PREPARACIÓN DE EXTRACTOS

Método por maceración

Preparación de las muestras:
Los carpóforos de hongo shiitake fueron deshidratados y pulverizados.

Se pesó 15 gramos en 100 ml de disolvente (Cloroformo, Etanol, Acetato de etilo, y solución

de 50% agua + 50% etanol).

Colocar la mezcla en un frasco ámbar de vidrio y almacenar en un lugar libre de la luz a

temperatura ambiente por un periodo de 6 a 7 días. Realizar una agitación por día.

Con el objetivo de separar el fluido de los sólidos presentes en los extractos macerados, se
colocaron las muestras en tubos para centrífuga.
Se centrifugó a 8000 rpm a una temperatura de 5°C por 20 min.
Con un papel se tamiza, obteniendo el extracto líquido y el palet.
El extracto obtenido se almacena en refrigeración en un frasco ámbar de vidrio.

MEDIO DE CULTIVO
Muller-Hinton Agar, el cual debe prepararse así:

1. Preparar el medio de acuerdo con las instrucciones de la casa manufacturadora.

2. Ajustar su pH a 7.2-7.4 con solución de NaOH 0.1N (el agar Muller Hinton comercial
viene con un pH de ya ajustado según las especificaciones de la etiqueta.
3. Pesar 38 gramos de Muller Hinton Agar por litro de agua destilada (según
especificaciones en la etiqueta).
4. Calentar la solución hasta ebullición de 3 a 5 min., cuidando que no se derrame.
5. Esterilizar en autoclave a una temperatura de 121 "C por 15 minutos.
6. Reposar hasta una temperatura entre los 48 y 50°C.
7. Distribuir el medio en cantidad aproximada entre 25-30 cc en cajas de Petrí estériles.
8. Dejar solidificar el agar en las cajas a temperatura ambiente en la cámara de flujo
laminar.

Con la finalidad que no existen gotas de agua de condensación sobre la superficie del medio
o sobre las tapas de las cajas de Petri se recomienda enfriar a 35°C aproximadamente antes
de colocarle la tapa

PREPARACION DEL INOCULO

Seleccionar 3 ó 4 colonias de las bacterias aisladas (cultivo puro), No utilizar cultivos de más
de 24 horas.
Transferir las colonias tocando la parte superior de cada una con un Aza bacteriológica a un
tubo que contenga 9 ml de solución salina al 1%, se agita en una agitador vortex hasta obtener
una turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala de McFarland.

PREPARACION DE LOS DISCOS PARA REALIZAR EN ANTIBIOGRAMA

En tubos eppendorf estériles (Autoclavados a 121°C por 15min), colocar 1 ml de la muestra
de extracto (los extractos se preparan para cada tratamiento).

En los tubos con el extracto, adicionar los discos en blanco (Oxoid ltd)(antimicrobial
susceptibility test discs) y reposar por 15 min.

SIEMBRA DE LA MUESTRA
Sumergir un aplicador de algodón estéril, dentro del tubo de ensayo (solución salina) que
contiene la suspensión del microorganismo en estudio.
Colocar el aplicador por encima del nivel del contenido del tubo y rotarlo contra las paredes
del mismo para remover el exceso del inóculo.
Tomar las cajas Petri que contienen el Muller Hinton Agar y con el aplicador hacer la siembra
en tres direcciones.
Dejar secar la superficie del medio sembrado durante 5 a 10 min manteniendo la caja con la
tapa cerrada.
Colocar los discos humedecidos con el extracto sobre la superficie del agar con un
dispensador o con pinzas estériles; con éstas presionar los discos ligeramente sobre el agar
para asegurar un contacto uniforme.
Colocar 6 discos en la periferia dejando entre disco y disco un espacio uniforme
(aproximadamente de 2 cm.); para evitar que las zonas de inhibición queden imbricadas.
Colocar los discos con antibióticos en la parte central.
Incubar las cajas a 37° C por 12 horas.
Leer las cajas después de de las 12 y 24 horas de incubación.
MEDICION DE LOS HALOS DE INHIBICON
Medir (mm) el diámetro de la zona de inhibición de cada disco incluyendo los 6 mm del
disco, con una regla sobre el respaldo de la caja de Petrí sin remover la tapa.