biotecnologia

miércoles, 1 de octubre de 2014

Protocolo para la obtención de penicilina a partir de la

cepa de hongo Penicillum chrysogenum.
Protocolo para la obtención de penicilina a partir de
cepa de hongo Penicillum chrysogenum.

objetivo: Obtención de penicilina a partir de cepas superproductoras de Penicillum chrysogenum.

objetivos específicos: Identificación y aislamiento de la cepa de hongo Penicillum chrysogenum
*Emplear procesos de balance de materia y energía para la buena producción y obtención del
producto buscado.
*Función del producto (penicilina) como anti-microbiano/ antibiótico.

Justificación:
¿Qué es un antibiótico?
Los antibióticos se desarrollan para controlar diversas enfermedades infecciosas, especialmente
aquellas causadas por bacterias por lo que también son denominados "antimicrobianos", estos se
caracterizan por actuar sobre dichos microorganismos (células procariontes), a las que con estos
se pretende eliminar en su totalidad.
La investigación en el campo de los antibióticos ha tenido 2 grandes vertientes, por un lado la
modificación de las moléculas a partir de los antibióticos originales, y la otra la síntesis de las
moléculas nuevas capaces de actuar en cepas de bacterias originalmente no susceptibles a
antibióticos o con mayor potencia.
Por lo tanto la actividad de un antibiótico se define por su espectro antibacteriano, es decir, los
distintos grupos bacterianos sobre las que actúa su poder bactericida.
La penicilina por lo tanto el primer antibiótico que se descubrió y se demostró ser eficaz para
combatir infecciones anteriormente mortales. El descubridor de dicho antibiótico fue Alexander
Fleming un microbiologo escoces en el año de 1928 y dicho desencadeno una revolución sanitaria
sin precedentes en los anales de las ciencias medicas.
Con el paso del tiempo los antibióticos se estado innovando constantemente, en estos últimos años
se han estado creando moléculas derivadas de varios antibióticos ya existentes, para mejorar su
efectividad, selectividad y a la vez se desarrollan medicamentos nuevos, al igual que sus vías de
administración y el perfil de tolerabilidad de los antibióticos ya disponibles.

Clasificación de los antibioticos:

Los antibióticos se clasifican según el nivel estructural y la forma en la que actúan .

Según el nivel estructural donde actúan estos se dividen en :
* Inhibidores de la síntesis de la pared celular, efecto producido por penicilinas, cefalosporinas,
carbapenems y monobactams.
* Inhibidores de la membrana celular, como es el caso de la acción de la polimixina.
* Inhibidores de la síntesis proteica, como es el caso de aminoglucósidos, tetraciclinas,
cloramfenicol, macrólidos. Actuando en el ADN o ARN como quinolonas, rifamicinas.
*Inhibidores competitivos de metabolitos o factores de crecimiento: sulfamidas.

Según su mecanismo de acción:

* Bactericidas: provocan la muerte bacteriana, con lo que el proceso no es reversible.
*Bacteriostáticos: bloquean el desarrollo y multiplicación de las bacterias, pero no las eliminan,
por lo que al retirar el antibiótico su efecto es reversible (las bacte- rias podrían reproducirse de
nuevo).
Antibioticos de ultima generación:
En los ultimos años se han desarrollado una nueva generación de antibióticos, que han mejorado
el perfil farmacocinetico y farmacodinamico respecto a los antibióticos clásicos.
Con las nuevas técnicas de secuenciación genómica (técnicas para estudiar el ADN) se han
conseguido identificar diversos puntos diana del ADN bacteriano, donde estos nuevos fármacos
pueden actuar. También se han establecido tratamientos combina- dos de dos o más antibióticos
que aumentan la capacidad bactericida del tratamiento.

Marco teórico:
1.-Mecanismo de acción:
La penicilina bloquea la última etapa en la síntesis de la pared celular, el
entrecruzamiento de las distintas cadenas del peptidoglicano. La penicilina inhibe las enzimas
transpeptidasa y carboxipeptidasa, responsables de dicho entrecruzamiento, llegando al centro
activo de éstas porque se confunde con el sustrato normal de las enzimas, el compuesto acil-D-
alanina-D-alanina, mimetizándolo en la reacción de entrecruzamiento.

1.2 clasificación y estructura química de la penicilina:

Los antibióticos β-lactámicos se incluyen dentro de los antibióticos de tipo peptídico. Se
pueden clasificar según su estructura química en cinco grupos: (Penicilinas), (cefalosporinas,
cefamicinas, cefabacinas, citinovorinas), (acido clavulanico), (tienamicinas, acidos olivanicos,
epitienamicinas), (nocardicinas, monobactamas).
En el caso de las penicilinas, el núcleo central es el 6-APA, formado por el anillo β-
lactámico asociado a un segundo anillo tiazolidínico.

Existen diferentes tipos de antibióticos naturales como son: Penicilina G, F, K, X, N,

Dihidropenicilina F, Isopenicilina N.
Las penicilinas con una cadena lateral hidrofóbica son exclusivamente sintetizadas por
hongos filamentosos, como es el caso de especies del género Penicillium (P. chrysogenum, P.
nalgiov ense y P. griseofulvum ).
Sin embargo, la producción de antibióticos β-lactámicos de tipo hidrofílico tiene lugar en
hongos filamentosos, como Acremonium chrysogenum , y en muchos Actinomicetos, como
especies del género Streptomyces sp. , además de algunas especies bacterianas Gram
negativas.

Algunas de las penicilinas son producidas de forma natural por los microorganismos que
las sintetizan. A partir de las producidas naturalmente pueden sintetizarse químicamente otras
penicilinas de mayor interés farmacéutico que se denominan penicilinas semisintéticas.

1.3 Hongos productores de penicilina.

Taxonomía y características generales:
Aunque la penicilina es producida por diversas especies del género Penicillium y
Aspergillus , la producción industrial de penicilina está basada en el hongo P. chrysogenum .

Los hongos productores de antibióticos β-lactámicos, como es el caso del hongo P.

chrysogenum pertenecen al phylum Ascomycota, en el cual se agrupan
al 75 % de todos los hongos descritos, y dentro de éste al subfilo Pezizomycotina . Estos se
caracterizan porque las células que lo forman se encuentran dispuestas en filamentos largos
tubulares, divididos en segmentos celulares denominados hifas. Se reproducen de forma
asexual con la formación de esporas asexuales (conidios o mitosporas).

1.3.1 clasificación taxonómica (Penicillum chrysogenum).

Reino : Fungi.
Phylum: Ascomycota.
Subphylum: Pezizomycotina.
Clase: Eurotiomycetes.
Orden: Eurotiales.
Familia: Trichocomaceae.; mitosporic Trichocomaceae.
Género : Penicillium .

1.4 Biosintesis de penicilina.

Las rutas de biosíntesis de penicilinas y cefalosporinas han sido estudiadas en detalle a
nivel molecular y bioquímico, habiéndose conseguido conocer los pasos implicados, los dos primeros
pasos son muy comunes, el paso uno consiste en la formación de tripéptido ACV : δ-(L-α-
aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina. El segundo paso de la vía biosintética es la ciclación oxidativa
del tripéptido ACV para dar lugar al compuesto isopenicilina N ya con una débil actividad
antibiótica.
cisteinil-D-valina.
El paso final de la biosíntesis de penicilinas consiste en la sustitución de la cadena lateral
de L-α-aminoadípico por un ácido orgánico activado mediante coenzima A (CoA), que en el
caso de la bencilpenicilina es el ácido fenilacético. Este último paso es llevado a cabo por la
enzima acil-CoA: isopenicilina N aciltrasferasa (IAT).
En hongos filamentosos y actinomicetos productores de cefalosporinas, la ruta prosigue
con la epimerización de la isopenicilina N a penicilina N.

Materiales y Métodos:
El instrumental para la realicazión de la experimentación: en primera instancia se necesita la
obtención de la cepa de hongo Penicillum chrysogenum la cual para fines didácticos se obtendrá
de un centro de investigación (cinvestav). O por medio de obtención natural en medio
ambiente,(aislamiento de un medio natural), la cual se va a comparar con diferentes
pparámetroscon los cuales se compruebe que la muestra obtenida se trata de Penecillum
chrysogenum,
las diferentes cepas de este hongo se cultivan en placas en medio power y se incuban a 28° C por
4-5 dias para que este logre la esporulación completa.
los medios se realizan en en matraces lisos de 250ml y 500ml con un volumen de medio 50 y 100ml
respectivamente, las condiciones del medio tanto para el inoculo como para la fermentación serán
de 25°C y 250rpm en agitadores orbitales.
Este cultivo inoculo se obtendrá extrayendo esporas de una placa de medio power e inoculandolas
en 100ml de medio inoculo, durante 24-48 hrs en las condiciones antes presentadas, para iniciar la
fermentación añadiendo 10ml de este cultivo por cada 100ml de medio de fermentación.
El cultivo se obtendrá extrayendo las células de 3 placas de medio TSA (añadiendo agua estéril y raspando la
superficie de la placa con una pipeta invertida estéril) e inoculándolas en 100 ml de medio YEME. Tras 48
horas, una vez finalizada la fermentación, a los caldos de cultivo se les aplicó el siguiente tratamiento:

i.- Separación del microorganismo mediante el uso de un filtro de nailon “nytal” de 30 µm de tamaño de poro
y posterior lavado de las células con agua milli Q. Se desechó la fracción precipitada de células.
ii.-Centrifugación del caldo obtenido en el apartado anterior en una centrífuga Sorvall a 4000 rpm durante 30
minutos.
iii.- Recolección del sobrenadante y posterior esterilización mediante filtración (se utilizaron filtros de 0,20 µm
de tamaño de poro).

Las cepas fúngicas se conservaran aprovechando la capacidad de estos organismos de formar estructuras
asexuales de reproducción y resistencia (conidios). Para periodos cortos, máximo un mes, se mantendrán a 4
ºC sembradas en placas. Para su conservación durante un año, se prepararan suspensiones de esporas con una
concentración final de glicerol del 20 % que se guardaron a -20 ºC. Para periodos más largos de tiempo, se
liofilizaran suspensiones de conidios.

Bibliografía:
* http://botit.botany.wisc.edu/toms_fungi/nov2003.html
* http://revistamexicanademicologia.org/wp-content/uploads/2010/08/7.-TR-216-VOL.pdf
*http://www.fba.org.ar/panel-gestion/InformeResultado/MI/mi31.pd

http://patricia950815.blogspot.pe/2014/10/protocolo-para-la-obtencion-de.html