Curso de Certificación de Microbiología (OPS)

Recuento heterotrófico en placas

Donald J. Reasoner, Ph.D.

División de Contaminantes Microbiológicos, WSWRD, NRMRL
Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos
Cincinnati, Ohio 45268

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1. Introducción
A. Historia de la técnica de recuento en placas
a. Medio gelatina nutritiva
b. Medio agar
B. Métodos más recientes
a. Recuento en placa estándar s
b. Recuento heterotrófico en placas
1. Definición de bacterias heterótrofas
2. Medios selectivos versus no selectivos para el crecimiento de bacterias
heterótrofas
II. Usos del recuento heterotrófico en placas
III. Métodos alternativos
A. Método de placa fluida (MPF)
B. Método de placa difusa (MPD)
C. Método de filtración por membrana (PPM)
IV. Consideraciones y beneficios del monitoreo
V. Referencias
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Resumen:
La medición de bacterias heterótrofas en el agua potable puede proporcionar
información útil a los operadores de plantas de agua, ingenieros sanitarios, supervisores
de la calidad del agua y analistas de laboratorios de calidad del agua. Durante el
tratamiento la densidad bacteriana varía y en la red de distribución se puede monitorear el
deterioro de la calidad a través de los métodos de recuento heterotrófico en placas
(RHP). La aplicación constante del método de RHP seleccionado proporcionará datos
básicos para evaluar cambios en la calidad bacteriana del agua potable. A continuación
se presenta un resumen de los métodos disponibles en los Estados Unidos e información
para optimizar el RHP a través de la elección de procedimientos, medios y tiempo y
temperatura de incubación.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Revisado el 7 de agosto de 1998 para el Curso de Certificación de Microbiología (OPS)

USEPA, AWBERC, Cincinnati, Ohio.
1. Introducción

A. Historia de la técnica de recuento en placas

En los Estados Unidos se han usado métodos para detectar y enumerar las
bacterias en el agua desde el inicio de la microbiología sanitaria a principios del siglo XX.
Además de enumerar las bacterias indicadoras (coliformes totales y fecales, Escherichia
coli), se ha usado un procedimiento del recuento de bacterias para calcular la densidad
general de la población bacteriana en el agua.

a. Gelatina nutritiva. El Dr. Robert Koch (1876) usó la gelatina como el primer
agente gelificante para solidificar el medio líquido usado en el cultivo de las bacterias.
También desarrolló el método de estriado, el método de recuento en placas para el
aislamiento de bacterias y el método de sesgado para sembrar cultivos puros. El uso de
la gelatina como agente de solidificación permitió obtener muestras para el cultivo en
placas, directamente o en alícuotas diluidas, en el medio gelificado, lo que facilitó el
crecimiento de colonias individuales y el desarrollo de cultivos puros. La gelatina se podía
obtener fácilmente y a un bajo costo pero presentaba dos desventajas. En primer lugar, se
debe incubar por debajo de 28 °C para mantenerla solidificada; el uso de temperaturas
de incubación inferiores de 28 °C no es adecuado para muchas bacterias. En segundo
lugar, muchas bacterias pueden descomponer la gelatina, lo que hace que se licúe e
impida la reproducción de las colonias. Actualmente, la gelatina nutritiva se usa
principalmente para determinar si una bacteria aislada de un cultivo puro puede producir
gelatinasa y licuar la gelatina como una característica bioquímica.

b. Medio agar. Fue por sugerencia de Frau Hesse, esposa de un antiguo auxiliar
del Dr. Koch, que el agar se introdujo como un agente gelificante para el medio de cultivo.
En el Oriente el agar, derivado de algunas algas marinas, se usó como un agente
gelificante. El agar entra en solución a 100 °C y permanece en estado líquido a una
temperatura aproximada de 40 °C. Por lo tanto, una vez gelificado, permanece en estado
sólido y se puede incubar a diferentes temperaturas para cultivar bacterias. Además,
como el agar es un carbohidrato complejo atacado solo por algunas bacterias, el
problema de la licuefacción no es muy frecuente

Por lo tanto, el uso del agar como agente de solidificación en medios de cultivo
selectivo y no selectivo ha permitido obtener mayor flexibilidad y capacidad para detectar
y enumerar bacterias en todo tipo de muestras, incluidas las muestras clínicas, de
alimentos, agua ambiental y potable, suelos, sedimentos y superficies (cocinas y áreas de
preparación de alimentos, superficies de hospitales, etc.).

B. Métodos más recientes

a. Recuento en placa estándar

En los Estados Unidos, los Standard Methods for the Examination of Water
and Wastewater (1), desde su primera edición en 1905 (con el título Standard Methods
of Water Analysis), han incluido un medio para medir la población general bacteriana en
el agua. En el procedimiento de recuento en placas se emplearon placas de gelatina
nutritiva incubadas a 20 °C. La segunda edición de los métodos estándar (1912) introdujo
el recuento en placas a 37 °C, por 24 h con agar nutritivo, pero también consideró el
recuento en placas a 20 °C por 48 con gelatina nutritiva. La inclusión del recuento en
placas a 20 °C continuó hasta la 12a. edición de los métodos estándar (1965) pero se le
excluyó en las ediciones de la 13a. a la 15a. (1980). En la 16a. edición (1985) se volvió a
introducir el recuento en placas a 20 °C con medio agar y se cambió el nombre de
recuento en placa estándar s (REP) a recuento heterotrófico en placas (RHP).

El procedimiento actual del recuento en placa estándar (RPE) evolucionó de la

metodología anterior que aplicaba una incubación a 37 °C para el “recuento a
temperatura corporal" especificada en los métodos estándar de la 3a. edición (1917),
hasta la 8a. edición (1936), en la 9a. edición (1946) se especificó una incubación por 24±
2 h a 35-37 °C.

b. Recuento heterotrófico en placas

Durante los últimos años, el interés por medir la densidad bacteriana de las
muestras de agua potable ha dado lugar a algunos cambios en el procedimiento
aceptado. Mientras que en el pasado el recuento de bacterias en placas era conocido
como el “recuento total en placas” o el “recuento en placa estándar”, la terminología
cambió en la 16a. edición (1985) de los métodos estándar a “recuento heterotrófico en
placas” (RHP). Al adoptar este nombre, se reconoce que el procedimiento de recuento de
bacterias en placas no puede obtener una medición total del recuento de las bacterias y
que, mientras se requieran condiciones estándares, deberá haber alguna libertad para
elegir las condiciones estandarizadas de modo que la medición se adapte a las
necesidades de información del usuario.

La sección 9215, recuento heterotrófico en placas, 19a. edición de los métodos

estándar (1995), ofrece al usuario varias alternativas para determinar la densidad de
bacterias presentes en el agua. La 16a. edición de los métodos estándar volvió a
establecer la opción de incubación a 20 °C e introdujo la filtración por membrana y los
procedimientos de placas difusas para la enumeración bacteriana. También reconoció el
uso de un medio con bajo contenido de nutrientes para el recuento heterotrófico en
placas, así como cambios en el tiempo de incubación para obtener una enumeración
óptima a 20 °C o 28 °C. Estos cambios en el procedimiento del recuento en placas se
realizaron debido a investigaciones iniciadas a mediados de la década de 1970.

1. Definición de bacterias heterótrofas

Las bacterias heterotróficas (heterótrofas) se definen como aquellas bacterias
que usan compuestos del carbono orgánico como fuente de energía y el carbono para su
crecimiento, en contraposición con las bacterias autotróficas que utilizan los compuestos
inorgánicos como fuente de energía y el C02, como fuente de carbono. Esta definición de
bacteria heterótrofa es amplia e incluye tanto a las bacterias saprofíticas como a las
patógenas. Por lo tanto, tanto las bacterias que causan como las que no causan
enfermedades son heterótrofas.

2. Medios selectivos versus no selectivos para la reproducción de bacterias

heterótrofas
Los medios RHP empleados para enumerar los heterótrofos encontrados en el
agua se consideran medios no selectivos porque no tienen compuestos inhibitorios ni
selectivos para un determinado grupo de bacterias. Algunos compuestos que se usan en
los medios selectivos son las sales biliares, sulfato de laurilo de sodio o desoxicolato de
sodio (usado en medios para la detección de coliformes), azida de sodio (selectiva para
enterococcos), colorantes (verde brillante) y antibióticos. Las condiciones de incubación,
incluida la temperatura, pueden ser selectivas y por consiguiente tales condiciones deben
estar especificadas para las bacterias particulares que se procura detectar o enumerar.

II. Usos del recuento heterotrófico en placas

El recuento heterótrofico en placas (RHP) es un procedimiento sencillo que se

puede realizar por el método de placa fluida, difusa o filtración por membrana (FM) y es
una herramienta muy útil. Aunque no es esencial para evaluar la seguridad del agua
potable, los resultados del RHP proporcionan información que complementa los
resultados de los coliformes totales. El RHP se puede usar para indicar la composición
bacteriana general del agua de la fuente y la eficacia y eficiencia de los procesos de
tratamiento del agua, como la sedimentación, coagulación, filtración y cloración. El
monitoreo del RHP en el agua distribuida puede proporcionar información sobre la
limpieza del sistema de distribución, desarrollo de bacterias después del tratamiento,
efectos de los cambios de temperatura en el agua y del cloro residual en la población
bacteriana.

III. Métodos alternativos

El cuadro I presenta un resumen de los métodos alternativos de RHP incluidos en

la 16a. edición de los métodos estándar. Por primera vez, los métodos estándar ofrecen
al analista tres métodos opcionales y dos medios nuevos para el procedimiento del RHP.
El cuadro 2 muestra la preparación de medios para el RHP.

A. Método 9215 B, método de placa fluida (MPF)

El método de placa fluida para el análisis del RHP de las muestras de agua
presenta algunas desventajas que limitan la recuperación de las bacterias. Como usa
agar licuado a una temperatura de 44 a 46 °C, las bacterias en la muestra de agua están
expuestas a la presión del calor, lo cual puede hacer que los microorganismos no sean
viables. Además, como se emplea un medio rico en nutrientes, es probable que las
bacterias fisiológicamente estresadas o dañadas no se desarrollen debido a alguna
forma de inhibición metabólica. Tanto la presión del calor como el medio de crecimiento
rico producen una recuperación reducida de las bacterias. Otra desventaja es que
mediante este método sólo se puede analizar un máximo de 1,0 ml de muestra.

B. Método 9215 C, método de placa difusa (MPD)

Este método, que es un procedimiento alternativo al RHP, evita la tensión del
calor del agar licuado temperado usado en el método de placa fluida. Las colonias de
bacterias crecen en la superficie del agar en lugar de estar contenidas en el agar, como
sucede en el procedimiento de placa fluida, lo cual favorece la reproducción de bacterias
aerobias que no se podrían desarrollar bien o no se desarrollarían del todo si estuvieran
contenidas en el agar. Por lo general, cuando se aplica un período de incubación no
mayor de 3 días, se produce un mejor desarrollo de la pigmentación en las colonias de
bacterias, independientemente del medio usado. Las placas se pueden preparar
previamente y almacenar hasta por una semana mientras que el escape de agua por
placa no exceda los 2 ó 3 g. El volumen máximo de muestra que se puede examinar es
1,0 ml, pero generalmente es recomendable examinar un volumen de 0,1 ml a 0,5 ml.
Cuando se dispone de medios de crecimiento más ricos, el crecimiento disperso de
colonias de algunos tipos de bacterias puede ser un problema, pero esto no sucede si se
usa el medio R2A (2).

El método de placa difusa no es un procedimiento nuevo. Ha sido utilizado por

muchos años y se ha demostrado que permite recuentos mayores de placas que el
procedimiento de placa fluida. En una comparación de los resultados de 571 muestras de
agua recolectadas de tuberías finales de agua durante la descarga normal, la razón
promedio de los resultados de la placa fluida a 35 °C en relación con la placa difusa fue
de 0,24 (3). Es decir, el resultado del método de la placa difusa fue aproximadamente
cuatro veces mayor que el resultado de la placa fluida.

Además, se observó que el método de la placa difusa era más exacto que el de la
placa fluida. Al examinar la distribución de los recuentos bacterianos de la misma muestra
obtenidos con ambos métodos, se halló que aproximadamente 90% de los recuentos de
la placa fluida estaban en una categoría de < 500/ml en comparación con solo 49% de los
recuentos de la placa difusa (cuadro 3). Además, solo 6,3% de los recuentos de la placa
fluida estaban en > 1.000/ml en comparación con aproximadamente 35% de los recuentos
de la placa difusa. Esto es una prueba más de que el método de la placa fluida es muy
ineficiente y puede subestimar significativamente el número de bacterias en una muestra
de agua tratada. Hay dos efectos que contribuyen a reducir los recuentos obtenidos con el
método de la placa fluida. En primer lugar, el agar licuado temperado causa daños
irreparables a algunas bacterias. En segundo lugar, el crecimiento de bacterias altamente
aerobias se dificulta cuando los organismos están dentro del agar y no en la superficie.

C. Método 9215 D, método de filtración por membrana (MFM). Este método se

introdujo por primera vez para determinar el RHP en la 16a. edición de los métodos
estándar (4,5). La técnica de filtración por membrana es una de las herramientas más
versátiles para un microbiólogo del agua y la mayoría de los analistas conocen el
procedimiento de filtración por membrana para la determinación de coliformes totales. El
uso del método de filtración por membrana para el RHP permite examinar grandes
volúmenes de aguas turbias y es particularmente útil cuando el RHP es bajo, como
generalmente sucede con el efluente clorado de agua clarificada o el efluente de una
unidad de ósmosis inversa. Con el medio m-RHP, el crecimiento difuso de algunos tipos
de bacterias puede ser un problema; este caso es menos frecuente con el medio R2A con
bajo contenido de nutrientes. Como el medio m-RHP no es un medio estéril, puede haber
contaminación y las placas se deben usar un día o dos después de la preparación; las
placas de m-RHP se deben almacenar a la temperatura del refrigerador hasta el momento
de usarlas. El medio R2A se prepara como un medio estéril y no tiene este inconveniente.
Las ventajas del procedimiento de la filtración por membrana es que requiere menos
tiempo y espacio para la incubación y materiales.

El recuento de colonias en los filtros de membrana blancos puede ser un problema

debido al tamaño pequeño de la colonia para algunas bacterias y la falta de contraste
entre las colonias no pigmentadas y la membrana blanca. Este problema se puede
resolver al ajustar la fuente de luz en un ángulo bajo a fin de crear un efecto de sombreado
o al inclinar la placa y volver a enfocar el microscopio. Esta última manipulación requiere
un reajuste continuo del microscopio pero funciona bien para los filtros de membrana con
cuadrículas.

IV. Consideraciones y beneficios del monitoreo

La información obtenida de la prueba bacteriológica del agua se debe interpretar

juntamente con el conocimiento minucioso de las condiciones de la fuente de suministro
durante todo el proceso de tratamiento y en el sistema de distribución. Una única prueba
de laboratorio, aunque sea favorable, no justifica la conclusión de que todo sea
satisfactorio. El valor de las pruebas bacteriológicas depende de la aplicación frecuente y
examen regular de los resultados. El examen frecuente con una prueba bacteriológica
simple como el análisis de RHP, además de la prueba requerida de coliformes totales,
proporcionará una base referencial para la calidad bacteriológica. Es posible determinar
los cambios en la tendencia de la calidad bacteriológica y si el cambio no es bueno, se
deben tomar medidas correctivas. También es importante observar el mejoramiento de la
calidad bacteriológica e identificar los factores responsables de modo que se puedan
mantener las condiciones.

Por lo general, es necesario realizar la prueba de coliformes para saber si ha habido

contaminación, pero el RHP puede proporcionar información importante. Cuando hay un
aumento repentino en el RHP, el analista debe alertar al operador de la planta de
tratamiento e indicar los pasos que se deben seguir para tratar de determinar la causa del
RHP mayor. Si no se observa ningún cambio en la calidad del agua que proviene de la
planta de tratamiento pero el RHP muestra una mayor tendencia en algunos lugares del
sistema de distribución, es probable que haya problemas como bajo cloro residual,
presión baja, retrosifonaje o fugas en las tuberías y reservorios de servicio.

La figura 1. muestra las diferencias características en los resultados del RHP

obtenidos con los medios y alternativas del método de la 16a. edición de los métodos
estándar para examinar muestras de agua potable. Con el recuento en placa en agar
(SMA), independientemente del método empleado, se obtuvieron los peores resultados a
35 °C con todos los medios usados. La incubación a 35 °C, independientemente del
medio/método empleado para el RHP, también produjo los recuentos en placa más bajos.

La figura 2. compara los resultados del RHP después de siete días de incubación
para muestras de aguas de fuente no clorada y de agua potable clorada. Los recuentos
de colonia se obtuvieron mediante los métodos estándares y medio agar R2A con los
procedimientos de la placa difusa, del filtro de membrana y del filtro de membrana m-
RHP. Esta cifra muestra que la incubación a 20 °C produjo los recuentos más altos en
todos los medios para los dos tipos de muestras, también indica que los resultados a 35
°C fueron muy bajos en comparación con los resultados a 20 °C para el agua clorada.
Además, el método usado para el RHP del agua clorada a 35 °C fue más importante que
para el RHP a 20 °C. Estos datos sirven para resaltar el hecho de que la combinación de
métodos/medios de RHP se debe determinar experimentalmente mediante pruebas de
comparación y no se debe suponer que todas las combinaciones de medios/métodos van
a producir resultados equivalentes.

Para usar la información del RHP en la evaluación de la eficacia del tratamiento

general y las condiciones del sistema de distribución, los datos básicos del RHP se
deben recolectar con la misma combinación de medios/métodos desde el principio hasta
el final. A pesar de que el RHP es muy lento, el método del filtro de membrana
proporciona un medio de medir la población bacteriana al usar volúmenes de muestras
mayores de un mililitro. Como se puede observar en el cuadro 1, una subpoblación más
pequeña de bacterias heterótrofas se mide a 35 °C en lugar de a 20 ó 28 °C; de hecho,
en la mayoría de los casos es solo aproximadamente < 10%. Para los datos básicos, es
mejor medir la población más grande posible y esperar una tendencia creciente como
signo de que ha sucedido algo (o está sucediendo) que aumenta la población del RHP. El
aumento o disminución en la tendencia se debe interpretar a partir de los cambios
estacionales en la calidad del agua, temperatura y otros factores. Una vez que haya
recolectado los datos básicos adecuados, el operador podrá identificar fácilmente los
factores estacionales que afectan la calidad bacteriológica de su producto. Al conocer los
cambios que se producen estacionalmente, o asociados con lluvias fuertes, el operador
de la planta podrá predecir o prever cuándo aumentará el RHP a fin de alterar el
tratamiento de modo que pueda minimizar el cambio bacteriológico.

Además de los cambios estacionales, se pueden relacionar recuentos mayores del

RHP con la duración de la carrera de los filtros en las plantas que aplican la filtración
rápida de arena. En la práctica, la necesidad de limpiar un lecho de filtro rápido de arena
se basa en la pérdida de carga y el retraso para obtener los resultados bacteriológicos
dificultarían, a corto plazo, el manejo de la operación del filtro rápido de arena. Sin
embargo, a largo plazo, el conocimiento sobre los cambios en el RHP relacionado con la
operación de la filtración rápida de arena ayudaría al operador o ingeniero de la planta a
entender e interpretar los datos bacteriológicos. En el caso del tratamiento con filtración
de carbono activado granular (CAG), el monitoreo del RHP en el efluente del lecho del
filtro CAG puede ser muy beneficioso. Los filtros de CAG desarrollan poblaciones muy
grandes de bacterias (> 108 células/g húmedad ph. CAG) y los cambios en las
características de los afluentes, como cambios de temperatura, pH y cloro residual
pueden desarrollar un mayor número de bacterias que se vierten en el filtro de CAG del
contratista que trata el efluente.

Como actualmente no hay ningún requisito legal en las normas primarias del agua
potable para la medición del RHP, la decisión de monitorear el RHP y la elección de la
metodología dependen estrictamente del servicio de agua. Se espera que un manejo bien
informado y progresivo por parte del servicio de agua determine el uso del RHP como una
herramienta complementaria de información para realizar una operación óptima del
proceso de tratamiento y producir un producto de alta calidad para sus clientes.
Referencias

1. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19a. Edición. APHA,
AWWA, y WPCF. Washington, D.C. (19a. ed., 1995).

2. Reasoner, D. J. y E. E. Geldreich. 1985. A New Medium for the Enumeration and

Subculture of Bacteria from Potable Water. Appl. Environ. Microbiol., 49: 1-7.

3. Taylor, R. H., M. J. Allen y E. E Geldreich. 1983. Standard Plate Count: A Comparison of

Pour Plate and Spread Plate Methods. Jour. AWWA, 75 (1):35-37.

4. Taylor, R. H. y E. E. Geldreich. 1979. A New Membrane Filter Procedure for Bacterial

Counts in Potable Water and Swimming Pool Samples. Jour. AWWA, 71 (7):402-405.

5. Haas, C. N., M. A. Meyer, y M. S. Paller. 1992. Analytical note: Evaluation of the m-SPC
Method as a Substitute for the Standard Plate Count in Water Microbiology. Jour. AWWA,
74(6):322.

6. Fiksdat, L., E. A. Vik, A. Mills y J. T. Staley. 1982. Nonstandard Methods for

Enumerating Bacteria in Drinking Water. Jour. AWWA, 74(6) : 313-318.
Cuadro 1. Resumen de las alternativas para el recuento heterotrófico en placas
(RHP) en los métodos estándares, 19a. Edición. Sección 9215.

Volumen de la
Subsección Medio Incubación °C/tiempo
muestra
9215B, método de TGE 35 ± 0,5 °C/48 ± 3 h. 1 ml. máximo
placa fluida (MPF) PCA “ “ /72 ± 4 h.

R2A 35 ± 0,5 °C/72 ± 4 h.;

de preferencia de 5 a 7 días

28 °C ó 20 °C/5-7 días

9215C, método de Igual que Igual que 9215B 1 ml, pero

placa difusa (MPD) 9215B generalmente se usa
de 0,1 a 0,5 ml

9215D, método de m-RHP 35 ± 0,5 ° C/48 ± 3 h. Variable pero se

filtración por “ “ /72 ± 4 h. # puede filtrar ≥ 1 L,
membrana (MFM) según la turbiedad de
R2A Igual que 9215B la muestra

# = Agua embotellada.
Cuadro 2. RHP Ingredientes de los medios (g/litro)

Agar del
Ingrediente recuento en R2A Agar m-RHP Agar NWR1
placa (ARP)
Caseína soluble - - - 0,5
Triptona 5,0 - - -
Glucosa 1,0 0,5 - -
Extracto de levadura 2,5 0,5 - -
Proteosa peptona #3 o - 0,5 - -
polipeptona
Ácidos casaminos - 0,5 - -
Almidón soluble - 0,5 - -
K2HPO4 - 0,3 - 0,2
MgSO⋅7H2O - 0,05 - 0,05
Piruvate de sodio - 0,3 - -
Cloruro férrico - - - 0,001
Peptona - - 20,0 3,0
Gelatina - - 25,0 -
Glicerol - - 10,0 -
Agar 15,0 15,0 15,0 15,0
PH 7 ± 0,2 7,2 7,1 7,2
Agua destilada 1,0 L 1,0 L 1,0 L 1,0 L

Todos los medios, a excepción del m-RHP se esterilizan en el autoclave a 121 °C por 15
minutos después de hervir para disolver todos los ingredientes. Para preparar el agar m-
RHP se mezclan todos los ingredientes, excepto el glicerol, se ajusta el pH con 1,0 N
NaOH, se calienta para disolver, se añade glicerol y se coloca en el autoclave a 121 °C
por cinco minutos.
Cuadro 3. Distribución de los recuentos de bacterias de la misma muestra
tanto con el procedimiento de placa líquida como con el de la placa difusa.

Recuento de placas/mL

Procedimiento <500 500-1000 >500

Placa fluida

No. de muestras 570 26 33

Porcentaje 88,8 4,9 6,3

Placa difusa

No. de muestras 259 85 185

Porcentaje 49,0 16,1 34,9

Observación:

Las diapositivas (no incluidas en el paquete) indican que no tienen una copia impresa
correspondiente porque no fue posible escanearlas. Por ejemplo, las diapositivas 27-30
se presentarán durante la conferencia pero no se dispone de la copia impresa.

Todas las copias impresas están enumeradas al reverso para coincidir con la lista.

Tampoco se dispone de una versión electrónica debido al tamaño del archivo; se tendría
que utilizar un disquete por cada diapositiva.