Guias de Practica 2016-2

UNIVERSIDAD CIENTÍFICA DEL SUR
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

GUÍA DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DEL CURSO " MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA"
Microbiología e
Inmunología
FACULTAD MEDICINA HUMANA
Lima – Perú
2016
INTRODUCCIÓN
La presente Guía es el modelo abierto por el que se regirán las prácticas de laboratorio los
profesores y estudiantes del curso de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina
Humana de la Universidad Científica del Sur (UCSUR).
Desde los primeros ciclos de la asignatura en la UCSUR, se han ido enriqueciendo las
1
prácticas de Microbiología, y para el ciclo 2016-2 se ha dado un avance categórico pasando
del enfoque taxonómico al sistémico, se ha integrado el curso al concepto pre-clínico de las
infecciones y enfermedades infecciosas causadas por bacterias, hongos, virus y priones, en
órganos y sistemas del cuerpo humano, sin dejar de tratar temas puntuales de bioseguridad,
modos de transmisión de infecciones, enfermedades infecciosas de importancia regional o
nacional, e infecciones adquiridas en los servicios de salud. En el curso además, se han
integrado los conocimientos teórico - prácticos, de manera que los agentes biológicos se
enfocan al mismo tiempo; en las clases teóricas a través de las etiopatogenias de las
enfermedades principales que producen, y en el laboratorio mediante el diagnóstico de los
agentes causales de estas enfermedades, en ocasiones motivados por la presentación de un
caso clínico y la orientación del uso específico de antimicrobianos de acuerdo a los resultados
de la interacción agente etiológico - agente antimicrobiano in vitro.
Las prácticas de Laboratorio en este curso pre- clínico, está dirigido a educandos de Medicina
Humana que se enfrentan por primera vez al laboratorio de Microbiología, los insumos
biológicos y las prácticas en general, están diseñadas para contribuir con la prevención de
accidentes por productos biológicos en los educandos (bioseguridad), pero la actitud
responsable y la disciplina individual y grupal serán siempre esenciales. Por las mismas
razones no se expondrá a los alumnos a muestras de pacientes desconocidas por los
profesores que pudieran entrañar algún peligro. Cuando sea necesario y por estas razones
fundamentalmente, las prácticas serán demostrativas o simuladas, sabiendo que la malla
curricular contempla en ciclos posteriores, estudios diagnósticos de Patología Clínica e
Infectología en los cuales se obtendrán desempeños de mayor responsabilidad con el paciente,
y para los que este curso aporta las bases microbiológicas e inmunológicas.
Por lo general cada práctica se ejecuta en dos sesiones en días continuos de manera que la
segunda sesión constituye en muchos casos la continuidad de la primera, y no es por otra
razón que no sea esencialmente técnica. El futuro médico debe aprender que las muestras y
los microorganismos que se estudian deben ser procesados en al menos dos tiempos, en el
primero se indica y envía al Laboratorio una muestra procedente de un sitio donde
presumiblemente está la infección en el paciente, y generalmente en el caso de las bacterias
comunes y hongos levaduriformes, se colorean y ven al microscopio como diagnóstico
presuntivo oportuno y de gran ayuda al médico asistente, luego, paso a paso se llega al
diagnóstico confirmativo en la sesión del día siguiente. Estos pasos van desde la fase pre -
analítica con la indicación, toma de muestras, conservación y transporte de las mismas, la fase
analítica de procesamiento e identificación del agente etiológico e información de la sensibilidad
y resistencia a los medicamentos antimicrobianos específicos en muchos casos, hasta la fase
post - analítica, donde el médico interpreta los resultados del Laboratorio. Aprenderá además
que el diagnóstico microbiológico, es también el uso de técnicas de avanzada, donde los
métodos inmunológicos y moleculares le serán de gran utilidad por la oportunidad y pertinencia
en algunos casos, que afortunadamente cada día son más factibles.
Una recomendación al respecto de esta Guía quisiéramos los profesores hacerles a

nuestros alumnos; involúcrense en cada práctica de laboratorio a través de los
instrumentos que les ofrecemos, la Guía de Prácticas del Laboratorio del curso de
Microbiología e Inmunología es uno de ellos, ha sido pensada y diseñada expresamente
para que la enriquezcan con sus sugerencias y aportes, los profesores también
aprendemos de Ustedes.
PRÁCTICA N°1
SEGURIDAD Y BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA.

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA.
1. Introducción a la Seguridad y Bioseguridad.
Sumario:
- Prueba de entrada al Laboratorio.
1
- Niveles de Bioseguridad en los laboratorios de Microbiología.
- Buenas Prácticas de Desempeño en el Laboratorio.
- Materiales y equipos del Laboratorio.
Objetivo: Incorporar las buenas prácticas de desempeño para prevenir accidentes y

enfermedades en el laboratorio de Microbiología, basadas en los conocimientos de virulencia de
los microorganismos, los modos de transmisión y los riesgos existentes para el educando y los
trabajadores, sin detrimento del medio ambiente interno y externo.
2. Materiales y equipos principales del Laboratorio.
1.Microscopio
2.Aceite de inmersión
3.Mechero de gas (Bunsen)
4.Fósforos, cerillas o fosforeras
5.Pipetas (tipos diferentes)
6.Pro-pipetas
7.Asas de siembra
8.Placas de Petri
9.Lápices cristalográficos o plumones resistentes al agua de Laboratorio
10.Medios de cultivo y reactivos en frascos originales
11.Medios de cultivo específicos dispensados en placas y tubos con tapa de rosca
12.Gradillas de tubos
13.Baño de agua ( María)
14.Balanzas
15.Jarras para anaerobiosis
16.Refriferadoras
17.Respiradores NIOH-95 y/o FFP2 y 3
18.Guantes de latex no estériles
19.Lentes de protección facial y protección U.V.
20.Lavaojos
21.Bolsas plásticas para descarte de material contaminado
22.Desinfectantes
23.Antisépticos
24.Papel toalla cortado y descartable
25.Autoclaves
26.Horno
27.Cabina de Seguridad Biológica
28.Otros
METODOLOGIA
1. Reconocimiento de las principales Barreras de Protección y material usado en las

prácticas
2. Preparación de materiales para las prácticas
3. Siembra y aislamiento de microorganismos de diferentes muestras.
Introducción al uso del Laboratorio de Bacteriología.

Sumario:
- Algoritmo y pasos del diagnóstico etiológico presuntivo y confirmativo.
- Sensibilidad y especificidad, valor predictivo positivo y negativo de las pruebas diagnósticas.
- Práctica Demostrativa: Morfología macroscópica y microscópica de las bacterias, pasos de
la identificación y sensibilidad in vitro de las bacterias a los antibióticos.
Objetivo:
Conocer y socializar el uso del Laboratorio de Bacteriología que le permita iniciarse en el
diagnóstico presuntivo y confirmativo de infecciones y enfermedades infecciosas de etiología
1
bacteriana.
METODOLOGIA
Diagnóstico Presuntivo
1. Microscopía en fresco y/o con coloraciones de acuerdo a la impresión diagnóstica de

la Indicación y el origen o sitio anatómico de donde proviene la muestra. De la mayor
importancia en las muestras provenientes de sitios supuestamente estériles. Coloración
universal: GRAM.
2. El examen microscópico puede incluir: Conteo de células bacterianas y/o células
leucocitarias o epiteliales cuando proceda, en ocasiones estos y otros parámetros
permiten evaluar la calidad de la muestra para orientar la procedencia a la
identificación confirmativa.
Diagnóstico Confirmativo
3. Cultivo en medios adecuados a la impresión diagnóstica o al diagnóstico presuntivo de

Laboratorio. Medio de cultivo universal: AGAR NUTRITIVO CON SANGRE DE
CARNERO.
Proceso de Identificación
4. Aislamiento de colonias características.
5. Pruebas fisiológicas y/o bioquímicas.
6. Pruebas de identificación antígeno - anticuerpo de la cepa aislada (si procede).
7. Prueba de sensibilidad y resistencia de la cepa aislada y/o identificada a los
antimicrobianos. Prueba in vitro universal: MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR
MEDIANTE DISCOS DE PAPEL IMPREGNADOS EN ANTIBIÓTICOS (KIRBY-
BAUER).
EXPERIMENTOS:
1.- COLORACIÓN GRAM1

2.- MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA in vitro (1)2
Planteamiento:
1. En cada mesa de trabajo se distribuirán las placas con las colonias de interés que
señale el profesor. Ud. realizará la coloración de Gram de una colonia. Esta actividad le
llevará unos minutos, mientras se seca la lámina portaobjetos,…para observar los
resultados al microscopio y determinar la morfología y los efectos de la coloración de
gran ayuda al diagnóstico presuntivo,…, haga el dibujo de la observación que realice,
consulte las de sus compañeros. Compare con la coloración que enseña el profesor en
el microscopio central.
1
Garrido F I, Cornejo C M y Salinas J E,“Manual de colorantes para laboratorios de Ciencias biológicas” UNAM
México, 2003.
2
Instituto Nacional de Salud. Manual de Procedimientos para la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana por el
Método de Disco-Difusión, Lima, 2002.
2. Inoculará una alícuota del cultivo de la bacteria (cuya población es causante de una
infección en el paciente), en un medio de cultivo especial, pondrá unos discos de papel
conteniendo antibióticos. Esa placa de Petri ya sembrada y con los discos puestos la
llevará a la incubadora de 35°C, que se encuentra apta para ese uso en el Laboratorio,
al día siguiente leerá e interpretará los resultados. Compare su placa antes de llevarla
a la incubadora con las del profesor en la meseta central.
1
Procedimiento Coloración GRAM
1. Del cultivo joven de bacterias, tomar el inóculo con el asa de siembra, siguiendo las
indicaciones del profesor. Extender sobre la lámina conforme se indica en las recomen-
daciones generales. Flamear nuevamente el asa hasta quedar estéril y colocar en la
gradilla.
2. Fijar la preparación a la llama del mechero por pasadas ligeras. Se controla sobre el
dorso de la mano. Si el calentamiento es moderado, no habrá calcinación.
3. Cubrir con la solución Cristal Violeta por 1 minuto.
4. Escurrir el exceso de colorante.
5. Cubrir la preparación con Lugol, por 1 minuto.
6. Diferenciar con alcohol acetona hasta que éste no arrastre colorante. Es mejor regular
la acción del alcohol con movimientos de balanceo con la preparación antes de ser
descartado.
7. Lavar con agua corriente.
8. Contrastar con el colorante Safranina, por 30 segundos a 1 minuto.
9. Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para evitar precipitados.
10. Secar al ambiente o con ayuda de la incubadora a 36°C.
11. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de inmersión.
Procedimientos técnicos:
Medición de la actividad antimicrobiana in vitro.
Objetivos.
- Iniciar los primeros pasos para determinar la actividad antibiótica in vitro por el método de
difusión en agar (Kirby & Bauer). Método de referencia.
Procedimiento.
1. Cultivos jóvenes de cepas de referencia y cepas problema.

2. Placas de agar Muller-Hinton.
3. Discos de antibióticos de amplia gama.
4. Pipetas graduadas de 1 ml.
5. Hisopos estériles.
6. Dispensador de discos o en su defecto, plantilla, pinzas de punta fina, alcohol.
7. Escala de Mc Farland
1. Inocular la placa: Empezando en la parte superior de la placa de agar Muller-Hinton, donde

está por la parte externa escritas las referencias necesarias, inocule la superficie con el
hisopo. Cubra toda la placa frotando de ida y vuelta de un borde al otro. Rote la placa
aproximadamente 60º y repita el procedimiento de frotado. Rote otra vez la placa 60º y frote
toda la placa por tercera vez. Esto garantizará que el inóculo sea distribuido
homogéneamente.
2. Colocar discos de antimicrobiano: Coloque los discos con los agentes antimicrobianos
dentro de los 15 minutos siguientes a la inoculación de la placa de Agar Muller-Hinton.
3. Incubar la placa: Invierta las placas e incúbelas de inmediato. Para las bacterias no
fastidiosas o exigentes (correspondientes a esta práctica), incube a 35°C por 16–18 horas.
PRÁCTICA N°2
DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO DE LAS MICOSIS Y DE LAS INFECCIONES VIRALES.
Sumario:
- Algoritmo general del diagnóstico etiológico de las micosis superficiales, sub-cutáneas y
profundas.
- Práctica Demostrativa: Morfología macroscópica y microscópica de dermatofitos y
1
levaduras.
FASE PRE - ANALÍTICA
1. Indicación. (orden del análisis con los datos necesarios para la orientación
diagnóstica)
2. Condiciones apropiadas para la toma de la muestra.
3. Muestra o producto patológico. En el caso de dermatofitos se utiliza el raspado de la
lesión en la piel o las uñas, o el cabello arrancado si hay alopecia. Se puede utilizar la
lámpara de Wood a 366nm para ver si fluoresce la lesión superficial.
4. Transporte y envío acondicionados para la protección de las cualidades de la muestra,
la bioseguridad y la seguridad ambiental.
FASE ANALÍTICA
5. Recepción de la Indicación y la muestra en las condiciones exigidas.

6. Analizar si procede el diagnóstico rápido confirmativo, principalmente por técnicas
específicas antígeno - anticuerpo, (especialmente aglutinación con látex,
inmunofluorescencia directa moleculares (PCR, hibridización "in situ"). de no ser
factible, continuar con el paso a paso siguiente:
Diagnóstico Presuntivo
7. Microscopía en fresco y/o con coloraciones de acuerdo a la impresión diagnóstica de

la Indicación y el origen o sitio anatómico de donde proviene la muestra. De la mayor
importancia en las muestras provenientes de sitios supuestamente estériles.
Coloración: Gram, Giemsa, Calcofluor, (Tinta china para observa cápsula). En los
hongos el diagnóstico microscópico convencional es muy utilizado, tanto para
levaduras como para hongos filamentosos y de mayor especificidad en estos últimos.
Si se trata de micosis superficiales sospechando dermatofitos la microscopía es de
gran valor. En caso de cabello o pelo, se puede observar el daño del mismo.
8. Histopatología (cuando proceda). COLORACIONES: Coloración de rutina:
Hematoxilina - Eosina. Coloraciones especiales: Gomori – Metenamina - Plata,
Mucircamina.
Diagnóstico Confirmativo
9. Cultivo en medios adecuados a la impresión diagnóstica o al diagnóstico presuntivo de

Laboratorio. Medio de cultivo universal: AGAR SABOUROUD GLUCOSADO CON
ANTIBIÓTICOS. Si se sospechan hongos dimorfos se cultiva a temperaturas
ambientales (17 - 27 °C) y a temperaturas de 36 °C.
Proceso de Identificación a partir del cultivo
10. Aislamiento de colonias características.

11. Morfología macroscópica y microscópica
12. Pruebas fisiológicas y/o bioquímicas.
13. Pruebas de identificación antígeno-anticuerpo de la cepa aislada (si procede).
14. Prueba de sensibilidad y resistencia de la cepa aislada y/o identificada a los

antimicrobianos. Prueba in vitro, por varios métodos, el de referencia es el método de
microdilución M27-A2, (Clinical Laboratory Standard Institute -CLSI- antes National
Committee for Clinical Laboratory Standards- NCCLS. Además, se ha avanzado en el
estudio de técnicas moleculares para la detección de la resistencia de algunas
especies de Candida, como el AP-PCR (arbitrarily primed polymerase chain reaction).
1
PRÁCTICA DEMOSTRATIVA:
CASOS
Se presentan cultivos en tubos con tapa de rosca, Placas de Petri con microcultivos y láminas
de diferentes hongos dermatofitos y levaduras de casos procedentes de pacientes, y pruebas
de sensibilidad y resistencia de las levaduras (Candida spp.) in vitro.
- Observen la morfología macroscópica y microscópica de los aislamientos y los resultados de

la prueba de sensibilidad a los antimicóticos de Candida spp. in vitro.
EXPERIMENTO:
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA (LEVADURAS) in vitro3 (1)
Objetivos:
- Explicar la técnica de Epsilometría (E-test) en sus pasos significativos.
- Interpretar los resultados obtenidos.
Procedimientos:
1. Un cultivo puro y joven procedente una muestra de sangre de un paciente crítico con
una especie de Candida, se estandariza con respecto al tubo 0.5 de la Escala de Mc
Farland, utilizando NaCl 0,85% estéril diluido 1:5.
2. Se inocula antes de que transcurran 15 minutos en la superficie del agar Sabourod
glucosado al 2% de una placa de Petri de 150 mm de diámetro, por el método del
hisopo embebido en la suspensión estandarizada, que al ser retirado se rota varias
veces contra la pared del tubo por encima del nivel del líquido con la finalidad de
eliminar el exceso de inóculo.
3. Dejar secar aproximadamente 15 min si fuera necesario, ya que debe estar

completamente seca la superficie inoculada.
4. Colocar las tiras de antibióticos (E-test), con una pinza estéril o un aplicador,
asegurando que la escala CIM esté hacia arriba y que la máxima concentración esté
hacia el borde de la placa, si fuera necesario presionar suavemente las tiras sobre la
superficie. Utilizar una plantilla para lograr la uniformidad como se muestra en la figura.
5. Se incuba a 35°C por 24 horas.
3
Instituto Nacional de Salud. Manual de Procedimientos para la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana por el
Nota:
- Si se observa burbujas entre la tira y el agar, retirarlas presionando en la tira
suavemente con la pinza.
- Una vez colocada la tira, esta no puede ser retirada porque el antimicrobiano difunde
inmediatamente en el agar.
Sumario:
- Algoritmo general del diagnóstico etiológico de las infecciones virales.
- Métodos histo-patológicos, inmunológicos, genéticos y otros. Efecto citopático. Actividad
antivírica in vitro.
- Evaluación Continua de Laboratorio de la Práctica N° 2.
Desarrollo:
CASOS. (A través de sesión de láminas)
1. Casos con muestras y láminas citológicas e histológicas que muestren tejidos normales
y tejidos con efectos citopáticos por diferentes virus.
2. Casos con láminas al Microscopio Electrónico (ME) o métodos inmunológicos (MI) de
biopsias o necropsias.
3. Casos de aislamiento viral.
4. Casos de detección inmunológica, de electroforesis de proteínas y molecular de
proteínas virales.
5. Casos de resistencia a los antivirales.
EXPERIMENTO:
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA (LEVADURAS) in vitro (2)
Objetivos:
- Explicar la técnica de Epsilometría (E-test) en sus pasos significativos.
Procedimientos:
1. Realizar la lectura después del periodo de incubación recomendado solamente si se

observa desarrollo visible.
- El valor de la concentración inhibitoria mínima (CIM) se lee donde la elipse de
inhibición intercepta la escala en el borde de la tira.
- Si se observa crecimiento a lo largo de toda la tira (no se observa ninguna elipse) se
debe interpretar como mayor (>) que el valor más alto de la escala de lectura.
- Cuando la elipse de inhibición está por debajo de la tira (es decir, cuando el borde
límite no intercepta la tira, el CIM debe ser reportado menor (<) que el valor más bajo
de la escala de lectura.
- Usualmente los puntos de corte son agudos, pero se deben seguir las
recomendaciones del fabricante para realizar la lectura e interpretación.
- No realizar la lectura si el cultivo tuviera algún contaminante, si el crecimiento es muy

pobre o abundante. En estos casos repetir la prueba.
- Si los puntos de corte caen entre dos diluciones debe redondearse a la dilución más
alta antes de la categorizarla.
Generalidades del método por E-test.
Del método.
1
Este método de sensibilidad por difusión en agar consiste en el uso de una tira plástica
delgada, inerte y no porosa, que contiene un gradiente continuo y predefinido del antimicótico;
se coloca sobre la superficie de una placa de agar Sabourod glucosado inoculado con la
levadura que se va a investigar. El valor de la CIM se lee en el punto donde la elipse de
inhibición intercepta la escala del antimicótico en la tira correspondiente.
Se han estandarizado varias técnicas in vitro para la detección de la resistencia de E.test. Los
agentes etiológicos, que muestran correlación con la evolución clínica de los enfermos. Por
eso, parece cada vez más importante conocer el perfil de susceptibilidad de las cepas clínicas y
el espectro de acción de los antimicóticos.
Sumario:
- Diagnóstico bacteriológico por técnicas de avanzada; Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
- Práctica Demostrativa: PCR. Tipificación molecular de una cepa de Escherichia coli
causante de un brote de diarreas con sangre de origen comunitario.
- Experimento: Medición de la actividad antibacteriana in vitro (2).
Desarrollo:
Diagnóstico de bacteriológico por técnicas de avanzada. Reacción en cadena de la

polimerasa (PCR)
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE UNA CEPA Escherichia coli CAUSANTE DE UN BROTE
DE DIARREAS CON SANGRE DE ORIGEN COMUNITARIO.
Objetivos
 Obtener ADN plasmídico de células bacterianas utilizando el método de lisis celular por
lisis alcalina.
 Identificar las acciones de los componentes del protocolo de extracción.
 Tipificación molecular mediante cadena de reacción de la polimerasa (PCR)
 Realizar una corrida electroforética de la muestra de ADN bacteriano y observarlo en
gel de poliacrilamida
Materiales
Material biológico
Cultivo puro de una cepa de Escherichia coli.
Procedimiento
Recolección de las bacterias

 Se coge un ependorf de 1,5 ml y se adiciona en el 1000 µl de un cultivo bacteriano (E.
coli). Este cultivo creció durante toda la noche a 37°C en caldo nutricio.
 Centrifugar a temperatura ambiente, durante 3 min a 12.000 g. Retirar el sobrenadante

con mucho cuidado utilizando la micropipeta con la punta azul.
 Dar un pulso de centrífuga y retirar cuidadosamente el sobrenadante que aún quede ahora
utilizando la micropipeta con la punta amarilla. Solo quedarse con el precipitado de las
bacterias.
Lisis alcalina
 Resuspender (agitando vigorosamente) el sedimento de bacterias en 100 μl de una
solución I. Se deja a temperatura ambiente durante 5 min. 1
 Añadir al mismo tubo, 200 μl de la solución II. Agitar suavemente con la mano por
inversión del tubo (unas 10 veces). Se incuba 5 min a 4°C.
Neutralización
 Añadir al mismo tubo, 150 μl de la solución III. Se agita con la mano por inversión del tubo
(unas 10 veces). Se incuba 5 min a 4°C.
Aislamiento de los plásmidos
 Centrifugar el tubo ependorf por 12 min a 12000 rpm a 4°C, retirar 100 μl del sobrenadante
que contiene ADN plasmídico y se dispensa en un tubo limpio (previamente marcado).
 Añadir 1 ml de etanol absoluto (4°C) al tubo en el que hemos puesto la solución con el
ADN plasmídico. Se mezcla con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces). Se incuba
10 min a 4°C.
 Centrifugar el tubo por 15 min a 12000 rpm a 4°C, retirar el sobrenadante (punta azul).
 Al mismo tubo se le adiciona, 900 μl de etanol al 70% (4°C). Se mezcla suavemente con la
mano por inversión del tubo (unas 10 veces).
 Se vuelven a precipitar los plásmidos por centrifugación por 10 min a 12000 rpm a 4°C, se
retira cuidadosamente el sobrenadante (punta azul)
 Dar un pulso de centrífuga y retirar cuidadosamente el sobrenadante que aún quede con
una punta azul y luego con la punta amarilla. El pellet resultante es el precipitado
conteniendo el ADN plásmidico.
 Disolver el precipitado de los plásmidos (aspirando y soltando el líquido varias veces con
ayuda de la micropipeta) en 50 μl de tampón TE (pH 8,0).
 Incubar a temperatura ambiente por 5 min y luego mantener la muestra a 4°C.
Amplificación
El tampón para el PCR estará compuesto de;dNTPs a 250 μM, los iniciadores del gen para la
toxina termoestable (est) ST-1 CTGTATTGTCTTTTTCACCT / ST-2
GCACCCGGTACAAGCAGGAT cuyo amplicón es de 107 pb; la toxinas Shiga (Stx) Stx1a
GAAGAGTCCGTGGGATTACG / Stx1b AGCGATGCAGCTATTAATAA siendo 130 pb el
producto de su amplicón; para Stx2a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT/ Stx2b
GCTCTGGATGCATCTCTGGT y el genrfbO157F CGGACATCCATGTGATATGG
O157R TTGCCTATGTACAGCTAATCCel amplicón es de 346 y 259 pb respectivamente.
Para amplificar el gen est, Stx, rfbO157 se les adicionará 2 unidades de Taq polimerasa y 5 μl
del ADN molde. Las condiciones para la amplificación serán las siguientes: 12 minutos para la
desnaturalización a 94ºC, 30 ciclos de amplificación (45 segundos para desnaturalización a
94ºC, 45 segundos para la hibridación a 50ºC y 1 minuto a 72ºC para el proceso de extensión),
y se terminará con una última fase de extensión de 2 minutos a 72ºC y posterior enfriamiento
hasta 4ºC.
Electroforesis
 Cargar las muestra de ADN plasmídico y una muestra referencial (marcador de peso
molecular) en geles de agarosa al 1% preparados con anterioridad, que están contenidos
en una cámara de electroforesis.
 Tapar la cubeta de electroforesis y se conectar los electrodos a la fuente de alimentación
(rojo para el polo positivo).
 Programar la fuente a 70 voltios y se dejar funcionar la electroforesis durante 45 min.
Visualización del ADN plasmídico

 Acabada la electroforesis, colocar el en un transiluminador y se irradia con luz UV. Realizar
esquemas de la imagen resultante, indicar el grosor aproximado de las bandas que
aparezcan con mayor nitidez y su posición en el gel.
1
EXPERIMENTO:
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA in vitro
Usted inició la primera parte de este experimento un día atrás (ideal 16 - 18 horas de
incubación) con la siembra de una cepa bacteriana pura y joven (a partir de 4 a 5 colonias
aisladas mediante sub cultivo) entregadas por los profesores. En 15 minutos aproximadamente,
estandarizó el inoculo mediante una escala que simulaba una concentración bacteriana
conocida, inoculó con un hisopo en una placa de Petri con agar Muller-Hinton hasta cubrir toda
1
la superficie del agar, dispensó los discos de papel conteniendo antibióticos de concentración
conocida y estandarizada, a una distancia ≥ 2.5 cm e inmediatamente incubó a temperatura de
35°C en atmósfera aerobia.
Sus compañeros y los profesores hicieron casi lo mismo, algunos emplearon otras cepas.
Objetivos:
- Explicar la técnica de antibiograma por el método de Kirby-Bauer en sus pasos
significativos.
Procedimientos (Continuación)
1. Retire la placa de Petri de la incubadora:

2. Examine detenidamente la placa para verificar que el crecimiento sea uniforme y
confluente de tal modo que pueda identificar zonas sin crecimiento bacteriano.
3. Para medir las zonas de inhibición desde la parte posterior de la placa usando luz
reflejada:
• Sostenga la placa unos pocos centímetros sobre una superficie de color negro
que no refleje la luz.
• Mida el diámetro del halo de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de
cada disco de antibiótico específico por debajo de la placa (se mantiene
cerrada), incluyendo el propio disco en la medición y redondeando al milímetro
más cercano con una regla milimetrada o un calibrador Vernier o nonio o pie de
rey.
4. Comparar los resultados de la medición en cada disco versus la cepa bacteriana,
con los ofrecidos como estándares de sensibilidad, resistencia y sensibilidad
Intermedia del cuadro de referencia.
5. Interpretar los resultados con la ayuda del profesor.
6. Algunas zonas podrían ser difíciles de medir.
7. Si hay doble zona: Mida la zona más interna.
8. Colonias dentro de la zona: Esto puede deberse ya sea a un cultivo mixto, que por lo
general es obvio, o a una subpoblación resistente de la bacteria analizada. Repita la
prueba con una sola colonia o subcultivo de una sola colonia de la placa del cultivo
primario.
9. Cómo Interpretar la Zona de Inhibición con Bordes Difusos: Mida el punto en el cual se
puede ver una demarcación obvia entre crecimiento y ausencia de crecimiento.
PRÁCTICA N°3
FLUIDOS CORPORALES NORMALMENTE ESTÉRILES EN LA AYUDA AL DIAGNÓSTICO

DE INFECCIONES.
Sumario:
- Indicaciones de muestras de sangre.

- Práctica Demostrativa: Hemocultivo para bacterias y hongos.
1
- Experimento: Proteína C Reactiva.
Objetivos:
- Explicar la indicación y procedimientos generales de los hemocultivos cuando se

sospecha bacteriemia, fungemia con o sin septicemia, con resultados positivos a dos
cepas de microorganismos frecuentes en momentos diferentes para un paciente en la
práctica médica.
- Saber indicar, explicar e interpretar la prueba, Proteína C Reactiva.
CASOS
1. Toma de muestras (frecuentemente tomada por el médico en pacientes hospitalizados,

especialmente en pacientes críticos o por el técnico de laboratorio):
a) Si existieran curvas febriles en los reportes de enfermería del propio paciente o familiar
a cargo, que muestren diferencias dadas por picos u ondulaciones respecto al tiempo,
se toman las muestras para hemocultivos seriados al inicio del pico o la ondulación
febril.
b) Técnica estrictamente aséptica con guantes (no necesariamente estériles pero de un
solo uso).
c) Aplicar torniquete y localizar una vena fija por palpación.
d) Limpieza de la piel alrededor del sitio de la venipuntura mediante frotación con gasa
conteniendo alcohol etílico o isopropílico 70-95%.
e) Antisepsia de de la piel mediante frotación en círculos concéntricos desde el sitio donde
se realizará la venipuntura, incrementando el diámetro, con gasa conteniendo
Clorhexidine al 2% en solución acuosa estéril.
f) Dejar secar la solución antiséptica al menos por 30" (no se toca la piel ya preparad para
la punción).
g) Punción y extracción de sangre (de acuerdo a técnicas normalizadas para proteger la
vena y con supresión del torniquete), en tubos al vacio con extracción de sangre
suficiente, en adultos aproximadamente 20 ml.
h) Añadir la sangre a frascos de hemocultivo para bacterias aerobias, anaerobias y
hongos.
i) Llevar al Laboratorio lo antes posible.
2. Recepcionar e incubar de acuerdo a las normas para bacterias y hongos.

3. Observación diaria de posible turbidez y crecimiento. (Comunicación con el médico
asistencial)
4. Siembra por estriado para aislar colonias, en Placas de Petri con medios de cultivos de
acuerdo a la sospecha diagnóstica (bacterias aerobias comunes, exigentes, aerobias,
anaerobias, hongos) e incubación a temperaturas ídem.
5. Aislamiento de colonias sospechosas de estafilococos dorados y levaduras.
6. Láminas con coloración de Gram clasificables en estafilococos y levaduras.
7. Identificación de los microorganismos.
8. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos in vitro.
EXPERIMENTO:
PROTEÍNA C REACTIVA4.
Proteína C Reactiva por el método de aglutinación en látex de niveles cualitativos
Caso
1
Paciente sospechoso de tener un proceso infeccioso agudo con aproximadamente 18 horas de
evolución.
Procedimientos:
1. Utiliza guantes, está supuestamente trabajando con una muestra de suero desconocido. El
control positivo es un suero humano también y aunque ha pasado por controles con
resultados negativos para algunos antígenos como VIH, VHB ag S, VHC debe ser
manipulado con la misma precaución que un suero muestra. Además contiene pequeñas
cantidades de azida sódica. Evítese el contacto con la piel dañada y las mucosas.
2. Dispone del suero del paciente extraído y conservado a temperaturas refrigeradas no
congeladas y permite que se atempere al ambiente. (No utilizar sueros hemolizados ni
contaminados ni extraídos con > 48 horas. No utilizar sueros altamente lipémicos pues
podrían dar una aglutinación no específica. Las muestras con resto de fibrina deben ser
centrifugadas antes de la prueba.
3. Los reactivos están estabilizándose a temperatura ambiente (estaban en temperaturas de
conservación refrigeradas de acuerdo a recomendaciones del fabricante).
4. Homogeneizar el reactivo de látex con una agitación suave.
5. Comprobar la funcionabilidad de los reactivos con los controles positivos y negativos.
6. Añadir una gota (calibrada a 50 μL) del suero a la lámina (de ser posible con fondo negro
para visualizar efectivamente los resultados).
7. Añadir al lado del inóculo del suero una gota calibrada del reactivo (látex + anti - Proteína C
Reactiva altamente purificada).
8. Mezclar las dos gotas con un palillo de madera o plástico y extenderla por todo el círculo.
9. Preferiblemente se debe colocar la lámina en un agitador rotatorio (80-100 RPM) y
observar la aparición o ausencia de aglutinación exactamente al cabo de 2 minutos. (El
exceso del tiempo de reacción podría dar lugar a resultados falsos positivos). En caso de
no tener el agitador rotatorio la agitación se puede hacer manual en forma rotatoria en
ángulo de 45°C y lentamente.
10. Observar inmediatamente la aglutinación utilizando una fuente de luz directa. Comparar las
reacciones del suero y los controles.
11. Interpretar los resultados: La presencia de aglutinación indica un nivel de Proteína C
Reactiva igual o superior a 6 mg/L en la muestra. La ausencia de aglutinación indica un
nivel de Proteína C Reactiva inferior a 6 mg/L en la muestra.
12. En la interpretación es necesario tener en cuenta: Los valores de referencia normales se
consideran: ≤ 6 mg / L. Límite de detección: 6 mg/L. Valor de prozona: Negativo hasta 1600
mg/L. Sensibilidad diagnóstica: > 95 %. Especificidad diagnóstica: > 96 %. Interferencias:
Interfiere el factor reumatoideo a partir de 100 UI/mL. No interfieren: Bilirrubina 342 μmol/L.
Hemoglobina 10 g/L. Lípidos 10 g/L. Una concentración muy elevada de Proteína C
Reactiva en la muestra puede dar lugar a resultados falsos negativos. Se recomienda re-
ensayar la muestra con un volumen de 20 μL. 2. El diagnóstico definitivo no debe realizarse
con los resultados de un único ensayo, sino que deben considerarse al mismo tiempo los
datos clínicos del paciente. En comparación con otras metodologías como precipitación en
agar, o la precipitación en capilar, la sensibilidad de la aglutinación con partículas de látex
es mayor para detectar niveles bajos de Proteína C Reactiva. Valores normales en el suero
no pueden ser detectados por este método cualitativo.
4
Torres H, Cáceres AM. Proteína C Reactiva. Actualidades de Infectología, 2000; 16: 28-32.
Sumario:
- Indicaciones de Líquido Cefalorraquídeo (LCR).

- Práctica Demostrativa de Líquido Cefalorraquídeo; valores citoquímicos normales vs.
infecciones bacterianas, micóticas y virales.
- Experimento: Coloración con tinta china para hongo levaduriforme encapsulado.
1
Objetivos:
- Se muestran láminas coloreadas con Gram y se explica el diagnóstico presuntivo.

- Se muestran diferentes muestras de LCR con aspectos turbios, purulentos,
opalescentes,…, agua de roca.
- Se explican los diferentes valores citoquímicos del LCR en las infecciones bacterianas
piógenas y no piógenas, micóticas y virales.
CASOS
Muestras de Líquidos Cefalorraquídeos procedentes de diferentes pacientes con meningitis

infecciosas bacterianas, micóticas y virales comparados con muestras de pacientes con
Líquidos Cefalorraquídeos normales.
1. Muestra (Una parte para determinar los valore citoquímicos y la otra para determinar la
presencia o no de microorganismos).
Para determinar la presencia o no de microorganismos:

2. Centrifugación.
Diagnóstico Presuntivo:
3. Examen microscópico del sedimento en lámina con coloración fundamentalmente

GRAM.
4. Diagnóstico confirmativo rápido por aglutinación en látex, comercialmente hay kits para
varios géneros y especies de bacterias y hongos levaduriformes, y métodos de ELISA y
moleculares además para virus, si no es posible:
Diagnóstico Confirmativo por métodos convencionales:
5. Cultivo en medios especiales de acuerdo al diagnóstico presuntivo (bacterias u

hongos).
6. Identificación.
EXPERIMENTO:
COLORACIÓN CON TINTA CHINA PARA HONGO LEVADURIFORME ENCAPSULADO.
Objetivos:
- Aprender el diagnóstico presuntivo de excelencia en las meningitis por levaduras,
especialmente por Cryptococcus spp.
Procedimientos:
1. Una alícuota (3 gotas) del sedimento de LCR previamente centrifugado se extiende en

una lámina.
2. Añada 3 gotas del colorante Tinta china (Colorante de Cobre- tinta Parker-KOH).
3. Dejar reposar hasta que aparece un color marrón.
4. Observación al microscopio: Levaduras redondas de 7 a 15 μm de diámetro, en
algunos casos pueden producir blastoconidias. Su principal característica es la de
presentar una cápsula que la circunda, visible al examen directo con la tinta china, ya
que la cápsula no se colorea por lo que se observa la cápsula como un halo blanco.
1
Control positivo: Cryptococcus neoformans. Control negativo: Candida albicans.
PRÁCTICA N°4
REACCIONES ANTÍGENO - ANTICUERPO.
Sumario:
- Fundamentos de las pruebas.

- Práctica Demostrativa: Técnicas de precipitación.
- Experimento: Pruebas de aglutinación en lámina y floculación (Reagina plasmática
1
rápida - RPR)
Objetivos:
- Explicar los fundamentos generales de las reacciones antígeno-anticuerpo.

- Interpretar las técnicas de precipitación en agar.
- Saber indicar, explicar e interpretar la prueba de aglutinación en lámina con látex para
identificar Cryptococcus neoformans, y la prueba de floculación en lámina para el
diagnóstico presuntivo de Sífilis (Reagina Plasmática Rápida-RPR)
PROCEDIMIENTO
1. Anotar el antígeno correspondiente en la placa de vidrio.

2. Depositar en cada cuadro 0.04ml de suero del paciente para cada uno de los antígenos que
se vayan a utilizar.
3. A cada gota de suero añadir una gota de cada antígeno.
4. Mezclar con un aplicador limpio (utilizar un aplicador para cada antígeno.
5. Agitar suavemente la placa por rotación (120 r.p.m) durante 2 ó 3 minutos.
6. Observar la aglutinación con ayuda de una lámpara.
Método de aglutinación en tubo.
1. Numerar siete tubos (13x75mm) del uno al seis y un testigo (T) para cada antígeno.
2. Adicionar 0.9 ml de solución salina al primero y 0.5 ml a los restantates.
3. Agregar 0.1ml del suero problema al tubo uno. Mezclar y pasar 0.5ml al tubo dos y así
sucesivamente hasta el seis eliminando 0.5ml de esta última dilución. Obteniéndose
diluciones 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320.
4. Adicionar 0.3ml de antígeno diluido previamente 1:20 con solución salina en cada uno
de los tubos.
5. Agitar enérgicamente e incubar en baño maría en las siguientes condiciones.
Antígeno/tiempo Temperatura.
Salmonella “B” 18 a 24hrs. 48 a 50°C
Salmonella “H” 2hrs. 37°C

Paratíficos “A” y “B” 2hor. 48 a 50°C
Brucella 48 hrs. 37°C
Proteus 0X-19 18hrs. 37°C
6. Tomar dos o tres tubos a la vez, agitarlos ligeramente frente una fuente de luz que
ilumine las partículas claramente.
1
Sumario:
- Técnicas de aglutinación por otros métodos.

- Prácticas Demostrativas:
- Inmunofluorescencia Directa (IFD).
- Ensayo Inmunoenzimático (ELISA).
Objetivos:
- Explicar los fundamentos generales de las pruebas.

- Interpretar las técnicas de de IFD y ELISA.
ANTIESTREPTOLISINA O5.
Procedimientos:
En esta ocasión no se procederá a titular anticuerpos (TASO), se quiere que Ud. explique e
interprete la prueba cualitativa, ya que el límite en la sensibilidad está dado por la
concentración de estreptolisina O (antígeno) que es de 250 unidades internacionales / ml o
también reportadas como Unidades Tood.
Reactivos:
Reactivo A: Suspensión de partículas de látex poliestireno recubiertas con estreptolisina O.
Control Positivo: Suero humano conteniendo antiestreptolisina O en concentración superior a
250 UI/ml.
Control Negativo: Suero humano no reactivo con el Reactivo A.
Se procederá de la misma forma y con las mismas precauciones que utilizó para la prueba de
Proteína C Reactiva mediante aglutinación en látex.
Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. Agitar el Reactivo A antes de usar,
vaciando previamente la pipeta del gotero.
En uno de los sectores delimitados de la placa de vidrio adjunta al equipo colocar:
- Reactivo A 1 gota (50 ul)
- Muestra 1 gota (50 ul)
- Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una
suspensión uniforme en la superficie delimitada de la placa.
- Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y
observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos.
5
Antiestreptolisina O, Diagnostic Procedures Manual, 21 th Ed., 2010.
PRÁCTICA N°5
ANTIBIOGRAMA EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA. IMPORTANCIA

MÉTODOS CUANTITATIVOS Y CUALITATIVOS
Sumario:
- Concepto de antibiograma.
1
- Importancia y utilidad clínica.
- Metodología cualitativa y cuantitativa.
- Lectura interpretada del antibiograma por el método de Kirby Bauer.
Objetivos:
- Reconocer un antibiograma.
- Realizar la lectura interpretada del antibiograma.
- Comprender la importancia de una adecuada interpretación del antibiograma y su
utilidad clínica.
- Reconocer los conceptos de fenotipo de resistencia.
En la práctica médica se emplean una serie de antibióticos y antimicóticos para el tratamiento

de diversas enfermedades infecciosas. Las bacterias y aún los hongos han venido
desarrollando diferentes y variados mecanismos de resistencia frente a estos agentes
terapéuticos. Esto se convierte en un problema clínico pues dificulta la correcta evolución del
paciente y puede hacer fracasar el tratamiento. Es por ello que reviste importancia la lectura
interpretada del antibiograma, es decir, no solamente identificar si la bacteria o el hongo es
sensible o resistente a determinado antibiótico o antimicótico, sino que además se debe
relacionar estos patrones sobre todo los de resistencia para poder encontrar el fenotipo de
resistencia que nos dará una pista acerca de cómo escoger un mejor y más efectivo
tratamiento que mejorará y curará al paciente.
El antibiograma puede realizarse por metodologías cualitativas o cuantitativas. Las

metodologías cualitativas nos darán la información de acuerdo a tres categorías: sensible (S),
intermedio (I) y resistente (R ) y las metodologías cuantitativas nos dará la información de la
Concentración Mínima Inhibitoria (CIM) la cual es la menor cantidad de antibiótico capaz de
inhibir el crecimiento de las bacterias y hongos.
METODOLOGÍAS CUANTITATIVAS:
a. Método de dilución (en placa y en tubo).
b. Método epsilométrico: E-test.
METODOLOGÍAS CUALITATIVAS
a. Disco difusión o de Kirby Bauer.
MÉTODO DE DILUCIÓN EN TUBOS
MATERIALES A UTILIZAR:
- Solución de antibiótico que contenga 1000 UI o microgramos (ug).

- Tubos de 13 x 100 mm, estériles.
- Pipetas de 5 mL.
- Cepa bacteriana, que contenga aproximadamente 10 5 a 106 microorganismos por mL.
- Caldo de cultivo.
PROCEDIMIENTO
- Colocar 10 tubos estériles de 13x100 con tapa de algodón en una gradilla, numerados
del 1 al 10.
- Descongelar el antibiótico que contenga 1000 UI por mL y diluir en proporción 1:5 en
caldo estéril, para obtener una concentración de 200 ug/mL.
- Utilizando técnica aséptica, colocar con pipeta de 5 mL, 0,5 mL de caldo de cultivo
estéril en los tubos marcados de 2 al 10.
- Agregar 0,5 mL del antibiótico con 200 ug/mL a los tubos 1 y 2. Mezclar el contenido
del 2do tubo y trasvasar 0,5 mL al tubo 3, continuando hasta el 9. Retirar 0,5 mL del
tubo 9; el 10 no recibe antibiótico y sirve como control.
1
- Agregar a todos los tubos 0,5 mL de la cepa bacteriana estandarizada.
- Incubar a 37°C de 12 a 18 horas, para que el tubo control presente crecimiento
bacteriano.
Lectura e interpretación:
- La concentración de antibiótico va de 100 ug/mL a 0,3 ug/mL en orden decreciente a la

mitad.
- El último tubo que no presente turbidez, representa a la concentración inhibitoria
mínima (CIM) del antibiótico y se expresa en ug o UI por mL.
MÉTODO DE DISCO DIFUSIÓN ó KIRBY BAUER
MATERIALES A UTILIZAR:
- Placa Petri con agar Mueller-Hinton.

- Torundas estériles.
- Discos impregnados con diferentes antibióticos y quimioterápicos.
- Pinzas estériles.
- Tubos de prueba con 3 mL de caldo tripticasa soya sembrado con cepa bacteriana, con
una turbidez comparable a 0.5 de la escala de McFarland (150 6 gérmenes/mL).
PROCEDIMIENTO
- Sumergir la torunda en el caldo tripticasa soya con la cepa bacteriana, escurrir en las
paredes del tubo y extender de manera uniforme en la superficie de la placa Petri con
agar Mueller Hinton.
- Colocar con ayuda de pinzas los discos impregnados con diferentes antibióticos sobre
la superficie del agar.
- Los discos deben quedar a una distancia no menor de 30 mm entre ellos.
- Incubar a 37°C por 18 a 20 horas.
Lectura e interpretación:
- El diámetro de la zona de inhibición se mide con una regla milimetrada, colocada

debajo de la placa Petri.
- El límite del área de inhibición está dado por la inhibición completa del desarrollo tal
como se puede apreciar a simple vista.
- Los milímetros de la lectura (halos de inhibición) son comparados con una tabla para
traducir su interpretación a los términos: susceptible (S), intermedio (I) y resistente (R ).
PRÁCTICA N°6
ROL DEL LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO PRESUNTIVO Y

CONFIRMATIVO DE LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS (1) Y DE LAS CAVIDADES
OROFARÍNGEAS, OJO Y OÍDO.
Sumario:
1
- Muestras respiratorias.
- Práctica Demostrativa: Toma de muestras y cultivo para bacterias comunes, exigentes
y anaerobias. Conteo semicuantitativo de células en secreciones respiratorias.
Aislamientos bacterianos micóticos.
- Experimentos: Coloración de Gram en muestra de esputo. Medición de la actividad
antibacteriana in vitro por el método de referencia del disco de antibiótico y difusión en
agar (1) en cepa de Staphylococcus aureus aislada de amigdalitis aguda.
Objetivos:
- Saber los tipos de muestras de acuerdo a las necesidades de indicación por

infecciones respiratorias y tipo de pacientes.
- Explicar e interpretar la técnica de conteo semicuantitativo de células de secreciones
respiratorias para saber la calidad de la muestra y determinar si procede el cultivo.
- Observar láminas con resultados diagnósticos de hongos causantes de infecciones
respiratorias.
- Explicar y saber hacer la coloración de Gram.
- Explicar e interpretar la prueba de difusión en agar de referencia para medir la
sensibilidad de los antibióticos in vitro con resultados de sensibilidad aceptable y para
una cepa de Staphylococcus aureus meticillino resistente (MRSA).
EXPERIMENTO:
COLORACIÓN DE GRAM EN UNA MUESTRA DE ESPUTO6.
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA 7 DE CEPAS DE Stahylococcus aureus

PROVENIENTES DE MUESTRAS DE PUNCIÓN AMIGDALAR (AMIGDALITIS AGUDA)
SENSIBLES A ANTIBIÓTICOS Y MRSA.
Planteamiento:
1. En cada mesa de trabajo se distribuirán las placas con las colonias de interés que
señale el profesor. Ud. realizará la coloración de Gram de una colonia. Esta actividad le
llevará unos minutos, mientras se seca la lámina portaobjetos,…para observar los
resultados al microscopio y determinar la morfología y los efectos de la coloración de
gran ayuda al diagnóstico presuntivo de estafilicocos,…, haga el dibujo de la
observación que realice, consulte las de sus compañeros. Compare con la coloración
que enseña el profesor en el microscopio central. (El procedimiento específico se
detalla debajo)
6
Garrido F I, Cornejo C M y Salinas J E,“Manual de colorantes para laboratorios de Ciencias biológicas” UNAM
México, 2003.
3 Instituto Nacional de Salud. Manual de Procedimientos para la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana por el
7
2. Inoculará una alícuota del cultivo de la bacteria (cuya población es causante de una
infección en el paciente), previamente estandarizada, en un medio de cultivo especial,
pondrá unos discos de papel conteniendo antibióticos. Esa placa de Petri ya sembrada
y con los discos puestos la llevará a la incubadora de 35°C, que se encuentra apta para
ese uso en el Laboratorio, al día siguiente leerá e interpretará los resultados. Compare
su placa antes de llevarla a la incubadora con las del profesor en la meseta central. (El
procedimiento específico se detalla debajo)
1
Procedimientos técnicos específicos:
Coloración de Gram.
1. Del cultivo joven de bacterias procedente de una muestra de esputo, tomar el inóculo
con el asa de siembra, siguiendo las indicaciones del profesor. Extender sobre la
lámina conforme se indica en las recomendaciones generales. Flamear nuevamente el
asa hasta quedar estéril y colocar en la gradilla.
2. Fijar la preparación a la llama del mechero por pasadas ligeras. Se controla sobre el
dorso de la mano. Si el calentamiento es moderado, no habrá calcinación.
3. Cubrir con la solución Cristal Violeta por 1 minuto.
4. Escurrir el exceso de colorante.
5. Cubrir la preparación con Lugol, por 1 minuto.
6. Diferenciar con alcohol acetona hasta que éste no arrastre colorante. Es mejor regular
la acción del alcohol con movimientos de balanceo con la preparación antes de ser
descartado.
7. Lavar con agua corriente.
8. Contrastar con el colorante Safranina, por 30 segundos a 1 minuto.
9. Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para evitar precipitados.
10. Secar al ambiente.
11. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de inmersión.
Procedimientos técnicos específicos:
Actividad Antibacteriana in vitro (1).
- Cultivos jóvenes de cepas de referencia y cepas problema.

- Placas de agar Muller-Hinton.
- Discos de antibióticos de amplia gama.
- Pipetas graduadas de 1 ml.
- Hisopos estériles.
- Dispensador de discos o en su defecto, plantilla, pinzas de punta fina, alcohol.
- Escala de Mc Farland
Una vez que se han aislado colonias de un organismo que ha sido identificado como patógeno
potencial, es necesario proceder de la siguiente manera para realizar la prueba de
susceptibilidad.
Previamente el profesor y el asistente han seleccionado las colonias: Primero, selecciona
varias colonias del organismo que está analizando. Si selecciona entre 3–5 colonias, en vez de
solo una, sus chances de detectar resistencia son mayores.
Prepara una suspensión del inóculo: la turbidez de la suspensión debe ser estandarizada (para
que sea igual) al estándar 0,5 de McFarland (lo que corresponde a aproximadamente 1,5 X 10
8 ufc/ml). Las suspensiones así ajustadas deben utilizarse como inóculo dentro de los 15
minutos siguientes, considerándose estandarizadas.
1. Inocular la placa: Empezando en la parte superior de la placa de agar Muller-Hinton, donde

está por la parte externa escritas las referencias necesarias, inocule la superficie con el
hisopo. Cubra toda la placa frotando de ida y vuelta de un borde al otro. Rote la placa
aproximadamente 60º y repita el procedimiento de frotado. Rote otra vez la placa 60º y frote
toda la placa por tercera vez. Esto garantizará que el inóculo sea distribuido
homogéneamente.
2. Colocar discos de antimicrobiano: Coloque los discos con los agentes antimicrobianos
dentro de los 15 minutos siguientes a la inoculación de la placa de Agar Muller-Hinton.
3. Incubar la placa: Invierta las placas e incúbelas de inmediato. Para las bacterias no
fastidiosas o exigentes (correspondientes a esta práctica), incube a 35°C por 16–18 horas.
1
Sumario:
- Bacterias, hongos y virus en infecciones respiratorias.

- Práctica Demostrativa: Identificación de Pseudomonas aeruginosa de otitis externa,
Klebsiella pneumoniae de neumonía y Aspergillus spp. de sinusitis, entre otros posibles
hallazgos. Interpretación de los resultados de acuerdo a los casos.
- Experimento: Medición de la actividad antibacteriana in vitro por el método de
1
referencia del disco de antibiótico y difusión en agar (2)
Objetivos:
- Reconocer a través de resultados etiológicos expresados en medios visuales o

audiovisuales, las bacterias, hongos y virus más frecuentes o importantes en las
infecciones del sistema respiratorio.
- Identificar agentes etiológicos diferentes y frecuentes como causa de otitis, neumonía
y e infecciones y alergias sinusales y bronquiales.
- Explicar e interpretar los hallazgos experimentales de acuerdo a los casos clínicos que
se exponen.
1. Identificación de una cepa de Pseudomonas aeruginosa, aislada de secreciones de

un paciente con otitis externa.
2. Identificación de una cepa de Klebsiella pneumoniae, aislada de una paciente con
neumonía.
3. Identificación de una cepa de Aspergillus spp., aislada de un paciente con sinusitis
y Aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA).
4. Interpretación de los resultados de acuerdo a los casos.
METODOLOGIA
a. Uno de los medios utilizados fue el agar Mac Conkey, donde a las 18 horas se observó
crecimiento de colonias y olor afrutado, el olor afrutado se sintió en otros medios de
cultivo sembrados , así como coloración azul- verdosa en agar tripticasa soya.
b. Se realizó coloración de Gram y prueba de oxidasa a partir de una colonia
característica, resultando bacilos Gram negativos y oxidasa positiva.
c. Se hizo un subcultivo en un medio selectivo para Pseudomonas como es: Agar azida
de Sodio con Cetrimide (AAZS-CTAB) y se incubó a 42°C. Se inocularon tubos de TSI,
Oxidación-Fermentación con y sin aceite mineral en la superficie, Lisina, Arginina,
Ornitina.
d. Observe los resultados obtenidos en el paso (c)
Observe cuáles resultados de Laboratorio permitieron confirmar el agente etiológico si dispone

Ud. de los resultados de las siguientes pruebas:
- Gram: Bacilos gramnegativos con cápsula grande.

- Prueba de Oxidasa: Negativa
- Colonias: medianas de bordes ondulados, de superficie convexa y lisa, aspecto mate y
opaco, de consistencia mucoide y cromogénesis morada-rojiza en agar Mac Conkey.
- Batería bioquímica:
- TSI: +/+. Gas + SH2 -
- Motilidad: -
- Indol: -
- Lisina: +
- Citrato: +
- Urea: +
- Fenilalanina: -
- Arginina: -
- Ornitina: -
- Antibiograma: Sensibilidad: Cloranfenicol. Resistencia a todos los demás discos con
antibióticos empleados.
1
EXPERIMENTO:
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA in vitro (2)
Procedimientos (Continuación)
1. Retire la placa de Petri de la incubadora:

2. Examine detenidamente la placa para verificar que el crecimiento sea uniforme y
confluente de tal modo que pueda identificar zonas sin crecimiento bacteriano.
3. Para medir las zonas de inhibición desde la parte posterior de la placa usando luz
reflejada:
a. Sostenga la placa unos pocos centímetros sobre una superficie de color negro
que no refleje la luz.
b. Mida el diámetro del halo de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de
cada disco de antibiótico específico por debajo de la placa (se mantiene
cerrada), incluyendo el propio disco en la medición y redondeando al milímetro
más cercano con una regla milimetrada o un calibrador Vernier o nonio o pie de
rey.
4. Comparar los resultados de la medición en cada disco versus la cepa bacteriana,
con los ofrecidos como estándares de sensibilidad, resistencia y sensibilidad
Intermedia del cuadro de referencia.
5. Interpretar los resultados con la ayuda del profesor.
6. Algunas zonas podrían ser difíciles de medir.
7. Si hay doble zona: Mida la zona más interna.
8. Colonias dentro de la zona: Esto puede deberse ya sea a un cultivo mixto, que por lo
general es obvio, o a una subpoblación resistente de la bacteria analizada. Repita la
prueba con una sola colonia o subcultivo de una sola colonia de la placa del cultivo
primario.
9. Cómo Interpretar la Zona de Inhibición con Bordes Difusos: Mida el punto en el cual se
puede ver una demarcación obvia entre crecimiento y ausencia de crecimiento.
PRÁCTICA N°7
ROL DEL LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO PRESUNTIVO Y

CONFIRMATIVO DE LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS BAJAS (2).
Sumario:
- Prácticas Demostrativas:
- Identificación de cepas bacterianas adquiridas en el hospital, multiresistentes y beta
1
lactamasa de espectro extendido (BLEE).
- Diagnóstico etiológico presuntivo de Tuberculosis Pulmonar.
- Experimento: Coloración de Ziehl-Neelsen.
Objetivos:
- Valorar el significado de la multiresistencia a los antibióticos in vitro y la presencia de la

enzima beta lactamasa de expectro extendido en cepas bacterianas causantes de
infección.
- Explicar y valorar el valor predictivo positivo del diagnóstico presuntivo de Tuberculosis
Pulmonar en el país.
Desarrollo:
Procedimientos:
Test confirmatorio BLEE.

Método del doble disco de Jarlier (Comité de la Sociedad Francesa de Microbiología).
1. Las placas de agar Mueller Hinton se inoculan con las cepas bacterianas puras, con
una turbidez equivalente al tubo Nº 0,5 de la escala de Mc Farland.
2. Se coloca un disco de amoxicilina/ácido clavulánico (AMC) (20/10 μg) en el centro de
una placa de Petri con agar Mueller Hinton y alrededor, a 25 mm de distancia, discos
de Ceftazidima - CAZ (30 μg/ dL), Cefepime - FEP (30 μg), Aztreonam - AZT (30 μg) y
Ceftriazona - CRO (30 μg).
3. La presencia de BLEE se manifiesta por el efecto sinérgico del inhibidor y los discos
(efecto de huevo, cola de pez o balón de futbol americano).
PRÁCTICA DEMOSTRATIVA
DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO PRESUNTIVO DE TUBERCULOSIS PULMONAR 8
1. Muestra: Esputo o secreciones respiratorias (Ídem práctica para saber la calidad de la

muestra para cultivo). Como la eliminación de los bacilos por el esputo no es constante,
es conveniente analizar más de una muestra de cada paciente sintomático respiratorio
(SR) para el diagnóstico de la tuberculosis. La primera muestra puede detectar
aproximadamente el 80% de los casos positivos, la segunda agrega un 15% y la
tercera un 5% más.
2. Examen directo de esputo: Para la realización del frotis se debe seleccionar la partícula
útil de la muestra, constituida por la parte más densa o purulenta. Si hay varias
8
OPS. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la Tuberculosis, Parte I, Baciloscopía, 2008.
Disponible en: www.paho.org/Spanish/AD/DPC/CD/tb-labs-baciloscopia.pdf
porciones purulentas, se deben mezclar cuidadosamente con los aplicadores y tomar

una porción de la mezcla. En caso de observarse solo pequeñas partículas purulentas,
escoger tres o más de ellas y mezclarlas en el mismo portaobjeto para
homogeneizarlas. Coloración Ziehl-Neelsen.
3. Conteo de bacilos por campo (Baciloscopía). Para que la baciloscopía sea positiva es
preciso que la muestra tenga como mínimo, entre 5.000 y 10.000 bacilos por mililitro de
muestra.
1
EXPERIMENTO9:
COLORACIÓN DE ZIEHL - NEELSEN
Procedimientos:
1. Se prepara la superficie de trabajo y se manipulan las muestras e indicaciones
(ordenes de papel), con todas las medidas de bioseguridad para esta clase de
microorganismo.
2. Colocar la(s) partícula(s) seleccionada(s) sobre el portaobjetos y extenderla (s) con el

aplicador con movimientos suaves, circulares, tratando de dispersarla en forma
homogénea en el centro de la lámina, dibujando un círculo u óvalo de 2 cm de largo por
1 a 2 cm de ancho, sin llegar a los bordes de la lámina para evitar que el operador se
contamine al manipularla.
3. Verificar que el extendido tenga grosor homogéneo y adecuado. Si es demasiado fino,

es posible producir un resultado falso negativo. Si es muy grueso, el material puede
desprenderse durante la coloración o puede resultar difícil la visualización de bacilos
debajo de una capa gruesa de mucus. Se puede adquirir entrenamiento poniendo un
papel impreso debajo del extendido. El grosor adecuado es el que permite ver pero no
leer un texto impreso a través del preparado. Una vez adquirido el entrenamiento, es
preferible no repetir rutinariamente este proceso para evitar tocar y transferir muestras
con los papeles impresos.
4. Dejar el extendido en un soporte ubicado al costado de la mesa para que se seque a

temperatura ambiente. El extendido no debe ser calentado a la llama mientras esté
húmedo pues el calor fuerte altera la estructura de los bacilos y su posterior tinción;
además puede generar aerosoles.
5. Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solución de hipoclorito de sodio

al 1%; este frasco irá al autoclave o directamente a incineración.
6. Cerrar el envase de la muestra con la que se realizó el extendido y dejarlo en el lado

opuesto al lugar donde están los frascos con las muestras que aún no se han
procesado, para evitar confusiones.
7. Continuar de la misma manera con cada una de las muestras siguientes. Conservar las
muestras hasta terminar las lecturas de la baciloscopía y verificar que no es necesario
realizar nuevos extendidos o enviarlas para cultivo.
8. Limpiar la superficie de trabajo con una toalla de papel o algodón empapado en

hipoclorito de sodio al 1% para desinfectarla.
9. Descartar los guantes desechables, junto con las muestras en el recipiente destinado a
este fin. Si se trata de guantes de uso doméstico, sumergir las manos enguantadas en
solución de hipoclorito de sodio 1% antes de quitárselos.
9
Ídem
10. Esperar a que las láminas se hayan secado al aire.
11. Tomar de a uno cada extendido con una pinza manteniendo la cara que contiene la
muestra hacia arriba, y pasarlos rápidamente sobre la llama de un mechero tres o
cuatro veces cuidando que no se caliente demasiado (fijar el extendido).
12. Colocar cada lámina fijada en un soporte, puede ser el soporte que se va a utilizar para
la coloración. Los extendidos deben ser coloreados de inmediato, ya que algunos
bacilos pueden permanecer vivos después de fijados con calor hasta que incorporan la
1
fucsina.
13. Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente
5 cm entre una y otra una sobre un soporte dentro del lavabo de coloración.
14. Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el
número de baciloscopías a colorear es pequeño, se puede filtrar la fucsina
directamente cuando se la deposita sobre el extendido a través de un pequeño embudo
con papel de filtro.
15. Colocar sobre el soporte las láminas fijadas conservando el orden numérico con el
extendido hacia arriba y manteniendo una separación de al menos 1 cm entre ellas.
16. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada.
Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el
embudo los extendidos.
17. Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los
extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los
primeros vapores blancos. No calentar con mechero.
18. En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.
19. En el término de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisión de
vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y
se fije a sus lípidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede
destruirse y colorearse mal.
20. Con una pinza, levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más
cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o un
grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la
solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior.
21. Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos
que se utilizarán a continuación.
22. Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante de alcohol 70 % - ácido
clorhídrico 35% y dejar actuar aproximadamente 3 minutos.
23. Enjuagar con abundante agua a baja presión.
24. Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a lo
sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cúmulos rojos o coloración
rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante, dejarla actuar entre uno y tres
minutos y enjuagar nuevamente.
25. Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos.
26. Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno y dejar actuar durante un
minuto.
27. Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión y limpiar la parte inferior
con un algodón si ha quedado coloreada.
28. Observar si las láminas conservan la numeración clara y visible. Si no es así volver a
numerarlas.
29. Dejar secar las láminas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en
un soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido.
30. Ubicar cerca del microscopio todos los elementos necesarios: aceite de inmersión,
1
pañuelos o trozos de papel suave, el Registro del Laboratorio, un lapicero, una caja
para guardar portaobjetos, un frasco con etanol a 70%.
31. Depositar una gota de aceite de inmersión (aceite de cedro) en un extremo del frotis,
sin tocar el preparado con el gotero.
32. Enfocar el extendido donde ha colocado la gota de aceite, con la lente 100x de
inmersión.
33. Observar cada campo microscópico en superficie y profundidad, moviendo

permanentemente el tornillo micrométrico, antes de desplazarse al campo contiguo.
34. Seguir un recorrido en líneas rectas, sistemático para recorrer el extendido evitando
repetir la lectura de algunos campos. Ej: de izquierda a derecha.
35. Observar la calidad del extendido y de la coloración. Si no fuesen buenas, repetir

nuevamente la baciloscopía de esa muestra.
36. Contar el número de campos que ha leído y el número de BAAR que ha identificado.
Se puede utilizar una cuadrícula de 10 cuadrados por 10 cuadrados, que representan
los 100 campos microscópicos, como ayuda para registrar la cuenta. En cada cuadrado
anotar el número de BAAR que se observa. Si no observa BAAR consignar 0.
37. Para calcular el promedio de BAAR encontrados por campo, sumar el total de BAAR
contados y dividir ese total por el número de campos observados.
38. Cuando los bacilos se presentan agrupados, una estimación aproximada del número
de bacilos presentes en el cúmulo es suficiente para calcular este promedio.
39. Los campos leídos deben ser “campos microscópicos útiles”. Se considera campo
microscópico útil a aquel en el cual se observan células bronquiales (leucocitos, células
ciliadas) o fibras mucosas, que aparecen teñidos de azul. Los campos sin estos
elementos no deben ser considerados para contar el total de campos observados, a
menos que contengan BAAR.
40. El extendido preparado tal como fue descrito permite observar 100 campos
microscópicos en línea recta. Puede ser necesario leer una segunda línea para
encontrar los 100 campos útiles.
41. Un microscopista experimentado completa la lectura de 100 campos en

aproximadamente cinco minutos.
42. Al finalizar la lectura, girar el revólver de los objetivos y retirar el portaobjetos de la

platina. Comprobar el número de identificación y registrar el resultado.
43. Antes de examinar el portaobjetos siguiente, limpiar suavemente la lente de inmersión

con un trozo de pañuelo de papel absorbente. Esto evita la transferencia de material al
siguiente frotis que se va a leer.
Sumario:
- Práctica Demostrativa: Diagnóstico etiológico confirmativo de Tuberculosis Pulmonar.

- Alcances de pruebas para determinar multidrogorresistencia.
Objetivos:
- Explicar, interpretar y valorar la importancia del diagnóstico etiológico confirmativo de la

1
Tuberculosis Pulmonar.
- Conocer y explicar las diferentes pruebas para determinar multidrogoresistencia.
DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO CONFIRMATIVO DE TUBERCULOSIS PULMONAR 10.
Procedimientos:
1. Procesar las muestras con la menor demora posible. Lo ideal es procesar las
muestras de contenido gástrico y las extrapulmonares dentro de las cuatro horas
siguientes a la recolección. Para lograrlo es necesario establecer una organización
conjunta entre el personal del laboratorio y el equipo médico que toma las muestras.
2. Preservar las muestras de la luz solar, desecación y el calor. Mantenerlas

refrigeradas a 4º C hasta el momento de su procesamiento si inevitablemente debe
transcurrir más de 24 horas desde la recolección hasta la siembra.
3. Cuando la muestra de esputo debe ser transportada y queda inevitablemente expuesta

a temperatura ambiente durante más de 48 horas después de recolectada, agregar
igual volumen de cloruro o bromuro de cetilpiridinio 1% disuelto en una solución de
cloruro de sodio al 2%. Estos reactivos homogeneízan el mucus y restos orgánicos y
decontaminan la muestra durante el transporte. En este caso, la muestra no debe ser
refrigerada porque estos decontaminantes cristalizan a baja temperatura y una vez
cristalizados, no protegen e inhiben el desarrollo del bacilo de la tuberculosis. Se ha
descrito que estas soluciones pueden inhibir el desarrollo del bacilo en medios líquidos
y por eso se ha recomendado no utilizarlos cuando se emplean estos caldos.
4. Nunca agregar a las muestras fenol, formol o solución de formaldehido. Algunos

anestésicos tienen actividad antimicrobiana y por lo tanto también deben ser evitados.
Esto puede ser desconocido por el equipo médico que toma biopsias y sigue
procedimientos indicados para estudios histopatológicos, inadecuados para el cultivo
de micobacterias y también de otros microorganismos.
5. Para eliminar el bromuro o cloruro de cetilpiridinio de las muestras transportadas con

estos conservantes:
- ml de esputo tratada
+
- X ml de buffer fosfato pH 6,8
- Ajustar las tapas de los tubos
- Agitar en vortex
- Centrifugar 15 minutos a 3000 g a 25 - 35°C
- Dejar reposar 5 minutos
- Descartar el sobrenadante
10
OPS. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la Tuberculosis, Parte II, Cultivo, 2008.
Disponible en: http://www.paho.org/Spanish/AD/DPC/CD/tb-labs-cultivo.pdf
- Resuspender el sedimento en buffer

- Distribuir en cada medio de cultivo
- Y preparar el frotis con la última gota
6. Digestión, decontaminación y concentración de la muestra e

7. Inocular en varios tubos con medios de cultivo especiales:
- X ml de esputo
+
1
- X ml de NaOH 4%
- Ajustar las tapas de los tubos,
- Agitar en vortex
- Dejar actuar 5 minutos
- En los siguientes 5 minutos acomodar los tubos en la centrifuga
- Controlar que el tiempo total de contacto con el NaOH 4 % no sobrepase los 30
minutos
- Agregar 15 ml de buffer fosfato pH 6,8
- Ajustar las tapas de los tubos
- Agitar en vortex
- Resuspender el sedimento en buffer
- Distribuir en medio de cultivo (especial con huevo y verde de malaquita más
antibióticos, con carbono radioactivo, sintéticos especiales de la serie Middlebrook y
sistema de lectura automatizada)
- Preparar el frotis con la última gota
8. Incubación de los tubos a 36° C. Mantener los tubos en incubación hasta las 8
semanas en el caso de medios a base de huevos, y hasta las 6 semanas en el caso de
medios con agar o caldos hasta que se detecte desarrollo.
9. Lectura y conteo de colonias características: Crecimiento eugónico (como migas de

pan)
PRÁCTICA N°8
ROL DEL LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES DEL SISTEMA

GASTROINTESTINAL.
Sumario:
- Diagnóstico etiológico presuntivo y confirmativo de infecciones gastrointestinales de

origen bacteriano y viral.
- Gastroenteritis aguda.
1
- Diarreas crónicas.
- Coprocultivo.
- Experimento: Identificación y determinación de sensibilidad a los antibacterianos in
vitro de Shigella.
Objetivos:
- Algoritmos diagnósticos de Laboratorio para infecciones o intoxicaciones

gastrointestinales altas y bajas e hígado.
- Indicaciones de coprocultivo.
- Explicar e interpretar el diagnóstico etiológico bacteriano y viral de diarreas agudas y
crónicas.
Coprocultivo11.
Fase Pre - analítica:
1. Las muestras para coprocultivo, deberán tomarse antes de la administración de

antimicrobianos o agentes antidiarréicos. Indicar siempre el juicio díagnóstico de
presunción y si el paciente es menor de un año o inmunodeprimido. Solicitar las
investigaciones especiales explícitamente (C. difficile, C. perfringens, S.aureus, etc.).
2. Volumen mínimo: Heces formadas o pastosas: al menos 1 ó 2 gr. para virología, añadir
de 2 a 4 gr. más. Muestras del tamaño de una nuez son muy adecuadas pues permiten
realizar la mayoría de las investigaciones posibles. Heces líquidas: entre 5 y 10 ml.
Para coprocultivo son especialmente interesantes las partes con moco y/o sangre.
3. Toma de la muestra: Recipiente de boca ancha para recoger las heces durante la
defecación. No es necesario que esté estéril, sólo es preciso que esté limpio. No
contendrá restos de jabones, detergentes, desinfectantes o iones metálicos ni se
mezclarán con orina. Inmediatamente pasarlas con espátula estéril a frasco estéril.
4. Transporte de la muestra: Recipiente estéril de boca ancha y cierre hermético para
enviar la muestra para procesar en 1 a 2 horas. Puede ser válido el empleado para
recoger orinas, aunque es preferible utilizar un recipiente que tenga espátula para
tomar la muestra de las heces. En caso contrario se remite en un sistema de transporte
para bacterias (CaryBlair o modificaciones o solución de glicerol tamponado). En
ambos casos se mantiene en refrigeración hasta el procesamiento, para evitar el sobre
crecimiento de la flora normal que puede enmascarar o destruir a los enteropatógenos.
El frío puede afectar la viabilidad de Shigella spp.
5. Si con la primera muestra no se detecta la presencia de enteropatógenos, es necesario

enviar en los días siguientes, dos tomas adicionales.
6. Muestras inadecuadas: Muestras fecales provenientes de frascos no estériles o
manipulados para diagnóstico parasitológico previamente. Heces emitidas anteriores a
dos horas y que no hayan sido refrigeradas. Las tres tomas realizadas el mismo día.
Fase Analítica:
11
Ídem.
Se procede de acuerdo a la sospecha diagnóstica Para todos los casos, antes de cultivar:
7. Observar la consistencia, el color, la presencia de sangre, pus moco y restos

alimentarios sin digerir. Distinguir las características del olor.
8. Reacción inflamatoria en fresco y mediante coloraciones (Gram y/o otras).
9. Cultivo selectivo y de enriquecimiento: Caldo de Tetrationato de Sodio: Inocular con asa
estéril y atemperada, una alícuota en un tubo conteniendo este medio de cultivo.
10. Cultivos en general: Placas de Petri en de agar- sangre, agar Mac Conkey, agar
Salmonella - Shigella, agar TCBS y otros.
1
11. Inocular con hisopo estéril en el 1/8 perímetro de la superficie del medio de cultivo de
las placas de Petri, directamente de la muestra.
12. Estriar en todos los casos en varios cuadrantes con el objetivo de obtener colonias
aisladas.
13. Incubación: Incubar las placas y los tubos a 35°C x 18 - 24 horas.
14. Inocular una alícuota del medio líquido en los medios sólidos e incubar ídem.
15. Aislamiento de colonias sospechosas: A las 24 horas de la siembra directa de la
muestra y 24 horas más la procedente del caldo. En el agar sangre pudiera observarse
colonias de la flora normal aerobia que tendría valor predictivo si fuera abundante. En
los demás medios selectivos y de enriquecimiento se escogerían las colonias
características de acuerdo al medio en el que crezcan, en sentido general, aquellas
colonias no fermentadoras de la lactosa.
16. Identificación por pruebas fisiológicas y bioquímicas.
17. Identificación por pruebas inmunológicas con antisueros comerciales cuando sea
necesario (Shigela, Salmonella, cepas específicas de Escherichia coli y otras)
18. Prueba de sensibilidad por el método del disco y de difusión en agar.

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UNIVERSIDAD CIENTÍFICA DEL SUR

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

FACULTAD MEDICINA HUMANA

Una recomendación al respecto de esta Guía quisiéramos los profesores hacerles a

SEGURIDAD Y BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA.

1. Introducción a la Seguridad y Bioseguridad.

Objetivo: Incorporar las buenas prácticas de desempeño para prevenir accidentes y

2. Materiales y equipos principales del Laboratorio.

1. Reconocimiento de las principales Barreras de Protección y material usado en las

Introducción al uso del Laboratorio de Bacteriología.

1. Microscopía en fresco y/o con coloraciones de acuerdo a la impresión diagnóstica de

3. Cultivo en medios adecuados a la impresión diagnóstica o al diagnóstico presuntivo de

1.- COLORACIÓN GRAM1

Medición de la actividad antimicrobiana in vitro.

1. Cultivos jóvenes de cepas de referencia y cepas problema.

1. Inocular la placa: Empezando en la parte superior de la placa de agar Muller-Hinton, donde

DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO DE LAS MICOSIS Y DE LAS INFECCIONES VIRALES.

FASE PRE - ANALÍTICA

5. Recepción de la Indicación y la muestra en las condiciones exigidas.

7. Microscopía en fresco y/o con coloraciones de acuerdo a la impresión diagnóstica de

9. Cultivo en medios adecuados a la impresión diagnóstica o al diagnóstico presuntivo de

Proceso de Identificación a partir del cultivo

10. Aislamiento de colonias características.

14. Prueba de sensibilidad y resistencia de la cepa aislada y/o identificada a los

- Observen la morfología macroscópica y microscópica de los aislamientos y los resultados de

3. Dejar secar aproximadamente 15 min si fuera necesario, ya que debe estar

5. Se incuba a 35°C por 24 horas.

CASOS. (A través de sesión de láminas)

1. Realizar la lectura después del periodo de incubación recomendado solamente si se

- No realizar la lectura si el cultivo tuviera algún contaminante, si el crecimiento es muy

Generalidades del método por E-test.

Diagnóstico de bacteriológico por técnicas de avanzada. Reacción en cadena de la

Recolección de las bacterias

 Centrifugar a temperatura ambiente, durante 3 min a 12.000 g. Retirar el sobrenadante

Aislamiento de los plásmidos

Visualización del ADN plasmídico

1. Retire la placa de Petri de la incubadora:

FLUIDOS CORPORALES NORMALMENTE ESTÉRILES EN LA AYUDA AL DIAGNÓSTICO

- Indicaciones de muestras de sangre.

- Explicar la indicación y procedimientos generales de los hemocultivos cuando se

1. Toma de muestras (frecuentemente tomada por el médico en pacientes hospitalizados,

2. Recepcionar e incubar de acuerdo a las normas para bacterias y hongos.

Proteína C Reactiva por el método de aglutinación en látex de niveles cualitativos

- Indicaciones de Líquido Cefalorraquídeo (LCR).

- Se muestran láminas coloreadas con Gram y se explica el diagnóstico presuntivo.

Muestras de Líquidos Cefalorraquídeos procedentes de diferentes pacientes con meningitis

Para determinar la presencia o no de microorganismos:

3. Examen microscópico del sedimento en lámina con coloración fundamentalmente

Diagnóstico Confirmativo por métodos convencionales:

5. Cultivo en medios especiales de acuerdo al diagnóstico presuntivo (bacterias u

1. Una alícuota (3 gotas) del sedimento de LCR previamente centrifugado se extiende en

REACCIONES ANTÍGENO - ANTICUERPO.

- Fundamentos de las pruebas.

- Explicar los fundamentos generales de las reacciones antígeno-anticuerpo.

1. Anotar el antígeno correspondiente en la placa de vidrio.

3. A cada gota de suero añadir una gota de cada antígeno.

4. Mezclar con un aplicador limpio (utilizar un aplicador para cada antígeno.

5. Agitar suavemente la placa por rotación (120 r.p.m) durante 2 ó 3 minutos.

6. Observar la aglutinación con ayuda de una lámpara.

Método de aglutinación en tubo.

5. Agitar enérgicamente e incubar en baño maría en las siguientes condiciones.

Salmonella “B” 18 a 24hrs. 48 a 50°C

Salmonella “H” 2hrs. 37°C

Paratíficos “A” y “B” 2hor. 48 a 50°C