CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

 Concepto de HPLC

La cromatografía líquida de alta resolución se caracteriza por el empleo de una fase estacionaria constituida
por partículas de tamaño muy pequeño, del orden de los m. Esto hace que la eficacia del sistema sea muy
elevada proporcionando columnas con un número muy grande de platos teóricos.

La cromatografía engloba a un conjunto de técnicas de análisis basadas en la separación de componentes

de una mezcla y su posterior detección. Las técnicas cromatografías son muy variadas, pero en todas ellas
hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido, o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra
con un flujo constante de presión proporcionado por una bomba, hasta llegar al punto donde es introducida
la muestra. Siguiendo el flujo de presión la lleva a una columna donde se encuentra la fase estacionaria que
se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido.21 Los componentes de la mezcla interaccionan de
distinta forma con la fase estacionaria y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan la
fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando.

Para vencer la enorme resistencia que ofrece la fase estacionaria al paso de la fase móvil es necesario
emplear un sistema de bombeo a alta presión.

Otra característica importante de la HPLC es la detección continua de los análitos conforme son eluidos

 Componentes de un cromatógrafo de líquidos

Un cromatógrafo de líquidos es un instrumento que responde al siguiente esquema:

 Una serie de componentes esenciales como el depósito de disolvente, la bomba de alta

presión, el sistema de inyección, la columna, el detector y el registrador (o integrador).
  Componentes necesarios si se quiere llevar a cabo una elución en gradiente, como son los
depósitos de los disolventes, el sistema de gradiente, etc.
 Otros componentes que mejoran el funcionamiento, como el supresor de pulsos, el sistema
de control de la Tª de la columna, el sistema de control de caudal, el indicador de presión, etc.

 Modalidades de HPLC
o Cromatografía de líquido - Sólido (ADSORCIÓN): Fenómeno de superficie que
ocurre por la interacción física o química de un adsorbente.
o Cromatografía de líquido – líquido (PARTICIÓN): Es el fenómeno de reparto de un
soluto en 2 fases distintas.
o Cromatografía de INTERCAMBIO IÓNICO: Es un fenómeno generado por la
interacción electroestática entre moléculas encargas eléctricamente.
o Cromatografía de EXCLUSIÓN: Es un fenómeno físico que consiste más que nada en
separar moléculas en base a su tamaño molecular.
o AFINIDAD: Se combina la alta especificidad de ciertas moléculas por un sustrato,
tales como: Enzimas, Receptores, etc.

Existen diferentes modalidades de HPLC, dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria:

Modalidad Fase estacionaria

Adsorción Sólido adsorbente

Partición Líquido inmiscible con la F.M

Fases ligadas Sustancia ligada por enlace covalente a un

soporte sólido

Intercambio iónico Resina cambiadora de iones

Exclusión Sólido de porosidad controlada

Afinidad Ligando afinidad

La modalidad más empleada es la cromatografía con fases ligadas, donde podemos distinguir:

 La cromatografía en fase normal (fase estacionaria más polar que la fase móvil).
 La cromatografía en fase reversa (fase estacionaria menos polar que la fase móvil).

La mayoría de los análisis cromatográficos actuales se llevan a cabo por cromatografía en fase reversa. Esta
modalidad emplea una fase estacionaria apolar, generalmente una cadena hidrocarbonada, C8 o C18, junto
a una fase móvil polar, constituida por una mezcla de agua o tampón con un disolvente orgánico miscible
como MeOH o Acetonitrilo. El poder eluyente de la fase móvil se regula variando la proporción
Agua/Disolvente orgánico. Cuanto mayor sea la proporción de agua menor será el poder eluyente de la fase
móvil, y por tanto, mayores los tiempos de retención.
 DETERMINANCIÓN DE VITAMINA A
Método utilizado por Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento – HPLC.

 Muestras: Leches en polvos

 Preparación de la curva patrón

Para realizar la curva de Se colocó en un matraz de

500 mL y se agregó Luego se calculó el
calibración se pesó 0.1g
metanol grado HPLC, hasta volumen necesario para
de vitamina A de
el aforo para obtener una la preparación de los
concentración
concentración de 200 protones.
1.800.000 UI g‫־‬¹
mg.L‫־‬¹

 Extracción de la vitamina

Se le burbujeo Luego se le adiciono 20ml

Se pesó 20 g de leche en
polvo en un balón de base
plana de 1000 mL.
También se le agrego
unamagneto y se le adiciono
70 mL de etanol absoluto.
nitrógeno por cinco
segundos, se tapó y se
calentó a 40 °C por 40
minutos
de solución de KOH al 50%
y se saponifico la mezcla
por 40 minutos con una
agitación de 200 rpm en una
centrifuga

Luego se agito la solución, y se

Para la fase superior orgánica
se colocó en un balón de 250
mL redonda, que contiene
aproximadamente 0.5 g de
ácido ascórbico.
La extracción se repite dos
veces y se juntaron en otro
balón de 250 mL. En la cual
se evaporo el solvente,
haciendo uso de un
rotavapor con baño de agua
de 40°C.
También se le adiciono 50 ml enfrió a temperatura ambiente Se agregaron tres
de hexano para proceder a la y se filtró al vacío. Luego del porciones de agua de (20
extracción. A la mezcla se le filtrado se coloca en una ml, 20ml y 10ml), con
agito por 20 segundos y se
pera de separación de 250 reposo de 10 minutos
esperó la separación de fases.
ml cubierta con papel de entre cada uno.
aluminio.
De acuerdo a los
El residuo se diluyo cromatogramas obtenidos
La solución se pasó en un
inmediatamente con metanol se fijó la longitud de onda en
filtro de 0.2 um y se
grado HPLC y se llevó a 300 nm y el flujo de la fase
inyecto manualmente al
volumen en un matraz
móvil en 1, 2 mL.mim‫ ־‬¹
cromatógrafo.
volumétrico de 10 mL
RESULTADOS
VALORES PROMEDIOS DEL CONTENIDO DE VITAMINA A

 CONCLUSIONES
o Se demostró que el método utilizado fue sencillo, selectivo, preciso y exacto.
o Se demostró que el contenido de vitamina A de las tres marcas de leches estudiadas
está por debajo del valor establecido por la norma Venezolana.
o Las condiciones del sistema Cromatógrafo que producen señales más intensas y
que proporcionan mejores resultados para la cuantificación de la vitamina A son:
flujo 1,2 mL/mim, donde la longitud de onda de 300nm y fase móvil 100% de
metanol.

Método utilizado por Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento - HPLC
 Muestras: harina de quinua, lupino, levadura de cerveza y albumina de huevo
Preparación de la Muestra
En un tubo falcón (50 mL),
se pesan 2,0 g de muestra
previamente homogenizada.
Se agita en el rotatubos a
1.700 rpm/2 min y se
centrifuga a 4.000 rpm/1
min.
La fase superior se junta con
la recolectada anteriormente
en el tubo falcón
DETERMINANCIÓN DE VITAMINA A, D y E
Se adicionan 4 mL de etanol
más 1 mL de solución de
ácido ascórbico al 10% p/v.
Se adicionan 4 mL de
solución etanol/agua (3 + 1)
directamente a la muestra.
Se adicionan 2 mL de
solución de cloruro de sodio
saturado y 4 mL de hexano,
esto se agita vigorosamente
a 1.700 rpm/1 min.
Para la vitamina D2 y D3
fueron determinadas a
265 nm con tiempos de
retención de 18,64 ± 0,81
min y 20,13 ± 0,91 min.
Se añade lentamente 1 mL
Se agita a 1.700 rpm/1 h
de hidróxido de potasio al
en rotatubos
50% p/v.
Luego se centrifuga a 4000
rpm/1 min, trasvasijando la
fase superior a otro tubo
falcón
Se extrae el hexano y se
trasvasija a un tubo falcón.
Se realizan dos extracciones
más con 4 mL de hexano
cada una, juntando cada
extracción con la anterior.
Si la muestra es de origen
animal, el estándar interno
será vitamina D2 y si la
muestra es de origen vegetal
el estándar interno será
vitamina D3.
Se enfría rápidamente
hasta alcanzar temperatura
ambiente
Se lavan con volúmenes
pequeños de agua
desionizada entre 5 a 15
mL, hasta alcanzar pH
neutro
Después de haber
recuperado la muestra, es
inyectada en el equipo.
El uso del estándar
interno va a depender del
origen de la muestra
analizada.
Se agitando nuevamente
a 1.700 rpm/1min.
La muestra se saponifica a
70ºC/30 min en un baño
termorregulador.
Se verifica utilizando el
indicador fenolftaleína al 1%
p/v. Se centrifuga a 4.000
rpm/1min.
La fase superior se recupera
y se lleva a sequedad bajo
corriente de Nitrógeno. Se
redisuelve con 1 mL de fase
móvil más 1 mL de estándar
interno (vitamina D3) (50
ppm) ó (vitamina D2) (25
ppm)).
Parámetros instrumentales y experimentales para la determinación de vitaminas
liposolubles por HPLC-DAD.

RESULTADOS
Se presenta el contenido de vitaminas liposolubles presente en las materias primas.

Contenido de Vitaminas Liposolubles en las muestras analizadas:

CONCLUSIÓN
 El método desarrollado, permitió determinar de forma simultánea las vitaminas
liposolubles A, D y E demostrando ser rápido y eficiente.
 La validación del método cromatográfico indicó límites de decisión (Ccα) que se
encuentran entre 0,4 μg/g (vitamina A y D2) y 0,8 μg/g (vitamina E), mientras que la
capacidad de detección (Ccβ) fue de 1,8 para vitamina A, 0,6 μg/g para vitamina D2 y
7,0 μg/g para vitamina E. El método obtuvo una precisión de 3,17% para vitamina A,
2,31% para vitamina D2 y 2,76% para vitamina E. En tanto que la exactitud presentó
valores correspondientes a 111,57% para vitamina A, 124,97% para vitamina D2 y
106,34% para vitamina E.
Bibliografía

 López victoria, 2013. Desarrollo y Validación de Metodología para la Determinación Simultánea

de Vitaminas Liposolubles A, D y E en Muestras Biológicas.
 Araujo karelen, 2013. Validación de un método cromatográfico para la determinación de
vitamina A en muestras de leche.
 Badui S, 1999. Química de los Alimentos. 3ª. Ed. Acribia 648 p.
 LAMBERT, W., y DE LEENHEER A. 2000. Modern Chromatographic Analysis of
Vitamins. 3ª Ed. New York. 606 p.