatura

El crecimiento óptimo se verifica a temperaturas entre 35 y 40 ºC,

siendo sus límites aproximadamente en las temperaturas de 7 y 48

20
 ºC. A 10 ºC, la fase de latencia es prolongada (> 20 horas) y cuando
comienza el crecimiento, este es muy lento. A temperaturas más
bajas, el crecimiento es limitado por las reducciones insignificantes
de la actividad del agua o del pH y además se reduce por la
conservación en condiciones de anaerobiosis. (ICMSF, 1998).

El organismo suele ser destruido fácilmente a las temperaturas

que se utilizan en la pasteurización y en la cocción de los alimentos.
En los alimentos secos y en alimentos con elevado contenido en
grasa, la resistencia aumenta. Todas las enterotoxinas son
extraordinariamente resistentes al calor y pueden resistir al
tratamiento térmico que se utiliza para esterilizar los alimentos
enlatados de acidez baja. (ICMSF, 1998).

2.3.2.3.2. pH

Staphylococcus aureus crecen en valores de pH entre 4.5 y 9.3, con

un óptimo de 7.0 a 7.5 (ICMSF, 1998).

2.3.2.3.3. Refrigeración

Staphylococcus aureus es muy resistente a la congelación y a la

descongelación y sobrevive perfectamente en los alimentos que se
conservan a temperaturas ≤ – 20 ºC. A temperaturas superiores, por
ejemplo desde –10 ºC a 0 ºC, la viabilidad decrece notablemente
durante la conservación en congelación. En alimentos que se
conservan congelados, las enterotoxinas estafilocócicas son muy
estables (ICMSF, 1998).

2.3.2.3.4. Desinfectantes

Staphylococcus aureus es destruido fácilmente por los

desinfectantes que habitualmente se utilizan en la fabricación de
alimentos. En el ICMSF (1998) aparecen publicados el efecto de una
amplia gama de desinfectantes sobre Staphylococcus aureus, entre

21
 los cuales podemos mencionar el hipoclorito sódico, peróxido de
hidrógeno, diacetato de clorhexidina, ácido peracético, alcohol
etílico, etc.

2.4. DESINFECCIÓN

Se le denomina desinfección a la destrucción de microorganismos, mediante

procedimientos o agentes físicos o quimicos satisfactorios, aplicados en
superficies limpias de forma que se reduzca el número de microorganismos que
pueden causar infección u ocasionar otros efectos indeseables. (FDA, 1998)

Tomando como base la definición antes planteada se puede decir que

desinfectar significa tratar los productos limpios mediante un proceso eficaz para
destruir o reducir substancialmente las cantidades de microorganismos que
implican un riesgo para la salud pública, así como otros microorganismos no
deseados, sin afectar negativamente a la calidad del producto o su seguridad para
el consumidor. (FDA, 1998)

Cuando se va a llevar a cabo un proceso de desinfección, es necesario que

toda la superficie a tratar se encuentre bien limpia, de lo contrario, la presencia
de materia orgánica e inorgánica puede inactivar el efecto de la sustancia
química utilizada.

2.4.1. Factores que influyen en la desinfección

Hay varios factores que influyen en la velocidad con que tienen lugar las
reacciones químicas que dan como resultado la desinfección. A continuación,
se mencionan los factores que intervienen en la desinfección:

2.4.1.1. Tipo del desinfectante

Negroni (2009) menciona que el tipo de desinfectante se relaciona con

el tiempo, ya que varía la velocidad de la reacción. Generalmente, cuanto
mejor sea el desinfectante, menor será el tiempo. La relación es de tipo
exponencial y el valor difiere según las sustancias y microorganismos.

22
 El factor más importante es el tipo de desinfectante que reaccionan y
la cantidad de bacterias presentes. El tipo de desinfectante depende, a su
vez, de otros dos factores; primero, la presencia de agua, y segundo, la
presencia de materia orgánica extraña. El agua actúa como un disolvente
y lleva a cabo la suspensión del medio que está en contacto íntimo entre
el desinfectante y el microorganismo (Microbiología Especial, 2004).

2.4.1.2. Temperatura

Los desinfectantes quimicos son comúnmente utilizados a temperatura

ambiente, pero algunos son posibles de usar en conjunto con procesos
calientes de limpieza (Gardner, 1991).

Un aumento de temperatura con un agente químico apresura la

destrucción de microorganismos. Así una cantidad pequeña de agente
químico a una temperatura elevada logrará el mismo resultado que una
cantidad mayor del mismo agente a una temperatura más baja. Es
importante tener en cuenta que la estabilidad de algunos desinfectantes se
ve afectada por el aumento de temperatura, por ejemplo los Halógenos, el
Cloro y el Yodo (Pelczar, 1994).

2.4.1.3. pH

El grado de ionización de los desinfectantes dependerá el pH del

medio. Los cambios de pH no solo pueden afectar la actividad de un
desinfectante, sino que también pueden incidir en la velocidad de
crecimiento de las células bacterianas y en el estado fisicoquímico de sus
superficies. Mientras que un pH 6-8 es óptimo para el desarrollo de
algunas bacterias, la velocidad de crecimiento de otras disminuye cuando
se acidifica o se alcaliniza el medio. (Negroni, 2009).

La acidez o alcalinidad de una solución afectará la eficacia de un

agente químico. Los bactericidas ácidos (aniónico) como los ácidos
orgánicos y el fenol son más eficaces a un pH bajo. Los microbicidas
catiónicos tienden a ser inhibidos por pH bajos y aniones (Pelczar, 1994).

23
2.4.1.4. Formulación

Algunos desinfectantes tienen en su formulación soluciones que

garantizan una mayor penetración como algunos desinfectantes de piel.
Los desinfectantes fenólicos contienen agentes activos de superficie para
promover la solubilidad de compuestos activos, los compuestos de
amonio cuaternario son formulados con detergentes. Es importante saber
que una mezcla no autorizada de diferentes desinfectantes puede resultar
en desactivación (Gardner, 1991).

2.4.1.5. Número de Microorganismos

A mayor número de microorganismos el tiempo de ajuste para destruir

a todos los microorganismos es más largo (Gardner, 1991).

Si el número de microorganismos es grande, se necesita más cantidad

de desinfectante o más tiempo de exposición para conseguir un
determinado nivel de desinfección; de ahí la necesidad de limpiar, antes
de aplicar el desinfectante, ya que de este modo se elimina la carga
microbiana y se elimina materia orgánica, que protege a los
microorganismos e inactiva al desinfectante (Vignoli, 2006).

2.4.1.6. Naturaleza del organismo

Las especies de microorganismos difieren en su susceptibilidad a los

agentes físicos y quimicos. La eficacia de un agente en particular
depende de las propiedades del organismo contra el cual está siendo
probado. La producción de esporas o cápsulas por ejemplo hacen a los
microorganismos más resistentes (Joklink, 1986).

Las formas más resistentes son las esporas, seguidas de los bacilos
acido alcohol resistentes, los bacilos Gram negativos, los cocos y por
último los bacilos Gram positivos (Vignoli, 2006).

24
 2.4.1.7. Tiempo

Los microorganismos no mueren en forma instantánea ni

simultáneamente, sino que deben estar en contacto con el agente químico
durante un tiempo mínimo para lograr el efecto deseado. (Negroni,
2009).

El tiempo de exposición de las bacterias a un desinfectante

determinado tiene considerable importancia en la práctica y está en
relación inversa a la rapidez de la destrucción. El tiempo que se deja para
que las bacterias sean destruidas se determina considerando no sólo el
tipo de desinfectante, la concentración, la temperatura, y el pH, sino
también según el tipo de bacteria que se va a destruir (Microbiología
Especial, 2004).

Un tiempo de contacto suficiente es crítico para asegurar la desinfección

en la mayoría de los casos, siendo generalmente aceptado un mínimo de
cinco minutos. Generalmente al aumentar el tiempo de contacto, aumenta
la tasa de letalidad (Bautista, 2007).

2.5. DESINFECTANTES

Un desinfectante según la Food and Drug Administration (FDA), es una

sustancia que, depositada sobre un material, vivo o inerte, destruye en 10 o 15
minutos como máximo todos los microorganismos patógenos, alterando lo
menos posible el sustrato donde residen y abarcando todas las formas
vegetativas de bacterias, además de los hongos y virus (Russell y McDonell,
2000).

Actualmente, se denomina bactericida a los productos que actúan tanto in

vivo como sobre material inerte y se reserva el término desinfectante para los
productos que sólo actúan sobre material inerte (Piédrola, 2002).

Los desinfectantes deben seleccionarse teniendo en cuenta el tipo de

microorganismo que se desea eliminar, el tipo de producto que se elabora y el

25
 material de las superficies que entran en contacto con el producto utilizado
(Ascenzi, 1996).

2.5.1. ¿Cómo escoger un desinfectante?

Las características que debe tener un buen desinfectante están

determinadas dentro de lo siguiente: debe tener una alta actividad germicida,
un espectro de acción amplio que abarque las bacterias Gram positivas y
Gram negativas, bacterias acido-alcohol-resistentes, virus y hongos, ser
bactericida mejor que bacteriostático, es decir que todos los microorganismos
se mueran gradualmente y en un tiempo corto no más de 15 minutos; que
pueda permanecer almacenado por varios meses, que sea compatible con
otros productos que se usen antes o simultáneamente, como los jabones y
clorógenos, no debe ser tóxico en tejidos humanos, debe conseguir una
reducción logarítmica de los microorganismos patógenos y resulta de mayor
valor cuando sucede en el menor tiempo posible (Rodríguez, Mayavales y
Álvarez, 2001).

Además de las anteriores características, al elegir un desinfectante es

necesario considerar:

 Tipo de desinfectante
 La eficacia.
 La actividad con la materia orgánica.
 La toxicidad.
 Efectividad sobre metales.
 La actividad con el jabón.
 La solubilidad (acidez, alcalinidad, pH).
 Tiempo de contacto.
2.5.2. Mecanismos de acción de los agentes desinfectantes

Piédrola (2002) menciona que los desinfectantes intervienen en algunas

etapas de la vida microbiana. Los mecanismos de acción desinfectante son

26
 complejos. La acción puede ejercerse principalmente sobre una función
comprometiéndose luego otra, algunas veces reversible y otras irreversibles.

Dentro de los principales mecanismos de acción de los desinfectantes se

encuentran:

 Daño de la pared celular, llevando a los microorganismos a la lisis.

 Alteración de la permeabilidad de la membrana citoplasmática,
impidiendo el transporte selectivo de nutrientes al interior de la célula
bacteriana.
 Alteración de la naturaleza coloidal del citoplasma, desnaturalizándola o
coagulándola.
 Inhibición de la acción enzimática.
 Formación de antimetabolitos.
 Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos.
Tabla N° 6. Mecanismo de acción de agentes desinfectantes

ACCIÓN GRUPO QUIMICO

Pared celular y membrana celular
Material nuclear
Enzimas y proteínas
Aldehídos
Tensoactivos aniónico
Fenoles y derivados
Biguanidas
Óxido de etileno
Agentes alquilantes
Agentes oxidantes
Halógenos
Alcoholes
Ácidos y álcalis
Metales pesados

Fuente: Garzón y Vega, 2004

2.5.3. GRUPOS DE DESINFECTANTES

2.5.3.1. Halógenos y sus compuestos

Por su capacidad de agentes oxidantes fuertes para atacar y destruir

las sustancias orgánicas, todos los halógenos sirven perfectamente para

27
 operaciones de desinfección. Sin embargo, del grupo se destacan el Yodo
y el Cloro (Wilbrett, 2000).

2.5.3.1.1. Cloro

Mata a la mayoría de las células vegetativas, algunos virus y

hongos. Actúa por oxidación de los componentes celulares. Es usado
usualmente para desinfección de agua. Las soluciones de hipoclorito
se usan para desinfectar objetos y superficies. El cloro es inactivado
por materia orgánica, irritante a los tejidos y corrosivo para los
metales (Pedrique, Vizcarrondo y Gutiérrez, 2002).

2.5.3.1.2. Yodo

Altamente efectivo como agente bactericida y es el único que es

efectivo contra todos los tipos de bacterias. También posee cierta
actividad esporicida. Es un agente oxidante débil, su acción
antimicrobiana parece ser debida a la combinación del yodo
molecular con proteínas celulares (Pedrique, et al., 2002).

2.5.3.1.3. Compuestos de Amonio cuaternario

Son agentes desinfectantes por su acción detergente, rompen la

membrana citoplasmática debido a que disuelven las capas lipídicas,
además desnaturalizan las proteínas (Pedrique, et al., 2002).

Tienen buena capacidad de penetración, lo que los hace útiles en

superficies porosas. Son agentes humectantes con propiedades
detergentes adicionales. Los compuestos de amonio cuaternario no
deben combinarse con otros productos para limpiar ya que se
inactivan (Marriot, 1999).

2.5.3.1.4. Compuestos fenólicos

Activos contra bacterias vegetativas pero inactivas contra esporas.

Son fungicidas y también virucidas. Actúan por desnaturalización de

28
 las proteínas y dañan las membranas celulares. Ejemplos: fenol,
cresol, hexaclorofeno, etc. Son usados como desinfectantes, los menos
irritantes se usan como antisépticos. Son irritantes y corrosivos
(Pedrique, et al., 2002).

2.5.3.1.5. Alcoholes

Desnaturalizan las proteínas, actúan también disolviendo los

lípidos por lo que pueden dañar las membranas celulares. Activos
contra bacterias vegetativas, pero no sobre esporas. Los más utilizados
son el alcohol etílico y el alcohol isopropílico. Son usados como
antiséptico de la piel y desinfectantes. Se usan en solución al 70-80%
en agua. Son económicos, las desventajas de los alcoholes es que
tienden a alterar y endurecer el material de goma y plástico, se
inactiva en presencia de materia orgánica y se evapora rápidamente
(Pedrique, et al., 2002).

2.6. LOS ÁCIDOS ORGÁNICOS Y SU ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Los ácidos orgánicos prometen ser una alternativa viable en el intento de

reducir el amplio uso del cloro en la desinfección de frutas y vegetales crudos,
dado el reconocimiento de su buen desempeño como antimicrobianos (Beuchat,
1998).

Diversos tipos de ácidos orgánicos están contenidos naturalmente en muchas

frutas y vegetales, algunos de ellos son el ácido láctico, acético, succínico,
tartárico, benzoico y sórbico. Su actividad antimicrobiana está directamente
ligada al pH por cuanto la mayoría de los microorganismos no resisten valores
inferiores a 4.0. (Beuchat, 1998).

En la búsqueda de alternativas para sustituir el cloro, los ácidos orgánicos

tienen un buen potencial para disminuir la población microbiana de la superficie
de frutas y vegetales (Beuchat, 1998); adicionalmente sus beneficios se dirigen a
su origen natural, son generalmente reconocidos como inocuos (GRAS) (Akba y
Olmez, 2007), y no representan un riesgo mayor para el personal operario que

29
 constantemente está expuesto a su uso tanto al nivel de la industria e incluso a
nivel doméstico.

Los ácidos orgánicos actúan retardando el crecimiento de algunos

microorganismos y evitando el de otros. Algunos pueden tener actividad
fungistática, mientras que otros son más efectivos en la inhibición bacteriana,
aunque no han sido claramente definidas las condiciones bajo las cuales son más
efectivos (Parish, et al., 2003).

La acción antimicrobiana de los ácidos orgánicos está relacionada con la

reducción del pH; al llevar a la disminución del pH interno de la célula
microbiana, se genera una interrupción del transporte de sustrato por alteración
de la membrana celular, se inhibe la acción de importantes enzimas bacterianas
al tiempo que la célula pierde energía procurando eliminar el exceso de protones
desde su interior (Canibe y Jensen, 2001).

El efecto antimicrobiano de los ácidos orgánicos aumenta, conforme aumenta

su concentración. La eficacia de los ácidos orgánicos como desinfectantes varía
ampliamente con el tipo de ácido, así como con el tipo de microorganismo
(FDA, 2002).

2.7. ESCALA DE MC FARLAND

La escala de Mc Farland, es utilizada como estándar de turbidez en la

preparación de suspensiones de microorganismos. Los estándares de turbidez
son preparados por la mezcla de químicos que se precipitan para formar una
solución de turbidez reproducible. Son realizados adicionando ácido sulfúrico a
una solución acuosa de cloruro de bario, del cual resulta la formación de un
precipitado de sulfato de bario. Esta escala de turbidez es elaborada con una
mezcla de BaCl2 de 0.048 M y H2S04 0.6 M, la turbidez la da el
BaCl2, el cual va en cantidad creciente mientras al ácido sulfúrico va
disminuyendo la proporción. (Escobar, 2002).

Cada uno de los tubos del patrón de acuerdo con la turbidez, representa un
número de bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido

30
 determinado por recuentos de colonias. De esta forma al comparar una
emulsión de bacterias con el tubo del patrón de Mc Farland que más se
asemeje se puede saber aproximadamente el número de bacterias en la
emulsión (Escobar, 2002)

2.8. ANÁLISIS QUÍMICO DE PLANTAS AROMÁTICAS

Estas pruebas químicas se realizan a diferentes partes de la planta con el

objetivo de identificar la presencia o ausencia de algunos metabolitos
secundarios, entres estas pruebas tenemos:

2.8.1. Lieberman Burchard

Es un reactivo utilizado en una prueba colorimétrica para identificar la

presencia o ausencia de esteroides y triterpenos. Este cambio de coloración
se debe a que el anhídrido acético reacciona con el grupo hidroxilo ubicado
en la posición 3 del esteroide o triterpeno, produciendo éster.
Adicionalmente ocurre una deshidratación cuando el esteroide contiene una
instauración en la posición 5, haciendo que ocurra el cambio de coloración,
(Burke, et al., 1974).

31
 Figura N° 9. Reacción química de la prueba Lieberman y Buchard

Fuente: Burke, (1974).

2.8.2. Prueba de Baljet

En esta prueba el cambio de color indica la presencia de glicósidos

cartionicos y/o sesquiterpenlactonas en el extracto. Este cambio se debe a
que el ácido pícrico (componente del reactivo de Baljet), forma un complejo
con las lactonas alfa, beta y gama insaturadas presentes en estos compuestos
(Orantes, 2008).

Sesquiterpenlactona Sal potásica del Agua

(ambrosina) ácido hidroxiácido

Figura N° 10. Reacción química de la prueba de Baljet

Fuente: Orantes, (2008).

2.8.3. Prueba de Hidroxamato férrico

En esta prueba el cambio de coloración a un color marrón. Este cambio

de coloración se debe a que la hidroxilamina convierte las latonas en ácidos
hidroxámicos, los cuales, junto con el Fe+3 en un medio ácido, forma el
Hidroxamato férrico, el cual tiene el color característico marrón y violeta
(Devyatnin y Parfenova 1967).

32
 Figura N° 11. Reacción química de la prueba de Hidroxamato férrico

Fuente: Devyatnin, (1967).

2.8.4. Prueba de Shinoda

Esta prueba torna los extractos de color rojo o anaranjado, siendo

indicador de que es positivo. Esto se debe a la reacción del magnesio con el
HCl, dando como producto H2 (el gas que se desprende) y MgCl2 el cual
reacciona con los flavonoides, otorgando la coloración característica
(Vidaurre, Querevalú y Ruiz, 2007).

+Mg + HCl + H2

Flavo Flavonoide Hidrogen

na o

Figura N° 12. Reacción química de la prueba de Shinoda

Fuente: Domínguez, (1979).

2.8.5. Prueba de cloruro férrico

Esta prueba tiene la característica que los extractos se tornan de color

marrón que indican la presencia de presencia de fenoles derivados del
catecol. Este cambio de coloración también puede deberse a la presencia de
otros compuestos similares, como los hidroxibenzal aldehídos o las cetonas,
los cuales adquieren coloraciones oscuras que van desde el rojo al púrpura
(Geissman, 1973).

33
 +

Figura N° 13. Reacción química de la prueba de Cloruro férrico

Fuente: Domínguez, (1979).

2.8.6. Prueba de antrona

Esta prueba tiene la característica de formar un anillo de color verde en la

superficie del tubo de prueba. Este cambio de coloración se debe a una
deshidratación de los azúcares y formación de furfurales o derivados de
estos, los cuales reaccionan con la antrona junto con el ácido sulfúrico
(Yemm, 1954).

Figura N° 14. Reacción química de la prueba de Antrona

Fuente: Yemm, (1954).

34
2.8.7. Prueba de Dragendorff

Esta prueba revela un resultado positivo cuando forma un precipitado de

color marrón oscuro el cual indica la presencia de alcaloides dentro del
extracto (Okwu, Awurum y Okorokkwo, 2007).

Nitrato de Yoduro de Tetrayoduro Nitrato de

bismuto potasio de bismuto y potasio
potasio

Figura N° 15. Reacción química de la prueba de Dragendorff

Fuente: Okwu, et al., (2007)

2.8.8. Prueba de espuma

Esta prueba es una prueba específica para todos los extractos que tienen
presencia de saponina. Esta se fundamenta en que las saponinas tienen la
capacidad de disminuir la tensión superficial del agua, lo que hace que al
agitar la solución forme espuma estable (Morrissey y Osbourn, 1999).

2.9. DESINFECTANTE BIODEGRADABLE A BASE DE CÍTRICOS

2.9.1. KILOL L-20

Es un extracto natural de semillas cítricas adicionado a ingredientes

inertes que actúan como fungicidas y bactericidas de origen natural,
utilizados en la agricultura, nutrición animal, y desinfección.

2.9.1.1. COMPOSICIÓN

Producto natural orgánico cuyo componente activo es un extracto de la

semilla y pulpa de Toronja. Esta Biomasa considerada como una nueva
generación de desinfectantes y preservantes, es un compuesto complejo
con: Ácido Ascórbico, Ácido cítrico, Acido Palmítico, Alfa-tocoferoles
(Vitamina E), Aminoácidos; en una base de Glicerina natural.

35
 III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Lugar de ejecución

La investigación se desarrolló en el laboratorio de Microbiología de

Alimentos de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la
Universidad Nacional del Centro del Perú.

3.2. Equipos y materiales

3.2.1 Equipos de laboratorio
 Autoclave, Marca: MRC, Modelo: LDZM-60KCS, Capacidad: 10 kg
 Incubadora, Marca: WTCBINDER, Modelo: DIN 1280, Capacidad: 5 kg
 Destilador, Marca: GFL, Modelo: D-30938, Capacidad: 5 litros.
 Balanza analítica, Marca: OHAUS, Modelo: AR3130, Capacidad:
310.000 g.
 Contador de colonias, Marca: Hellige, Modelo: FAG75, Capacidad: 1
Placa
 Estufa, Marca: Binder, Modelo: DIN 12880, Capacidad: 5 kg
 Agitador tipo vortex, Marca: VELP, Modelo: W-236, Capacidad 1 tubo
de prueba
 Mechero Bunsen
3.2.2 Materiales
 100 Placas petri
 50 Tubos de prueba con tapa rosca
 2 Matraces de 500 mL
 2 Matraces de 1000 mL
 2 Fiolas de 100 mL
 2 Fiolas de 200 mL
 6 Frascos microbiológicos con tapa rosca de 250 mL
 1 Micro pipeta de 0 – 1000 uL
 2 Rejillas de asbesto
 2 Gradillas de 25 tubos

36
  Asa de kolle
 Espátula de metal
 Pizeta de 500 mL.
 Papel aluminio.
 Algodón
 Papel kraft

3.2.3 Materia prima, reactivos y medios de cultivo

 Naranja de la variedad valencia.
 Quinua de la variedad blanca Junín
 Desinfectantes extraídos a base de etanol al 70% y éter de petróleo
 Cepas de Escherichia coli enteropatógena
 Cepas de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
 Agar Chromocult para Escherichia coli
 Agar Baird Parker para Staphylococcus aureus
 Plasma de conejo
 Indicador rojo de metilo
 Reactivo de Kovacs
 Peróxido de hidrogeno al 3%
 Emulsión yema de huevo telurito
 Tubo Mc Farland Nº 3 estandarizado
 Agua destilada

37
3.3 MÉTODOS DE ANÁLISIS

3.3.1 Preparación del desinfectante biodegradables a base de residuos de

naranja

Las naranjas (Citrus sinensis) de la variedad valencia fueron adquiridas en

el centro de mercado local de la ciudad de Huancayo en estado maduro,
teniendo en cuenta que todas las frutas se encontraban sin alguna infección.
Se obtuvieron 10 kg de la fruta y fueron peladas para utilizar las cáscaras y
semillas, las cuales se secaron a 40°C en el secador de bandejas durante 48
horas. Una vez secas, las cáscaras y semillas se pulverizaron con la ayuda de
un molino manual y se almacenaron para su posterior extracción.

3.3.1.1 EXTRACCIÓN

 Extracto etéreo: Se tomaron 100 g de muestra de las cáscaras

pulverizadas de naranja y se colocó en una bolsa de tela prefabricada
para hacer diálisis y fomentar el paso de las sustancias requeridas para
esta investigación, seguidamente se colocó en un vaso de precipitación
y se les adicionó 900 ml éter de petróleo para extraer los compuestos
de baja polaridad. Se realizó el mismo procedimiento para la semilla
de la naranja (100 g de semilla de naranja).

Los vasos de precipitación se almacenaron durante 6 días a

temperatura ambiente para asegurar una buena extracción,
posteriormente se centrifugó a 200 rpm por 15min y se utilizó el
sobrenadante para concentrar los extractos a 50 °C por 30 min, con un
rotaevaporador (Büchi), obteniendo las fracciones etéreas, las cuales
se almacenaron en frascos con tapa rosca de color azul. El material
solido contenido en tela prefabricada se pone en un vaso de
precipitación para su posterior utilización.

 Extracto etanólico: Se tomó el material sólido y se le adicionó

900 ml de etanol al 70% para extraer los componentes de alta

38
 polaridad. Se realizó el procedimiento anterior para obtener las
fracciones etanólicas.

A los extractos obtenidos se le calculó el peso seco y el

rendimiento con respecto al material vegetal empleado.

3.3.2 Medición de parámetros.

Se procedió a medir parámetros como pH y temperatura para poder

observar el desarrollo del experimento, las mediciones se realizaron antes y
después de la maceración, así como también al extracto obtenido.

3.3.3 Preparación del desinfectante biodegradable a base de residuos de

quinua

La quinua (Chenopodium quinoa) de la variedad blanca Junín fueron

adquiridas en el centro de mercado local, teniendo en cuenta su calidad y
limpieza. Se obtuvieron 10 kg de la quinua y se realizó el escarificado, para
utilizar los residuos, las cuales se secaron a 40 °C en el secador de bandejas
durante 48 horas. Una vez secas, se pulverizaron con la ayuda de un molino
manual y se almacenaron para su posterior extracción.

3.3.3.1 EXTRACCIÓN

 Extracto etéreo: Se tomaron 100 g de muestra de los residuos de

quinua pulverizadas y se colocó en una bolsa de tela prefabricada
para hacer diálisis y fomentar el paso de las sustancias requeridas
para esta investigación, seguidamente se colocó en un vaso de
precipitación y se les adiciono 900 ml de éter de petróleo para
extraer los compuestos de baja polaridad.

Los vasos de precipitación se almacenaron durante 6 días a

temperatura ambiente para asegurar una buena extracción,
posteriormente se centrifugó a 200 rpm por 15min y se utilizó el
sobrenadante para concentrar los extractos a 50 °C por 30 min, con
un rotaevaporador (Büchi), obteniendo la fracción etérea, la cual se

39
 almacenó en un frasco con tapa rosca de color azul. El material
solido contenido en tela prefabricada se pone en un vaso de
precipitación para su posterior maceración en etanol.

 Extracto etanólico: Se tomó el material sólido y se le adicionó

900 ml de etanol al 70%, para extraer los componentes de alta
polaridad.

3.3.4 Medición de parámetros.

Se procede a medir el pH y temperatura, para poder observar el desarrollo

del experimento, las mediciones se realizaron antes y después de la
maceración, así como el extracto obtenido.

3.3.5 Caracterización química de los extractos.

Con ayuda de pipetas de 1 y 5 mL y de un pipeteador se realizaron las

pruebas químicas preliminares para estimar la presencia o ausencia de
algunos metabolitos secundarios, cuya reacción química de cada uno se da a
conocer en las figuras 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13.

A los extractos etéreos se les realizo las siguientes pruebas químicas:

1. Lieberman - Burchard: Se toma 2 mL de extracto disuelto en éter

de petróleo y se le adicionó, 1 mL de anhídrido acético y 2 gotas de
ácido sulfúrico, con el fin de identificar la presencia de esteroides y
triterpenos. Ver figura 7, (Burke, et al., 1974).

2. Prueba de Baljet: Se toma 2 mL de extracto disuelto en éter de

petróleo y se le adicionó 0,1 mL de ácido pícrico y 0,1 mL NaOH al 1
N, con el fin de identificar la presencia de glucósidos cardiotónicos y
sesquiterpenlactonas. Ver figura 8, (Orantes, 2008).

40
3. Hidroxamato férrico: Se toma 2 mL de extracto disuelto en éter de
petróleo y se le adicionaron 2 gotas de solución metanólica de
clorhidrato de hidroxilamina y 2 gotas de solución metanólica de
hidróxido de potasio. Posteriormente se calentó en baño maría y se le
agregó una gota de cloruro férrico y ácido clorhídrico. Esto con el fin
de identificar la presencia de sesquiterpenlactonas. Ver figura 9,
(Devyatnin y Parfenova, 1967).

A los extractos etanólicos se les realizo las siguientes pruebas químicas:

1. Shinoda: Se le adicionó 1 g de magnesio y 1 gota de ácido

clorhídrico a 2 mL del extracto disuelto en etanol para identificar la
presencia de flavonoides. Ver figura 10, (Dominguez, 1979).

2. Cloruro férrico: Se le adicionó 1 ml de cloruro férrico a 2 mL del

extracto disuelto en etanol para identificar la presencia de fenoles. Ver
figura 11, (Domínguez, 1979).

3. Antrona: Se toma 2 mL de extracto disuelto en etanol y se le

adicionó por la pared del tubo 1 ml de antrona disuelta en ácido
sulfúrico. Esto con el fin de identificar la presencia de glucósidos de
flavonoides. Ver figura 12, (Yemm, 1954).

4. Dragendorff: Se toma 2 mL de extracto disuelto en etanol y se le

adicionó 1 ml de ácido clorhídrico y 2 gotas del reactivo de
Dragendorff para identificar la presencia de alcaloides. Ver figura 13,
(Okwu, et al., 2007).

5. Espuma: Se le adicionó 1 ml de agua destilada a 2 mL de extracto

disuelto en etanol y se agitó fuertemente durante 5 minutos para
identificar la presencia de saponinas (Morrissey y Osboum, 1999).

Por otro lado, a los extractos de residuos de quinua se les realizó las
siguientes pruebas:

41
 1. Espuma: Se le adicionó 1 ml de agua destilada tanto al extracto
disuelto en etanol al 70 %, así como también al extracto disuelto con
éter de petróleo y se agitó fuertemente durante 5 minutos para
identificar la presencia de saponinas (Morrissey y Osboum, 1999).

2. Lieberman-Buchard: Se toma 2 mL de extracto disuelto en éter de

petróleo, así como también al extracto elaborado a partir de etanol al 70
% y se les adicionaron a ambos, 1 ml de anhídrido acético y 2 gotas de
ácido sulfúrico respectivamente, con el fin de identificar la presencia de
esteroides y triterpenos. Ver figura 7, (Burke, et al., 1974).

3. Antrona: Se toma 2 mL de extracto disuelto en etanol, así como

también el extracto disuelto en éter de petróleo y se le adicionó por la
pared de ambos tubos 1 ml de antrona disuelta en ácido sulfúrico. Esto
con el fin de identificar la presencia de glucósidos de flavonoides. Ver
figura 12, (Yemm y Willis, 1954).

3.3.6 Preparación de cultivo axénico

Se prepararon cultivos axénicos a partir de las cepas de Escherichia coli y

Staphylococcus aureus obtenidas del laboratorio de Microbiología de la
Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la U. N. C. P.

Se utilizaron como medios de cultivo el agar Chromocult para Escherichia

coli y Agar Baird Parker para Staphylococcus aureus. Para la confirmación de
Escherichia coli se hicieron las pruebas bioquímicas de Indol y Rojo Metilo y
para la confirmación de Staphylococcus aureus se realizaron las pruebas
bioquímicas de Catalasa y Coagulasa.

3.3.7 Preparación del inóculo

Para la carga microbiana 1, se esterilizó un tubo de ensayo con tapa rosca

con 10 mL de agua peptonada, se dejó enfriar y con asa de kolle estéril se
añadió la cantidad de cepa adecuada de los cultivos madre que correspondiera
con el patrón de turbidez del tubo # 2 de Mac Farland (6 x 108 ufc/mL).

42
 Luego para obtener las cargas microbianas 2 y 3, en tubos de ensayo
previamente esterilizados con 10 mL de agua peptonada se realizó el mismo
procedimiento descrito líneas arriba, obteniendo así las tres cargas
microbianas necesarias para la investigación. Para confirmar la carga
microbiana se sembraron en placas petri y se contaron las UFC.

Se realizó el mismo procedimiento para Escherichia coli y Staphylococcus

aureus.

3.3.8 Evaluación de la eficacia del desinfectante biodegradable a base de

residuos de naranja y quinua.

Se evaluaron dos tipos de maceración del extracto (etanol al 70% y éter de

petróleo), así como también siete tipos de extractos biodegradables
(Saponina, semilla, cáscara, saponina y semilla, saponina y cáscara, semilla y
cáscara, así como también la combinación de los tres), sobre tres cargas
microbianas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus por separado, frente
a dos tiempos de contacto (5 min y 10 min) de la siguiente manera:

Para E. Coli en dos tubos de ensayo previamente esterilizados se vertieron

1.4 mL de desinfectante hecho a base de residuos de quinua, se procedió
hacer lo mismo para los siguientes extractos: semillas, cáscara, saponina y
semilla, saponina y cáscara, semilla y cáscara, así como también la
combinación de los tres.

A cada uno de los catorce tubos de ensayo que contenían los diferentes
tipos de desinfectante se añadieron 0.2mL de inoculo (carga microbiana alta
15x108). Trabajando así con una relación (1:7) microorganismo y
desinfectante respectivamente.

Para S. Aureus en dos tubos de ensayo previamente esterilizados se

vertieron 1.0 mL de desinfectante hecho a base de saponina, se procedió
hacer lo mismo para los siguientes extractos: semillas, cáscara, saponina y
semilla, saponina y cáscara, semilla y cáscara, así como también la
combinación de los tres.

43
 A cada uno de los catorce tubos de ensayo que contenían los diferentes
tipos de desinfectante se añadieron 0.2mL de inoculo (carga microbiana alta
15x108). Trabajando así con una relación (1:5) microorganismo y
desinfectante respectivamente. Se agitaron los tubos y a partir de ese
momento se empezó a contabilizar los tiempos de contacto, 5 min y 10 min.

Posteriormente según se iba cumpliendo el tiempo se retiraron 0.1 mL de

las muestras de cada tubo y se sembraron en las placas petri con los medios
de cultivo Agar Chromocult para Escherichia coli y agar Baird Parker con
emulsión yema de huevo telurito para Staphylococcus aureus. Las placas se
incubaron a 37ºC por 24 horas.

Este procedimiento se llevó a cabo para cada carga microbiana alta

(15x108), media (9x108), baja (6x108) y en todos los casos se hizo por
duplicado. Tanto para Escherichia coli como para Staphylococcus aureus se
realizó el mismo procedimiento.

3.3.9 Lectura e interpretación

Al cumplirse el tiempo de incubación se hizo el recuento en placas para

Staphylococcus aureus ICMSF (International Commission on
Microbiological Specifications for Foods) 1998 y para Escherichia coli FDA
(Food and Drug Administration) 1998.

44
1,4 ó 1,0

Figura N° 16. Procedimiento para la evaluación de la eficacia del desinfectante

45
3.4. Metodología experimental

El diseño experimental se observa en las figuras 17 y 18.

VARIABLES:

Variable dependiente:

 % de inhibición de Escherichia coli.

 % de inhibición de Staphylococcus aureus.

Variables independientes:

 Tipo de solvente utilizado en la maceración: etanol al 70% y éter de

petróleo al 99,8%.

 Tipo del desinfectante biodegradable: Saponina, semilla, cáscara,

saponina y semilla, saponina y cáscara, semilla y cáscara, así como
también la combinación de los tres.

 Tiempo de contacto con el desinfectante biodegradable: 5 y 10 minutos

 Carga microbiana: alta, media y baja

Para el procesamiento de datos se realizó un ANOVA con un α = 5% y la

prueba de Tukey, para determinar la significancia de las variables de estudio.

El procesamiento de estos datos se realizó usando el paquete estadístico SPSS

versión 21.

46
 CM1

S P C Sy Sy Py S, P y
P C C C

θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ 1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2

CM2

S P C Sy Sy Py S, P y
P C C C

θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ 1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2

CM3

S P C Sy Sy Py S, P y
P C C C

θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ 1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2

Numeración de
Escherichia Coli

Figura N° 17. Esquema del diseño experimental para Escherichia coli.

47
 CM1

S P C Sy Sy Py S, P y
P C C C

θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ 1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2

CM2

S P C Sy Sy Py S, P y
P C C C

θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ 1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2

CM3

S P C Sy Sy Py S, P y
P C C C

θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ 1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2 θ1 Θ2

Numeración de
Staphylococcus aureus

Figura N° 18. Esquema del diseño experimental para Staphylococcus aureus

48
Leyenda:

S = Residuos de quinua blanca de Junín (Saponina)

P = Semilla de naranja

C = Cáscara de naranja

SyP = Saponina y semilla de naranja (1:1)

SyC = Saponina y cáscara de naranja (1:1)

PyC = Semilla y cáscara de naranja (1:1)

S, P y C = saponina, semilla y cáscara de naranja (0,33: 0,33:0,33)

θ1 = 5 min de tiempo de contacto

θ2 = 10 min de tiempo de contacto

CM1 = carga microbiana alta (15 x 108 Ufc/mL)

CM2 = carga microbiana media (9 x 108 Ufc/mL)

CM3 = carga microbiana baja (6 x 108 Ufc/mL)

49
 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1. Análisis químico de los solventes antes y durante la extracción.

Tabla 7. Análisis químico de los solventes de extracción.

Parámetros
pH Temperatura
(°C)
Agua destilada 7,0 15,6
Alcohol al 70% 7,0 15,3
Fuente: Propia

En la tabla 7 se observa el pH del alcohol y del agua destilada antes de la

maceración de los residuos de naranja y saponina. El agua destilada presentó
un valor de 7,0, lo cual de acuerdo con (Kemmer, 1989), está dentro del rango
normal para agua destilada que es entre 5,8 y 7,4. El pH del alcohol se
encontró en 7,0 que según el mismo autor (Kemmer, 1989) el pH del alcohol
etílico se encuentra en un rango de 6,0 a 8,0.

Tabla 8. Resultados de la medición periódica de los extractos.

Parámetros (alcohol 70 %)
Fecha pH Temperatura
(°C)
02-Feb-16 7,0 15,5
03-Feb-16 6,9 15,2
04-Feb-16 6,6 15,7
05-Feb-16 6,0 15,5
06-Feb-16 5,5 15,5
07-Feb-16 5,5 15,5
Fuente: Propia

Como se observa en la tabla 8, el valor promedio del pH después de la

maceración fue de 5,5, manteniendo la tendencia a la acidez, lo cual
posiblemente se deba a la extracción de los ácidos que tienen los residuos de
la naranja y saponina; ácido cítrico, ácido ascórbico, ácidos grasos
insaturados, saponina, ácidos orgánicos (Liñan, 2013).

50
 El pH empezó con un valor de 7,0 y alcanzó un valor de 5,5 teniendo la
tendencia de acidez.

En el proceso de maceración la temperatura facilita la disolución de las

sustancias extraíbles, la temperatura contribuye al desplazamiento de la
constante de equilibrio de saturación y aumenta la eficiencia del proceso. Sin
embargo, muchos principios activos son termolábiles y pueden ser destruidos,
total o parcialmente, a temperaturas elevadas (Sharapin, 2000). Por esto se
evitó que el proceso se someta a altas temperaturas y se deba mantener a
temperatura ambiente.

De acuerdo con Fonnegra y Jimenez, (2007), la maceración es un proceso

que se realiza a temperatura ambiente (14 a 25 ºC), por lo que las
concentraciones presentan la temperatura adecuada teniendo un promedio de
15 ºC.

Entre los solventes generales, los más utilizados son los alcoholes
alifáticos de hasta tres carbonos o mezclas de estos con el agua. Estos
solventes logran extraer la gran mayoría de las sustancias naturales de interés
como alcaloides, flavonoides y terpenos. El alcohol etílico al 70 % y al 80 %
es el solvente por excelencia para la extracción de las partes leñosas de la
planta, raíces y semillas (Sharapin, 2000). Por lo que, la concentración de
alcohol etílico que se utilizó fue el adecuado para realizar la extracción del
principio activo de las saponina, cáscaras y semillas de naranja que van a
contribuir para la eficiencia del producto.

4.2. Obtención de los extractos

El rendimiento en base seca de la saponina, en la fracción etérea fue de

2,213 %, siendo menor que el rendimiento de la semilla 3,505 %, pero mayor
al rendimiento de la cáscara 1,032 %. No obstante, se debe tener en cuenta la
completa volatilización del solvente no polar (éter de petróleo) en la
concentración, es por eso que al final se agregó 50 mL de agua destilada para
poder usarlo como desinfectante. Por otro lado, en la fracción etanólica, hubo

51
diferentes rendimientos, en el caso del rendimiento en base seca del
desinfectante de saponina fue de 5,4 %, desinfectante de semilla fue de 7,17
% y en el desinfectante de cascará fue de 4,37 %, debido a que el solvente no
se volatilizo (etanol al 70 %) en la concentración, no hubo necesidad de
agregar agua destilada. En cuanto a las semillas de naranja en la fracción
etérea se observa que obtiene un mayor rendimiento frente a los otros 2
desinfectantes, en la fracción etanólica se observa de igual forma un mayor
rendimiento en comparación con los otros 2 desinfectantes. Pero tanto en la
fracción etérea como etanólicas, la cantidad de alcaloides encontrados en el
desinfectante de semillas son mayores que los otros 2. Ello demuestra la
eficacia de este desinfectante.

Tabla 9. Peso obtenido y rendimiento de los residuos de quinua macerado

con éter de petróleo

Ingresa Sale (g) Continua en

(g) proceso (g)
Pesado 100,034 - 100,034
Macerado 900,000 - 1000,034
Centrifugación - 100,500 899,534
Concentración - 897,321 2,213
(rotaevaporador)
Dilución en H2O 50 - 52,213

52
Tabla 10. Peso obtenido y rendimiento de la cáscara de naranja macerado
con éter de petróleo

Ingresa (g) Sale (g) Continua en

proceso (g)
Pesado 100,042 - 100,042
Macerado 900,000 - 1000,042
Centrifugación - 100,890 899,152
Concentración - 898,120 1,032
(rotaevaporador)
Dilución en H2O 50 - 51,032

Tabla 11. Peso obtenido y rendimiento de la semilla de naranja macerado

con éter de petróleo

Ingresa (g) Sale (g) Continua en

proceso (g)
Pesado 100,028 - 100,028
Macerado 900,000 - 1000,028
Centrifugación - 100,543 899,485
Concentración - 895,980 3,505
(rotaevaporador)
Dilución en H2O 50 - 53,505

53
Tabla 12. Peso obtenido y rendimiento de los residuos de quinua
macerado con etanol al 70 %.

Ingresa (g) Sale (g) Continua en

proceso (g)
Pesado 100,064 - 100,064
Macerado 900,00 - 1000,064
Centrifugación - 100,274 899,790
Concentración - 742,490 157,300
(rotaevaporador)
Evaporación - 151,9 5,4
(Estufa)

Tabla 13. Peso obtenido y rendimiento de cascará de naranja macerado

con etanol al 70 %.

Ingresa (g) Sale (g) Continua en

proceso (g)
Pesado 100,026 - 100,026
Macerado 900,00 - 1000,026
Centrifugación - 100,675 899,351
Concentración - 734,851 164,5
(rotaevaporador)
Evaporación - 160,13 4,37
(Estufa)

54
Tabla 14. Peso obtenido y rendimiento de la semilla de naranja macerado
con etanol al 70 %.

Ingresa (g) Sale (g) Continua en

proceso (g)
Pesado 100,084 - 100,084
Macerado 900,00 - 1000,084
Centrifugación - 100,576 899,508
Concentración - 753,678 145,83
(rotaevaporador)
Evaporación - 138,66 7,17
(Estufa)

En general, el rendimiento de los extractos de las cáscaras a partir de la

fracción etanólica es superior al que se obtiene en la fracción etérea. Esto
puede deberse a que la mayoría de metabolitos secundarios de las cáscaras
son de polaridad alta, pues al incrementar la polaridad del solvente se
incrementa la cantidad de metabolitos obtenidos. Esto se evidencia también
con los rendimientos obtenidos en el trabajo de Rehman, 2006. Los cuales
fueron de 11 % y 7,88 % de las fracciones etanólicas y etéreas
respectivamente de la cáscara de un cítrico. Comparado con estos resultados,
la fracción etérea obtenida tuvo mucho menor rendimiento, por lo que el
cítrico empleado en ese estudio pudo ser diferente a los empleados en el
presente trabajo. En otro trabajo, realizado por (Chanthaphon y
Hongpattarakere, 2008), en donde utilizaron acetato de etilo (un solvente
menos polar que el etanol y más polar que el éter de petróleo) para extraer
los metabolitos de cáscaras de mandarina y toronja, se obtuvieron
rendimientos de 2,44 % y 1,57 % respectivamente. Estos rendimientos son
más bajos que los obtenidos en este trabajo por la fracción etérea pero más
altos que los obtenidos en la fracción etanólica, apoyando la sugerencia
planteada que a mayor polaridad del solvente se extrae una mayor cantidad

55
 de metabolitos (saponina, aldehídos, cetonas, esteres, flavonoides, sustancias
azufradas y nitrogenadas) y por lo tanto se mejora el rendimiento de los
extractos.

Por otro lado, el rendimiento de la semilla de naranja extraída con éter de

petróleo fue el más alto comparado con los otros 2 desinfectantes. Sin
embargo, (Nwobi, et al., 2006) reportan un rendimiento del 36 % utilizando
el mismo solvente. Similarmente, (Anwar, et al., 2008) obtuvieron
rendimientos bajos, 27 % para naranja, utilizando n-hexano como solvente.

Por otro lado, el rendimiento de semillas de la fracción etanólica fue

también óptimo y comparable con el rendimiento obtenido por (Luzia y
Neuza, 2010) con la fracción metanólica de semilla de limón el cual fue del
11 %. En general se obtuvo un rendimiento más bajo en comparación con el
estudio mencionados, posiblemente a la poca cantidad de metabolitos
secundarios presentes tanto en las cáscaras como en las semillas,
posiblemente al estado de maduración avanzado en que se encontraban los
frutos, haciendo que se encontrara poca cantidad de estos.

4.3. Pruebas químicas preliminares

Los resultados arrojados por las pruebas químicas preliminares se encuentran

resumidos en la tabla 15

Tabla 15. Resultados de las pruebas químicas preliminares realizadas a cada

extracto.

Saponina Cáscara Semilla

Lieberman-Buchard - + +
Baljet - - +
Hidroxamato - + +
férrico
Shinoda - + +
Cloruro férrico - + +
Antronas + + +
Dragendorff - - -
Espuma + - -

56
 Al realizar la prueba de Lieberman-Buchard sobre los extractos de las
cáscaras y semillas de naranja de las especies estudiadas estos se tornaron de
un color verde, dando un resultado positivo para esta prueba e indicando la
presencia de esteroides y triterpenos. Este cambio de coloración se debe a
que el anhídrido acético reacciona con el grupo hidroxilo ubicado en la
posición 3 del esteroide o triterpeno, produciendo un éster (Figura 9).
Adicionalmente ocurre una deshidratación cuando el esteroide contiene una
instauración en la posición 5, haciendo que ocurra el cambio de coloración,
(Burke, et al., 1974).

Los fitoesteroles tienen una función estructural ya que forman parte de las
membranas celulares, estando involucrados en la permeabilidad de estas y en
la transducción de señales. También desempeñan funciones metabólicas
ayudando a la diferenciación y proliferación de tejidos meristematicos y
semillas, razón por la cual los fitoesteroles se encuentran en abundancia en
las semillas. Caso contrario ocurre con la saponina ya que no presento
cambio de coloración dando evidencia que no se encuentra la presencia de
esteroides, (Gül y Amar, 2006).

El extracto de semilla se tornó de un color naranja oscuro al aplicar el

reactivo de Baljet. El cambio de color indica la presencia de glicósidos
cardiotónicos y/o sesquiterpenlactonas en el extracto de semilla de la naranja
(Figura 8). Este cambio se debe a que el ácido pícrico (componente del
reactivo de Baljet) forma un complejo con las lactonas α, β y γ insaturadas
presentes en estos compuestos (Orantes, 2008)

A pesar del resultado positivo obtenido en los extractos de las semillas,

las sesquiterpenlactonas no son muy comunes en los cítricos debido a que
estas se encuentran principalmente en la familia asteraceae sin embargo
(Bedoya, et al., 2008), mencionan la presencia de sesquiterpenlactonas en la
familia rutaceae. De igual manera ocurre con los glicósidos cardiotónicos,
pues (Melero y Medarde, 2000), no reportan que la familia rutaceae
contenga estos compuestos, resultados corroborados por (Payo, et al., 1996),

57
quienes realizaron un estudio fotoquímico a varias plantas, incluyendo una
rutaceae y reportaron la ausencia de glicósidos cardiotónicos en esta.

Sin embargo, la prueba de Baljet es muy sensible con otros compuestos

similares a los glicósidos cardiotónicos, como los azúcares, pues presentan
una estructura química similar y por este motivo hay reacción de los
azúcares con el reactivo de Baljet, haciendo la prueba positiva. Azúcares
como la glucosa, rabinosa y sacarosa son abundantes en los frutos, haciendo
que la prueba de Baljet resultara positiva en los extractos obtenidos.

La prueba del hidroxamato férrico arrojó un resultado positivo tanto en

los extractos de cáscaras como de semillas debido a que la muestra se tornó
de color marrón. Este cambio de color se debe a que la hidroxilamina
convierte las lactonas en ácidos hidroxámicos, los cuales, junto con Fe3+ en
un medio ácido, forma el hidroxamato férrico (Figura 9), el cual tiene el
color característico marrón y violeta (Devyatnin y Parfenova, 1967).

A pesar que la prueba del hidroxamato férrico se hace principalmente

para sesquiterpenlactonas y ésta fue positiva, es inevitable dudar este
resultado ya que anteriormente se había mencionado que las rutáceas no
presentan (ó en poca cantidad) sesquiterpenlactonas. Este fenómeno puede
deberse a que la hidroxilamina puede reaccionar también con las cumarinas,
las cuales son compuestos derivados de la lactona, haciendo que la prueba
arroje un resultado positivo (Domínguez, 1979).

Es muy probable que el resultado positivo de la prueba se deba a la

presencia de cumarinas, pues (Domínguez, 1979), menciona que estas se
encuentran con frecuencia en frutos y hojas de rutáceas, llegando a haber
aproximadamente 200 cumarinas diferentes en esta familia. Adicional a esto
las cumarinas han sido encontradas en hojas y tallos de rutaceae.

En la prueba de Shinoda, la solución de extractos de cáscaras y semilla se

tornaron rojos ó anaranjados, además de observarse el desprendimiento de
un gas. Estos dos fenómenos de la prueba se deben a la reacción del

58
magnesio con el HCl, dando como producto H2 (el gas que se desprende) y
MgCl2 el cual reacciona con los flavonoides (Figura 10) otorgando la
coloración característica (Vidaurre, et al., 2007).

Las coloraciones naranjas, violetas o rojas indican la presencia de

flavonoides que tienen núcleo de γ-benzopirona, como las flavonas, los
flavonoles, flavanonas, flavononoles, isoflavonoides y xantonas. Los
flavonoides más comunes en citrus son los glucósidos de flavanona y las
flavonas polimetoxiladas; dentro del primer grupo están compuestos como la
naringina y la hesperidina, y en el segundo grupo están la nobiletina,
sinesetina, tangeretina, entre otros (Lu, et al., 2006). Los contenidos de estos
flavonoides en las cáscaras y semillas fueron altos y por esto la prueba dio
positiva, pues (Lima, et al., 2007). Mencionan la presencia de flavonoides en
semillas y (Iglesias, et al., 2007). Comentan que la mayoría de flavonoides
se encuentran en la cáscara de los cítricos.

Las soluciones de los extractos de cáscara y semillas se tornaron de color

marrón al agregar cloruro férrico, indicando la presencia de fenoles
derivados del catecol en los extractos. Este cambio de coloración también
puede deberse a la presencia de otros compuestos similares, como los
hidroxibenzalaldehidos o las cetonas (Figura 11), los cuales adquieren
coloraciones oscuras que van desde el rojo al púrpura (Geissman, 1973).

La prueba de antrona dio un resultado positivo para los extractos de

saponina, cáscara y semillas al formarse un anillo de color verde en la
interface. Este cambio de coloración se debe a una deshidratación de los
azúcares y formación de furfurales o derivados de estos (Figura 12), los
cuales reaccionan con la antrona junto con el ácido sulfúrico (Yemm y
Willis, 1954)

Este resultado indica la presencia de azúcares en los extractos como los

glicósidos de flavonoides, en donde en los cítricos están principalmente la
hesperidina el cual es el más abundante en citrus sinensis y la naringina en
toronjas y pomelos. También pueden encontrarse carbohidratos como las

59
 pentosas y las hexonas, las cuales están en los tejidos vegetales. Algunos de
estos son la glucosa, arabinosa, fructosa y galactosa, que también reaccionan
con la antrona haciendo que se dé un resultado positivo (Domínguez, 1979).

La prueba de Dragendorff dio un resultado negativo debido a que no se

formó precipitado al adicionar el reactivo de dragendorff (Domínguez,
1979). Sin embargo, (Okwu, et al., 2007) reportaron la presencia de
alcaloides en altas cantidades en las cáscaras y hojas de varios cítricos;
demostrando la ausencia de alcaloides en los extractos (Figura 15). Esto
posiblemente se debe a que los frutos empleados por (Okwu, et al., 2007),
estaban inmaduros mientras que los empleados en este estudio se
encontraban maduros, pues se sabe que los alcaloides disminuyen durante la
maduración.

Finalmente, la prueba de saponinas dio un resultado negativo para los

extractos de semilla y cascará pues no hubo formación de espuma después
de agitar las soluciones de extractos. Caso contrario ocurrió con los residuos
de quinua lo cual dio un resultado positivo. Esta prueba se fundamenta en
que las saponinas tienen la capacidad de disminuir la tensión superficial del
agua, lo que hace que al agitar la solución se forme espuma estable
(Morrissey y Osbourn, 1999).

4.4. EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DEL DESINFECTANTE

4.1.1. Escherichia coli

4.1.1.1. Desinfectante macerado con etanol al 70 % y éter de petróleo

La tabla 16 y 17 corresponde a los microorganismos sobrevivientes

luego de la acción del desinfectante saponina; semilla; cáscara; saponina
y semilla; saponina y cáscara; semilla y cáscara; saponina, semilla y
cáscara. Sobre tres cargas microbianas de E coli, con 5 min y 10 min de
tiempo de contacto.

60
 Tabla N° 16. Ufc de Escherichia coli residual tratados con el desinfectante
natural con etanol al 70 %

Ufc/mL Tipo de Tiempo Ensayo Repetición Promedio ± C.V.

Inicial desinfectante de Ufc/mL Ufc/mL D.E.
contacto
Saponina 5 min 19630 19710 19670 ± 5,66 0,00029
10 min 13610 13530 13570 ± 5,66 0,00042
Semilla 5 min 920 950 935 ± 2,12 0,00227
10 min 0 0 0 0
Cáscara 5 min 23790 23750 23770 ± 2,83 0,00012
Ufc/mL 10 min 19200 19250 19225 ± 3,54 0,00019
Alta Saponina y 5 min 7500 7460 7480 ± 2,83 0,00038
(15,0 x semilla 10 min 0 0 0 0
108) Saponina y 5 min 15560 15670 15615 ± 7,78 0,00049
cáscara 10 min 13760 13800 13780 ± 2,83 0,00021
Semilla y 5 min 7560 7820 7690 ± 18,38 0,00239
cáscara 10 min 0 0 0 0
Saponina, 5 min 2660 2690 2675 ± 2,12 0,00079
semilla y
10 min 430 400 415 ± 2,12
cáscara 0,00511
Saponina 5 min 11245 ±
11410 11080
23,33 0,00207
10 min 6560 6550 6555 ± 0,70 0,00010
Semilla 5 min 300 280 290 ± 1,41 0,00488
Ufc/mL 10 min 0 0 0 0
Media Cáscara 5 min 12180 12140 12160 ± 2,83 0,00023
(9,0 x 10 min 5640 5550 5595 ± 6,36 0,00114
108) Saponina y 5 min 4500 4450 4475 ± 3,54 0,00079
semilla 10 min 0 0 0 0
Saponina y 5 min 11110 11070 11090 ± 2,83 0,00025
cáscara 10 min 8350 8230 8290 ± 8,48 0,00102
Semilla y 5 min 4160 4120 4140 ± 2,83 0,00068
cáscara 10 min 0 0 0 0
Saponina, 5 min 2310 2700 2505 ± 27,58 0,01101
semilla y 10 min
cáscara 50 100 75 ± 3,54 0,04714
Saponina 5 min 9010 9230 9120 ± 15,56 0,00171
10 min 2810 2770 2790 ± 2,83 0,00101
Semilla 5 min 0 0 0 0
10 min 0 0 0 0
Cáscara 5 min 7760 7800 7780 ± 2,83 0,00036
Ufc/mL 10 min 5280 5020 5150 ± 18,.38 0,00357
Baja Saponina y 5 min 4000 3890 3945 ± 7,78 0,00197
(6,0 x semilla 10 min 0 0 0 0
108) Saponina y 5 min 9100 9210 9155 ± 7,78 0,00084

61
 cáscara 10 min 4860 4660 4760 ± 14,14 0,00297
Semilla y 5 min 2870 2670 2770 ± 14,14 0,00510
cáscara 10 min 0 0 0 0
Saponina, 5 min 1560 1700 1630 ± 9,89 0,00607
semilla y 10 min
cáscara 0 0 0 0
Tabla N° 17. Ufc de Escherichia coli residual tratados con el desinfectante
natural con éter de petróleo.

Ufc/mL Tipo de Tiempo Ensayo Repetición Promedio ± C.V.

Inicial desinfectante de Ufc/mL Ufc/mL D.E.
contacto
Saponina 5 min 28180 28190 28185 ± 0,71 0,00002
10 min 21560 21610 21585 ± 3,54 0,00016
Semilla 5 min 21590 21620 21605 ± 2,12 0,00009
10 min 17030 17100 17065 ± 4,95 0,00029
Cáscara 5 min 24340 24300 24320 ± 2,83 0,00012
Ufc/mL 10 min 18210 18180 18195 ± 2,12 0,00012
Alta Saponina y 5 min 18150 18070 18110 ± 5,66 0,00031
(15,0 x semilla 10 min 10170 10110 10140 ± 4,24 0,00042
108) Saponina y 5 min 18070 18160 18115 ± 6,36 0,00035
cáscara 10 min 12180 12270 12225 ± 6,36 0,00052
Semilla y 5 min 15300 15330 15315 ± 2,12 0,00014
cáscara 10 min 9990 10000 9995 ± 0,71 0,00007
Saponina, 5 min 18300 18220 18260 ± 5,66 0,00031
semilla y
10 min 10050 10100
cáscara 10075 ± 3,53 0,00035
Saponina 5 min 23670 23690 23680 ± 1,41 0,00006
10 min 16180 16210 16195 ± 2,12 0,00013
Semilla 5 min 16360 16290 16325 ± 4,95 0,00030
10 min 10370 10340 10355 ± 2,12 0,00020
Ufc/mL Cáscara 5 min 17620 17600 17610 ± 1,41 0,00008
Media 10 min 13610 13560 13585 ± 3,53 0,00026
(9,0 x Saponina y 5 min 13740 13670 13705 ± 4,95 0,00036
108) semilla 10 min 4820 4770 4795 ± 3,53 0,00073
Saponina y 5 min 12840 12830 12835 ± 0,71 0,00006
cáscara 10 min 9530 9550 9540 ± 1,41 0,00015
Semilla y 5 min 10290 10340 10315 ± 3,53 0,00034
cáscara 10 min 5550 5510 5530 ± 2,83 0,00051
Saponina, 5 min 13750 13820 13785 ± 4,95 0,00036
semilla y 10 min
cáscara 9780 9820 9800 ± 2,83 0,00029
Saponina 5 min 15230 15170 15200 ± 4,24 0,00028
10 min 11660 11710 11685 ± 3,53 0,00030
Semilla 5 min 13510 13580 13545 ± 4,95 0,00036
10 min 5270 5220 5245 ± 3,53 0,00067

62
Ufc/mL Cáscara 5 min 13720 13790 13755 ± 4,95 0,00036
Baja 10 min 9230 9190 9210 ± 2,83 0,00031
(6,0 x Saponina y 5 min 8270 8330 8300 ± 4,24 0,00051
108) semilla 10 min 5360 5300 5330 ± 4,24 0,00079
Saponina y 5 min 9500 9460 9480 ± 2,83 0,00029
cáscara 10 min 5390 5450 5420 ± 4,24 0,00078
Semilla y 5 min 6120 6060 6090 ± 4,24 0,00069
cáscara 10 min 5110 5030 5070 ± 5,66 0,00112
Saponina, 5 min 9170 9240 9205 ± 4,95 0,00054
semilla y 10 min
cáscara 6210 6140 6175 ± 4,95 0,00080
Para el procesamiento de datos se realizaron estadísticos descriptivos,
ANOVA con un nivel de significancia del 5 % y pruebas de Tukey.

4.1.1.2. Ensayo control con el desinfectante Kilol L-20

Tabla N° 18. Ufc después de la acción del desinfectante Kilol L-20

Ufc/mL Tiempo
E. COLI Tipo de de Ensayo Repetición Promedio ±
Inicial desinfectante contacto ufc/mL ufc/mL D.E. C.V.

Ufc/mL Kilol L-20 5 min 7890 7840 7865 ± 3,54 0,00045

Alta (15,0 (Puro)
x 108) 10 min 5910 5930 5920 ± 1,41 0,00024
Ufc/mL Kilol L-20 5 min 1560 1610 1585 ± 3,54 0,00223
Media (Puro) 10 min 490 500 495 ± 0,71 0,00143
(9,0 x 108)
Ufc/mL Kilol L-20 5 min 10 20 15 ± 0,71 0,04714
Baja (6,0 (Puro) 10 min 0 0 0 0
x 108)

Los resultados de la tabla 18 nos indica que el desinfectante Kilol L-20, es

mucho más efectivo que los desinfectantes en estudio, debido a que este cuenta
con excipientes (Vitamina c, etc.), que ayudan a la eficacia de dicho producto.
Pero los resultados reportados para E. coli de nuestra investigación, siguen una
tendencia similar, por ende, se puede decir que los desinfectantes en estudio
son eficaces.

63
 Tabla N° 19. Análisis de Varianza del porcentaje de inhibición E. coli

Variable dependiente: MICROORG.FINAL

Origen Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.
tipo III
Modelo corregido 8213057440,476a 83 98952499,283 21674,081 ,000
Intersección 14610410059,524 1 14610410059,524 3200194,120 ,000
EXTRACCION 2237596038,095 1 2237596038,095 490112,300 ,000
DESINFECTANTE 2284509740,476 6 380751623,413 83398,009 ,000
TIEMPO 846095716,667 1 846095716,667 185324,746 ,000
CARGA 1418416508,333 2 709208254,167 155341,573 ,000
EXTRACCIÓN * 644934861,905 6 107489143,651 23543,906 ,000
DESINFECTANTE
EXTRACCIÓN * TIEMPO 25210752,381 1 25210752,381 5522,042 ,000
EXTRACCIÓN * CARGA 71730929,762 2 35865464,881 7855,799 ,000
DESINFECTANTE * TIEMPO 40259366,667 6 6709894,444 1469,703 ,000
DESINFECTANTE * CARGA 321300741,667 12 26775061,806 5864,681 ,000
TIEMPO * CARGA 24889015,476 2 12444507,738 2725,785 ,000
EXTRACCIÓN * 47169397,619 6 7861566,270 1721,960 ,000
DESINFECTANTE * TIEMPO
EXTRACCIÓN * 174018620,238 12 14501551,687 3176,350 ,000
DESINFECTANTE * CARGA
EXTRACCIÓN * TIEMPO * 2815251,190 2 1407625,595 308,320 ,000
CARGA
DESINFECTANTE * TIEMPO * 35031801,190 12 2919316,766 639,433 ,000
CARGA
EXTRACCIÓN *
DESINFECTANTE * TIEMPO * 39078698,810 12 3256558,234 713,301 ,000
CARGA
Error 383500,000 84 4565,476
Total 22823851000,000 168
Total corregida 8213440940,476 167
a. R cuadrado = 0,99999 (R cuadrado corregida = 0,99998)
b. coeficiente de variación = 0,00143526 = 0,14%

Los resultados de la tabla 19 nos demuestran que hay diferencias

significativas con un valor de p<0,05, para todas las variables independientes.
Lo cual nos indicó que estas variables influyen en la eficacia del desinfectante.

64
 Como encontramos diferencias significativas en el análisis de varianza se
procedió a realizar las pruebas de Tukey que se encuentran en el anexo 01, 02,
03 y 04, los cuales nos muestran que al utilizar la extracción del desinfectante
(etanol al 70 % y éter de petróleo), carga microbiana (baja, media y alta); tipo
de desinfectante (saponina, semilla, cáscara, saponina y semilla, saponina y
cáscara, semilla y cáscara, saponina, semilla y cáscara) y tiempo de contacto (5
y 10 min) si presentaron diferencias significativas.

Por otro lado, el análisis de varianza nos reporta un coeficiente de variación

de 0,14 %, lo cual nos indica que la población en estudio es poco dispersa y
bastante homogénea.

Figura N° 19. Método de extracción del desinfectante natural en E. coli

En la figura N° 19, se observa las medias marginales de los

microorganismos sobrevivientes luego de la acción del desinfectante, y se
puede concluir que el mejor solvente de maceración para los extractos fue
obtenido con etanol al 70%. Datos que se confirma en el anexo 01, donde se
muestra la prueba de Tukey confirmando lo mencionado.

65
 Figura N° 20. Carga microbiana de E. coli sobreviviente

En la figura N° 20, se observa las medias marginales de los

microorganismos sobrevivientes luego de la acción del desinfectante, y se
puede concluir que la mejor carga microbiana utilizada para estos extractos es
con una carga microbiana baja. Datos que se confirman en el anexo 02, donde
se muestra la prueba de Tukey.

Figura N° 21. Desinfectantes utilizados en E. coli

66
 En la figura N° 21, se observa las medias marginales de los
microorganismos sobrevivientes luego de la acción del desinfectante, y se
puede concluir que el mejor desinfectante utilizado para esta investigación se
logra con una mezcla de semilla y cáscara (50:50). Datos que se confirman en
el anexo 03, donde se muestra la prueba de Tukey.

Figura N° 22. Tiempo de acción del desinfectante en E. coli

En la figura N° 22, se observa las medias marginales de los

microorganismos sobrevivientes luego de la acción del desinfectante, y se
puede concluir que el mejor tiempo de acción del desinfectante en E. coli se
logra con 10 minutos. Datos que se confirman en el anexo 04, donde se
muestra la prueba de Tukey.

67
 4.1.2. Staphylococcus aureus

4.1.2.1. Desinfectante a base de etanol al 70 % y éter de petróleo

La tabla 20 y 21 corresponde a los microorganismos sobrevivientes

luego de la acción del desinfectante saponina; semilla; cáscara; saponina y
semilla; saponina y cáscara; semilla y cáscara; saponina, semilla y cáscara.
sobre tres cargas microbianas de S. aureus, con 5 min y 10 min de tiempo
de contacto.

Tabla N° 20. Ufc de Staphylococcus aureus residual tratados con el

desinfectante natural obtenido con etanol al 70 %
Ufc/mL Tipo de Tiempo Ensayo Repetición Promedio ± C.V.
Inicial desinfectante de ufc/mL ufc/mL D.E.
contacto
Saponina 5 min 22140 22200 22170 ± 4,24 0,00019
10 min 15920 15960 15940 ± 2,83 0,00018
Semilla 5 min 4460 4500 4480 ± 2,83 0,00063
10 min 870 900 885 ± 2,12 0,00239
Cáscara 5 min 17820 17800 17810 ± 1,41 0,00008
10 min 14310 14390 14350 ± 5,66 0,00039
Ufc/mL Saponina y 5 min 12730 12780 12755 ± 3,54 0,00028
Alta semilla 10 min 2460 2410 2435 ± 3,54 0,00145
(15,0 x Saponina y 5 min 21050 21170 21110 ± 8,49 0,00040
108) cáscara 10 min 14240 14320 14280 ± 5,66 0,00039
Semilla y 5 min 3900 3870 3885 ± 2,12 0,00055
cáscara 10 min 400 440 420 ± 2,83 0,00673
Saponina, 5 min 4870 4930 4900 ± 4,24 0,00086
semilla y
10 min 840 890 865 ± 3,54
cáscara 0,00408
Saponina 5 min 16010 16090 16050 ± 5,66 0,00035
10 min 8110 8170 8140 ± 4,24 0,00052
Semilla 5 min 2530 2560 2545 ± 2,12 0,00083
10 min 0 0 0 0
Cáscara 5 min 15270 15210 15240 ± 4,24 0,00028
Ufc/mL 10 min 14880 14840 14860 ± 2,83 0,00019
Media Saponina y 5 min 7730 7660 7695 ± 4,95 0,00064
(9,0 x semilla 10 min 0 0 0 0
108) Saponina y 5 min 15790 15870 15830 ± 5,66 0,00035
cáscara 10 min 13610 13670 13640 ± 4,24 0,00031
Semilla y 5 min 1320 1370 1345 ± 3,54 0,00263
cáscara 10 min 410 440 425 ± 2,12 0,00499
Saponina, 5 min 3270 3330 3300 ± 4,24 0,00128

68
 semilla y 10 min
0 0 0
cáscara 0
Saponina 5 min 5800 5910 5855 ± 7,78 0,00132
10 min 2800 2870 2835 ± 4,95 0,00174
Semilla 5 min 1000 940 970 ± 4,24 0,00437
10 min 0 0 0 0
Cáscara 5 min 7800 7740 7770 ± 4,24 0,00054
10 min 3940 3880 3910 ± 4,24 0,00108
Ufc/mL Saponina y 5 min 1620 1560 1590 ± 4,24 0,00267
Baja semilla 10 min 0 0 0 0
(6,0 x Saponina y 5 min 9160 9220 9190 ± 4,24 0,00046
108) cáscara 10 min 4890 4930 4910 ± 2,83 0,00058
Semilla y 5 min 700 750 725 ± 3,54 0,00488
cáscara 10 min 0 0 0 0
Saponina, 5 min 2460 2750 2605 ± 20,51 0,00787
semilla y 10 min
cáscara 50 90 70 ± 2,83 0,04040

Tabla N° 21. Ufc de Staphylococcus aureus residual tratados con el

desinfectante natural obtenido con éter de petróleo.

Ufc/mL Tipo de Tiempo Ensayo Repetición Promedio ± C.V.

Inicial desinfectante de Ufc/mL Ufc/mL D.E.
contacto
Saponina 5 min 31280 31170 31225 ± 7,78 0,00025
10 min 22850 22830 22840 ± 1,41 0,00006
Semilla 5 min 16860 16930 16895 ± 4,95 0,00029
10 min 9820 9740 9780 ± 5,66 0,00058
Cáscara 5 min 39280 39200 39240 ± 5,66 0,00014
Ufc/mL 10 min 16330 16280 16305 ± 3,53 0,00022
Alta Saponina y 5 min 31280 31360 31320 ± 5,66 0,00018
(15,0 x semilla 10 min 22610 22680 22645 ± 4,95 0,00021
108) Saponina y 5 min 40510 40630 40570 ± 8,48 0,00021
cáscara 10 min 21830 21730 21780 ± 7,07 0,00032
Semilla y 5 min 16280 16370 16325 ± 6,36 0,00039
cáscara 10 min 10770 10830 10800 ± 4,24 0,00039
Saponina, 5 min 25950 25910 25930 ± 2,83 0,00011
semilla y
10 min 15850 15830
cáscara 15840 ± 1,41 0,00009
Saponina 5 min 21730 21760 21745 ± 2,12 0,00005
10 min 13840 13930 13885 ± 6,36 0,00046
Semilla 5 min 13440 13480 13460 ± 2,83 0,00021
10 min 5790 5850 5820 ± 4,24 0,00073
Cáscara 5 min 33980 33910 33945 ± 4,95 0,00015

69
Ufc/mL 10 min 23190 23250 23220 ± 4,24 0,00018
Media Saponina y 5 min 26630 26700 26665 ± 4,95 0,00019
(9,0 x semilla 10 min 16870 16930 16900 ± 4,24 0,00025
108) Saponina y 5 min 38760 38840 38800 ± 5,66 0,00015
cáscara 10 min 31440 31490 31465 ± 3,53 0,00011
Semilla y 5 min 14910 14870 14890 ± 2,83 0,00019
cáscara 10 min 12150 12230 12190 ± 5,66 0,00046
Saponina, 5 min 19910 19860 19885 ± 3,53 0,00018
semilla y 10 min
cáscara 9140 9180 9160 ± 2,83 0,00031
Saponina 5 min 16340 16370 16355 ± 2,12 0,00013
10 min 12340 12440 12390 ± 7,07 0,00057
Semilla 5 min 9180 9120 9150 ± 4,24 0,00046
10 min 0 0 0 0
Cáscara 5 min 23290 23320 23305 ± 2,12 0,00009
Ufc/mL 10 min 17940 17840 17890 ± 7,07 0,00039
Baja Saponina y 5 min 16340 16290 16315 ± 3,53 0,00022
(6,0 x semilla 10 min 0 0 0 0
108) Saponina y 5 min 27990 27930 27960 ± 4,24 0,00015
cáscara 10 min 16340 16450 16395 ± 7,78 0,00047
Semilla y 5 min 4790 4940 4865 ± 10,61 0,00218
cáscara 10 min 0 0 0 0
Saponina, 5 min 5760 5910 5835 ± 10,61 0,00182
semilla y 10 min
cáscara 680 640 660 ± 2,83 0,00428
Para el procesamiento de datos se realizaron estadísticos descriptivos, ANOVA
con un nivel de significancia del 5 % y pruebas de Tukey.

4.1.2.2. Ensayo control con el desinfectante Kilol L-20

Tabla N° 22. Ensayo control con una relación (1:5) m.o. : Desinfectante

Ufc/mL S. Tipo de Tiempo

AUREUS desinfectante de Ensayo Repetición Promedio ±
Inicial contacto ufc/mL ufc/mL D.E. C.V.

Ufc/mL Kilol L-20 5 min 10910 10950 10930 ± 2,83 0,00026

Alta (15.0 (Puro) 10 min 8240 8290 8265 ± 3,54 0,00043
x 108)
Ufc/mL Kilol L-20 5 min 1410 1460 1435 ± 3,54 0,.00246
Media (Puro) 10 min 490 550 520 ± 4,24 0,00816
(9.0 x 108)
Ufc/mL Kilol L-20 5 min 100 130 115 ± 2,12 0,01844
Baja (6.0 (Puro) 10 min 0 0 0 0
x 108)

70
 Los resultados de la tabla 22 nos indica que el desinfectante Kilol L-20, es
mucho más efectivo que los desinfectantes en estudio, debido a que este cuenta
con excipientes (Vitamina c, etc.), que ayudan a la eficacia de dicho producto.
Pero los resultados reportados para S. aureus de nuestra investigación, siguen una
tendencia similar, por ende, se puede decir que los desinfectantes en estudio son
eficaces.

Tabla N° 23. Análisis de Varianza del porcentaje de inhibición S. aureus

Origen Suma de gl Media cuadrática F Sig.

cuadrados tipo III
Modelo corregido 18594812811,905a 83 224033889,300 86285,404 ,000
Intersección 25280618688,095 1 25280618688,095 9736689,453 ,000
EXTRACCIÓN 5459688085,714 1 5459688085,714 2102768,451 ,000
DESINFECTANTE 6184797286,905 6 1030799547,817 397006,703 ,000
TIEMPO 1794968688,095 1 1794968688,095 691322,191 ,000
CARGA 2683034233,333 2 1341517116,667 516677,844 ,000
EXTRACCIÓN * 441510105,952 6 73585017,659 28340,860 ,000
DESINFECTANTE
EXTRACCIÓN * TIEMPO 314114752,381 1 314114752,381 120979,547 ,000
EXTRACCIÓN * CARGA 256696328,571 2 128348164,286 49432,580 ,000
DESINFECTANTE * TIEMPO 158117486,905 6 26352914,484 10149,678 ,000
DESINFECTANTE * CARGA 388298241,667 12 32358186,806 12462,575 ,000
TIEMPO * CARGA 85997276,190 2 42998638,095 16560,686 ,000
EXTRACCIÓN * 89834339,286 6 14972389,881 5766,533 ,000
DESINFECTANTE * TIEMPO
EXTRACCIÓN * 444556679,762 12 37046389,980 14268,211 ,000
DESINFECTANTE * CARGA
EXTRACCIÓN * TIEMPO * 5097633,333 2 2548816,667 981,663 ,000
CARGA
DESINFECTANTE * TIEMPO * 112533748,810 12 9377812,401 3611,812 ,000
CARGA
EXTRACCIÓN *
DESINFECTANTE * TIEMPO * 175567925,000 12 14630660,417 5634,917 ,000
CARGA
Error 218100,000 84 2596,429
Total 43875649600,000 168
Total corregida 18595030911,905 167
a. R cuadrado = 0,99997 (R cuadrado corregida = 0,99996)
b. Coeficiente de variación = 0,001367 = 0,14%

71
 Los resultados de la tabla 23 nos demuestran que hay diferencias significativas
con un valor de p<0,05, para todas las variables independientes. Lo cual nos
indicó que estas variables influyen en la eficacia del desinfectante.

Como encontramos diferencias significativas en el análisis de varianza se

procedió a realizar la prueba de Tukey que se encuentran en el anexo 05, 06, 07 y
08, los cuales nos muestran que al utilizar la extracción del desinfectante (etanol
al 70 % y éter de petróleo), carga microbiana (baja, media y alta); tipo de
desinfectante (saponina, semilla, cáscara, saponina y semilla, saponina y cascará,
semilla y cáscara, saponina, semilla y cáscara) y tiempo de contacto (5 y 10 min)
si presentaron diferencias significativas.

Por otro lado, el análisis de varianza nos reporta un coeficiente de variación de

0,14 %, lo cual nos indica que la población en estudio es poco dispersa y bastante
homogénea.

Figura N° 23. Método de extracción del desinfectante natural en S. aureus

En la figura N° 23, se observa las medias marginales de los microorganismos

sobrevivientes luego de la acción del desinfectante, y se puede concluir que el
mejor solvente de maceración para los extractos fue obtenido con etanol al 70%.

72
Datos que se confirman en el anexo 05, donde se muestra la prueba de Tukey
confirmando lo mencionado.

Figura N° 24. Carga microbiana de S. aureus sobreviviente

En la figura N° 24, se observa las medias marginales de los microorganismos

sobrevivientes luego de la acción del desinfectante, y se puede concluir que la
mejor carga microbiana utilizada para estos extractos es con una carga microbiana
baja. Datos que se confirman en el anexo 06, donde se muestra la prueba de
Tukey.

Figura N° 25. Desinfectantes utilizados en S. aureus

73
 En la figura N° 25, se observa las medias marginales de los microorganismos
sobrevivientes luego de la acción del desinfectante, y se puede concluir que el
mejor desinfectante utilizado para esta investigación se logra con el desinfectante
a base de semilla de naranja. Datos que se confirman en el anexo 07, donde se
muestra la prueba de Tukey.

Figura N° 26. Tiempo de acción del desinfectante en S. aureus

En la figura N° 26, se observa las medias marginales de los microorganismos

sobrevivientes luego de la acción del desinfectante, y se puede concluir que el mejor
tiempo de acción del desinfectante en S. aureus se logra con 10 minutos. Datos que
se confirman en el anexo 08, donde se muestra la prueba de Tukey.

Gilbert (2003) menciona que Las bacterias Gram negativas por lo general son más
resistentes a los antisépticos y desinfectantes que las Gram positivas. Se han hecho
estudios donde se midieron las concentraciones mínimas inhibitorias (CIM) que
presentan tanto las gran positivas como las gran negativa, y se estableció que hay
diferencias marcadas entre Staphylococcus aureus y Escherichia coli a los
compuestos de amonio cuaternario (CAC) y hexaclorofeno. En nuestros datos esto

74
no cumple debido a las diferentes concentraciones usadas al momento de la siembra
(1:5, 1:7) respectivamente, concordando así con Gilbert (2003).

Por su parte Sánchez (2006) menciona que en la pared de las bacterias Gram
positivas (como Staphylococus, Streptococus, Bacillus y Lactobacillus), se encuentra
inmediatamente accesible y constituye un blanco ideal. Esto no ocurre en bacterias
Gram negativas (Enterobacterias, Pseudomonas, Shigella, Serratia etc.), donde la
pared celular es mucho mayor y se encuentra entre dos membranas las que impiden
su acceso al blanco.

Hernández y Rengel (2002) realizaron estudios sobre la actividad antibacteriana

de dos desinfectantes, una sal de amonio cuaternario y del hipoclorito de sodio en
función de la temperatura y el tiempo de contacto, de los cuales también obtuvieron
los mismos resultados acerca de la sensibilidad del Staphylococcus aureus llegando a
la conclusión que Staphylococcus aureus es más sensible a los desinfectantes. La
eficacia de un desinfectante depende del tipo de microorganismo que se pretenda
combatir, el tipo de desinfectante, el tiempo de contacto con las superficies, la
temperatura de trabajo, etc. También se puede apreciar de manera más clara la
existencia de una correlación inversamente proporcional entre la proporción
(desinfectante y microorganismo) y el tiempo de contacto del desinfectante con
respecto a la disminución de la carga microbiana.

En todos los ensayos realizados tanto para Escherichia coli y para Staphylococcus
aureus a los diferentes tipos de desinfectantes y tiempos de estudio, se pudo observar
que el desinfectante fue más eficiente a medida que aumenta el tiempo de contacto.
Esto demuestra que el daño está influenciado por el tiempo y tipo de desinfectante. Si
empleamos uno de estos factores inadecuadamente no existirá garantía de la acción
contra el microorganismo corriendo el riesgo de generar resistencias y alterar el
mecanismo de acción sobre estos microorganismos que tal como menciona Canibe,
et al., ( 2001), se basa en la reducción del pH; al disminuir el pH interno de la célula
microbiana, se genera una interrupción del transporte de sustrato por alteración de la
membrana celular, se inhibe la acción de importantes enzimas bacterianas al tiempo
que la célula pierde energía procurando eliminar el exceso de protones desde su
interior agotando el microorganismo e impidiéndole multiplicarse.

75
 La carga microbiana es un factor importante a tener en cuenta ya que, a una carga
microbiana alta, el desinfectante no será eficiente, por el contrario esto ocasionará
que las bacterias generen resistencia hacia el desinfectante, de la misma forma si se
utiliza un desinfectante menos eficiente y se aplica sobre una carga microbiana baja,
el residuo que queda también generará resistencia ya que las bacterias se van
adaptando a ese medio. Según McDonnell y Russell (1999). Los desinfectantes a
tiempos insuficientes provocan cambios en las estructuras celulares que conllevan
respuestas de tipo adaptativo. Por su parte Jácome, (2003). Menciona que el sobreuso
de desinfectantes acelera y fortalecen el desarrollo de esa resistencia a estos. Una
pequeña cantidad de desinfectante incentiva el crecimiento del organismo mutado.

Hernández, (2006). Menciona que para un biocida es fácil ser efectivo y destruir
un número reducido de microorganismos. Sin embargo, cuando el número de
microorganismos se incrementa también aumentan las dificultades para eliminarlos.
Cuanto mayor es la carga microbiana, mayor es el tiempo que un desinfectante
necesita para actuar. Por ello, es fundamental realizar una escrupulosa limpieza de
las superficies de los instrumentos, más aún, cuando estos tienen componentes
múltiples y deben ser desarmados y limpiados pieza por pieza.

Tener en cuenta el tipo de microorganismos a eliminar también es muy

importante, según Hernández, (2006). Los diferentes tipos de microorganismos
difieren en sus respuestas a las sustancias biocidas, debido en parte a la presencia de
estructuras de barrera como membrana y pared celular, que pueden actuar
interfiriendo en la penetración de fluidos y solutos. En la investigación se observó
que Escherichia Coli fue más sensible al desinfectante que Staphylococcus aureus
debido a la concentración usada en dicha investigación.

76
 V. CONCLUSIONES

1. El rendimiento de los extractos etanólicos elaborados a partir de saponina,

cáscaras y semillas de naranja son, 5,40, 4,37 y 7,17%, respectivamente.

2. El rendimiento de los extractos etéreos elaborados a partir de saponina,

cáscaras y semillas de naranja son, 2,213, 1,032 y 3,505%, respectivamente.

3. Para Escherichia coli el mejor efecto antimicrobiano, se logró con una

maceración del extracto con etanol al 70 %, con una carga microbiana baja
(6x108 Ufc/mL), con el extracto de semilla y cáscara de naranja, con un tiempo
de contacto de 10 minutos.

4. Para Staphylococcus aureus el mejor efecto antimicrobiano se logró con una

maceración del extracto con etanol al 70 %, con una carga microbiana baja
(6x108 Ufc/mL), con el extracto de semilla, con un tiempo de contacto de 10
minutos.

77
5. Los ensayos demostraron que Escherichia coli, es más sensible que
Staphylococcus aureus a cualquiera de los tiempos y tipo de desinfectante,
debido a la relación distinta de microorganismo y desinfectante (1:7, 1:5),
usados para los microorganismos en mención.

6. Las pruebas químicas preliminares permitieron identificar en las cáscaras y

semillas de naranja terpenos, esteroides, triterpenos, glicósidos, cumarinas,
flavonoides, fenoles, glicósidos de flavonoides y carbohidratos, además los
residuos de quinua presentaron glucósidos de flavonoides y carbohidratos.

7. El tipo de solvente de maceración, la carga microbiana, el tipo de

desinfectante aplicado y el tiempo de contacto microorganismo - desinfectante,
son factores significativos en el proceso de desinfección.

8. Para inhibir Escherichia coli y Staphylococcus aureus el desinfectante

biodegradable a base de residuos de naranja y quinua siguen una relación directa
con el tiempo.

78
 VI. RECOMENDACIONES

1. Utilizar frutos inmaduros de los cítricos trabajados con el fin de obtener otros
tipos de metabolitos secundarios y una mayor cantidad de estos.

2. Emplear metodologías más específicas (como cromatografía en capa fina y de

gases) para identificar los metabolitos encontrados en los extractos de cáscaras y
semillas.

3. Se recomienda incluir en pruebas futuras a microorganismos que estén

implicados en enfermedades transmitidas por alimentos.

4. Incluir en estudios posteriores el comportamiento del desinfectante a

diferentes concentraciones, pH y temperaturas.

5. Se debe realizar estudios sobre la eficacia del desinfectante biodegradable a

base de residuos de naranja y quinua en productos de IV gama.

6. Realizar estudios de comparación de la eficacia de los desinfectantes más

usados frente al desinfectante a base de residuos de naranja y quinua.

7. Se debe continuar con la segunda fase de este estudio, donde se deben aislar e
identificar los microorganismos que puedan encontrarse en las áreas de
producción de una planta de alimentos y probar sobre estos las diluciones del
desinfectante.

79
 VII. BIBLIOGRAFÍA

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89
 VIII. ANEXOS

8.1. ANEXO 01:

Tabla N°1. Efecto del tipo de solvente sobre la maceración del

desinfectante (E. Coli)

MICROORG.INICIAL N Subconjunto
1 2
168 5676,071
ETANOL AL 70%
168 12975,119
ETER DE PETROLEO
Sig. 1,000 1,000

8.2. ANEXO 02:

Tabla N°2. Prueba de Tukey referente a la carga microbiana (E. Coli)

MICROORG.INICIAL N Subconjunto
1 2 3
CARGA MICROBIANA 56 6100,36
BAJA
CARGA MICROBIANA 56 8733,04
MEDIA
CARGA MICROBIANA 56 13143,39
ALTA
Sig. 1,000 1,000 1,000
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
Basadas en las medias observadas.
El término de error es la media cuadrática (Error) = 4565.476.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 56.000
b. Alfa = .05.

90
8.3. ANEXO 03:

Tabla N°3. Prueba de Tukey referente al tipo de desinfectante usado, (E.

Coli).

DESINFECTANTE N Subconjunto

1 2 3 4 5 6 7

semilla y cáscara 24 5576,25

saponina, semilla 24 6216,67
y cáscara
saponina y semilla 24 6360,83
Semilla 24 7113,75
saponina y 24 10858,75
cáscara
Cáscara 24 14196,25
saponina 24 14956,67
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.

Basadas en las medias observadas.
El término de error es la media cuadrática (Error) = 4565.476.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 24.000
b. Alfa = .05.

8.4. ANEXO 04:

Tabla N°4. Tiempo de contacto usado para el desinfectante (E. Coli).

MICROORG.INICIAL N Subconjunto
1 2
56 7081,429
10 MINUTOS
56 11569,762
5 MINUTOS
Sig. 1,000 1,000

91
8.5. ANEXO 05:

Tabla N°5. Efecto del tipo de solvente sobre la maceración del

desinfectante (S. Aureus).

MICROORG.INICIAL N Subconjunto
1 2
168 6566,310
ETANOL AL 70%
168 17967,738
ETER DE PETROLEO
Sig. 1,000 1,000

8.6. ANEXO 06:

Tabla N° 6. Prueba de Tukey referente a la carga microbiana (S.

Aureus).

MICROORG.INICIAL N Subconjunto
1 2 3
CARGA MICROBIANA 56 6841,07
BAJA
CARGA MICROBIANA 56 13610,71
MEDIA
CARGA MICROBIANA 56 16349,29
ALTA
Sig. 1,000 1,000 1,000
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
Basadas en las medias observadas.
El término de error es la media cuadrática (Error) = 2596.429.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 56.000
b. Alfa = .05.

92
 8.7. ANEXO 07:

Tabla N°7. Prueba de Tukey referente al tipo de desinfectante usado (S.

Aureus).

DESINFECTANTE N Subconjunto

1 2 3 4 5 6 7

Semilla 24 5332,08
semilla y cáscara 24 5489,17
saponina, semilla y 24 7420,83
cáscara
saponina y semilla 24 11526,67
Saponina 24 15785,83
Cáscara 24 18987,08
saponina y cáscara 24 21327,50
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.

Basadas en las medias observadas.
El término de error es la media cuadrática (Error) = 2596.429.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 24.000
b. Alfa = .05.

8.8. ANEXO 08:

Tabla N°8. Tiempo de contacto usado para el desinfectante (S. Aureus).

MICROORG.INICIAL N Subconjunto
1 2
56 8998,333
10 MINUTOS

56 15535,714
5 MINUTOS

Sig. 1,000 1,000

93
 8.9. ANEXO 9

FICHA TÉCNICA DEL DESINFECTANTE BIODEGRADABLE A

BASE DE CÍTRICOS KILOL L-20

COMPOSICIÓN

Cada 100 mL contiene:

DF-100 (Vitamina C 18%, extracto de semilla de toronja 38%)………………….20 mL
Excipientes
c.s.p……………………………………………………………………………….100 mL

INDICACIONES

KILOL L-20 es un producto orgánico natural, cuyo componente activo es un extracto de

semilla y pulpa de toronja. Es biodegradable, no se acumula en los tejidos ni deja
residuos. No confiere olor, color ni sabor a los alimentos. Se utiliza en la desinfección
de productos y equipos de la industria alimentaria. Actúa eficazmente en el control de
Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Staphylococus aureus, Bordetella
bronchiseptica, Micrococcus luteus, Pseudomonas aureginosa, Staphylococcus
epidermis, entre otros microorganismos causantes de enfermedades.

MECANISMO DE ACCIÓN

La acción microbiana de KILOL L-20 se fundamenta principalmente en los siguientes

modos de acción:

 Alteración de la membrana celular con inhibición de las actividades enzimáticas

asociadas a la membrana.

94
  Acidificando el medio donde es aplicado.

PROPIEDADES

 Es una sustancia inocua, de composición química conocida y que incorporado en

los alimentos en bajas dosis protege las características organolépticas y de
conservación, a través de una acción bacteriostática y bactericida sobre los
microorganismos contaminantes.
 Posee acción antioxidante a través de su principal componente, el ácido
ascórbico, contribuye a mantener la calidad nutritiva del alimento, previniendo
la destrucción de vitaminas y proteínas y la oxidación de lípidos.
 No es toxico.
 Contribuye a mantener los caracteres organolépticos, la conservación y/o la
estabilidad del alimento.
 Es biodegradable no deja residuos tóxicos en los alimentos y no se acumula en
los tejidos humanos ni de animales.
 Es estable a 130º C.
 El producto por ser NATURAL puede variar de color hacia un oscuro más
pronunciado, esto se debe a la presencia de flavonoides, sin que esto altere su
eficacia.

95
PRECAUCIONES

 La acción microbicida y antioxidante del KILOL L-20 se inhibe notoriamente

frente a substratos con procesos iniciados de oxidación o con altos recuentos
microbiológicos. Por lo tanto, SOLO puede ser usado en productos en buen
estado de conservación, con el propósito de mantener y proteger esta condición.
 Al manipular evitar el contacto con los ojos y la piel. Puede producir irritación
en los ojos y las membranas mucosas cuando se utiliza directamente. En caso de
contacto lavar con abundante agua. En caso de ingestión, consumir abundante
agua. Siempre es recomendable en caso de accidentes recurrir a la ayuda médica
profesional.
 En caso de derrame, humedecer y recoger limpiando con un paño húmedo.
 Manténgase fuera del alcance de los niños.

ALMACENAMIENTO

Mantener en un lugar fresco y seco, a resguardo de temperaturas extremas y protegido

de la luz solar directa.

PRESENTACION

KILOL L-20 se comercializa en envases de plástico por 1 L, 4 L y galoneras por 20 L

Producido por: QUIMTIA S.A.

Distribuido por: QUIMTIA S.A.

96
TOXICIDAD

 DL-50 oral, ratón: > 2000 mg/Kg.

 DL-50 dérmica aguda, conejo: > 4000 mg/Kg.
 DL-50 inhalatoria, aguda, conejo: > 5,0 mg/L.
 Irritación dérmica, conejo: leve
 Irritación ocular, conejo: no es irritante ocular.
 Sensibilización cutánea, cobayos: no produce reacciones de hipersensibilidad
cutánea.

ADMINISTRACION Y DOSIS

Debido a que cada tratamiento reunirá condiciones particulares se recomienda trabajar

siguiendo buenas Prácticas de Manufactura (BPM) y hacer evaluaciones
microbiológicas pertinentes.
En general la eficacia del producto se debe de llevar a una investigación y determinar la
concentración exacta, dependiendo del organismo presente y condiciones del sistema a
tratar.
Es muy importante que en cada aplicación en específico, se realicen pruebas bajo las
condiciones muy particulares de cada empresa. En caso de requerir una sugerencia de
dosificación, por favor de comunicarse con el distribuidor o fabricante y con gusto será
atendido.

97
8.10. ANEXO 10:

a) MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN EL TRABAJO DE

INVESTIGACION

a.1.) AGAR BAIRD PARKER

El medio que es suplementado con telurito y yema de huevo es un

medio selectivo para la detección y enumeración se Staphylococcus
aureus cuagulasa positiva en contaminación de alimentos. El medio
contiene piruvato y glicina que incrementa el desarrollo de
Staphylococcus.

El telurito y la yema de huevo son los responsables de la

diferenciación de Staphylococcus aureus coagulasa positiva mediante la
aparición de colonias de un halo transparente producido por lipólisis y
proteolisis.

Composición (g/l):

 Triptona 10,0

 Piruvato de sodio 10,0

 Glicina 12,0

 Extracto de levadura 5,0

 Cloruro de litio 5,0

 Agar-agar 17,0

Preparación:

Suspender 58 g del medio en un litro de agua destilada. Calentar

agitando frecuentemente hasta disolver completamente. Esterilizar en
autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar entre 45 ºC y 50 ºC y
agregar 10 mL de emulsión yema de huevo telurito. Mezclar completa y
suavemente, colocar 20 mL de medio por cada placa y dejar solidificar.

98
a.2.) AGAR CHROMOCULT

Este medio se emplea para la detección simultánea de coliformes

totales y E. coli en agua y alimentos.

Composición (g/l)

 Peptona 3

 Cloruro sódico 5

 Dihidrógenofosfato potásico 1,7

 Hidrógenofosfato dipotásico 3

 Piruvato sódico 1

 Triptófano 1

 Laurilsulfato sódico 0,1

 Agar-agar 12

 Mezcla de cromógenos 0,2

Preparación

Disolver 26.5 g del medio en un litro de agua destilada. Calentar

agitando frecuentemente hasta disolver completamente. No introducir
en autoclave. Enfriar entre 45 ºC y 50 ºC colocar 20 mL de medio por
cada placa y dejar solidificar.

99
8.11. ANEXO 11:

Tabla N° 9. Preparación de la escala de Mac-Farland.

Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados.

Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen
{1 % de Cl2Ba + cantidades crecientes de SO4H2 al 1 %; por lo tanto, en
cada tubo se origina un precipitado de SO4Ba, origen de la turbidez. Para
cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez
de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias que genera una
turbidez similar.

8.12. ANEXO 12: PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA E. coli Y S. aureus

A) INDOL

Fundamento:

El triptófano es un aminoácido que puede sufrir desaminación e

hidrólisis por bacterias que expresan la enzima triptófanasa. El indol es
generado por la desaminación reductora del triptófano a través de la
molécula intermedia ácido indolpirúvico. La triptofanasa cataliza la
reacción de desaminación, durante la cual se separa el grupo amina (-
NH2) de la molécula de triptófano. Los productos finales de la reacción
son indol, ácido pirúvico, amonio (NH4 +) y energía. El fosfato de
piridoxal es necesario como coenzima, (Sagar, 2015).

100
 Fig. 1.- Reacción de prueba de Indol

Cuando el indol se combina con el reactivo de Kovac (que contiene

ácido clorhídrico y p-dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico), la
solución pasa del amarillo al rojo cereza. Debido a que el alcohol
amílico no es soluble en agua, la coloración roja se formará en una capa
oleosa en la parte superior del caldo, (Sagar, 2015).

Procedimiento:

 Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a

35°C durante 18 a 24 horas.

 Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por

la pared interior del tubo.

 El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del

reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la
presencia de indol y una prueba positiva.

Resultados

(+) Escherichia coli

B) ROJO METILO

Fundamento:

La prueba del rojo de metilo (MR) determina si el microbio realiza la

fermentación de los ácidos mezclados cuando se suministra la glucosa.
Tipos y proporción de productos de fermentación producidos por
fermentación anaeróbica de glucosa es una de las características

101
taxonómicas clave que ayudan a diferenciar varios géneros de bacterias
entéricas, (Tankeshwar, 2015).

La fermentación ácida mixta es uno de los dos patrones generales,

siendo la fermentación 2-3-butanodiol otra. En la fermentación ácida
mixta, se forman tres ácidos (acético, láctico y succínico) en cantidades
significativas. La vía de ácido mixto da 4 mol de productos ácidos
(principalmente ácido láctico y acético), 1 mol de producto de
fermentación neutra (etanol), 1 mol de CO2 y 1 mol de H2 por mol de
glucosa fermentada, (Tankeshwar, 2015).

Fig. 2.- Reacción de prueba de rojo de metilo

Procedimiento

 Inocular el caldo rojo metilo con un cultivo puro de no más de 24

horas del microorganismo en estudio e incubar a 37°C durante 48
horas.

 Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del

reactivo de rojo de metilo.

 La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto

indica que la producción de ácido es suficiente para producir el
viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la
vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y
el amarillo no es considerado como positivo.

102
 Resultados

(+) Escherichia coli

C) PRUEBA DE LA CATALASA

Fundamento:

Esta prueba demuestra la presencia de catalasa, una enzima que cataliza

la liberación de oxígeno del peróxido de hidrógeno (H2O2). Se utiliza para
diferenciar las bacterias que producen una enzima catalasa, tal como
estafilococos, de bacterias productoras de no catalasa tales como
estreptococos. Normalmente el 3% de H2O2 se utiliza para realizar esta
prueba, (Sagar, 2015).

La enzima catalasa media la degradación del peróxido de hidrógeno en

oxígeno y agua. La presencia de la enzima en un aislado bacteriano es
evidente cuando se introduce un pequeño inóculo en peróxido de
hidrógeno y se produce la rápida elaboración de burbujas de oxígeno. La
falta de catalasa es evidente por la falta o la debilidad de la producción de
burbujas, (Sagar, 2015).

Fig. 3.- Principio de prueba de catalasa

Procedimiento

 Agregamos aproximadamente 5 mL. de peróxido de hidrógeno al 3

% a un tubo de ensayo previamente esterilizado.

 Tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y

la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe
acercarse a la muestra de la solución liquida de peróxido de
hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.

 La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de

oxígeno

103
 Resultados

(+) Staphylococcus aureus

D) PRUEBA DE LA COAGULASA

Fundamento:

Algunas bacterias producen coagulasa, que es una enzima que convierte

el fibrinógeno en fibrina, lo que significa que puede coagular el plasma. Se
supone que la capacidad de producir coagulasa está asociada con la
virulencia de los estafilococos. La prueba se utiliza para distinguir entre
coagulasa positiva y estafilococos coagulasa negativos, (Tankeshwar,
2015).

Procedimiento

 Preparamos una mezcla de 0,1 mL. de CCC (caldo cerebro corazón) y

0,3 mL. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente
esterilizado.

 Tapamos el tubo de ensayo que contiene también las cepas de

Staphylococcus aureus con algodón y lo llevamos a baño María a 37
°C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al
completar la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

 Se consideran positivos cuando hay gran coagulo organizado o todo el

contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.

Resultados

(+) Staphylococcus aureus

104
 8.13. ANEXO 13: Equipos utilizados en el trabajo de investigación

Figura 1. Autoclave Figura 2. Estufa para esterilizar

Figura 3. Incubadora de bacterias Figura 4. Destilador

Figura 5. Agitador tipo Vortex Figura 6. Contador de colonias

105
Figura 7. Balanza analítica Figura 8. Mechero Bunsen

Figura 9. Centrifuga Figura 10. Rotaevaporador

106
8.14. ANEXO 14: Galería de fotos de la realización del trabajo
experimental

A. ACONDICIONAMIENTO DE LOS MATERIALES

Figuras 11 y 12. Preparación de las placas petri para esterilizar

Figura13. Estufa para esterilizar Figura 14. Limpieza de los tubos de ensayo

107
B. PREPARACIÓN DEL
MEDIO DE CULTIVO

Figura. 15 y 16. Pesado del medio de cultivo

Figura. 17 y 18. Dilución del medio de cultivo

Figura. 19 y 20. Esterilización del medio de cultivo

108
 Figura. 20 y 21. Adición de la emulsión yema de huevo telurito

Figura 22. Adición del medio de cultivo Figura 23. Placas con medio de cultivo

C. PREPARACIÓN DEL INÓCULO

Figura 24. Cultivo axénico Figura 25. Esterilización del asa de kolle

109
Figuras 26 y 27. Retiro de las cepas de microorganismos del cultivo axénico

Figura 28. Agitación con vortex Figura 29. Comparación del tubo
Nº3 Mc Farland

D. EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DEL DESINFECTANTE

BIODEGRADABLE A BASE DE RESIDUOS DE NARANJA Y
QUINUA

Figura 30. Incorporación del inóculo Figura 31. Agitación con vortex

110
Figura. 32 y 33. Repique de la muestra para sembrar en la placa

Figura. 34 y 35. Sembrado en las placas petri

Figura 36. Incubación de las placas

111
Figura 37. Contador las ufc

Figura 38. Ufc de E. coli

112