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3B-2
GUÍA DE PRÁCTICAS
Unidad académica:
Escuela Académico Profesional de Obstetricia
Nombre de la asignatura:
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Autor (es):
Mg. Marco Antonio Mesía Guevara
El laboratorio constituye el lugar trabajo, tanto para la enseñanza como para la investigación y es
preciso conocer los diferentes materiales, instrumentos, reactivos y equipos con los que cuenta.
El laboratorio de microbiología representa, a diferencia de otras ramas de la Biología, prerrequisito
imprescindible para su desarrollo como ciencia, inventos como: el microscopio, los medios de cultivo,
tinciones, pruebas y recuentos entre otros han sido pilares en el desarrollo de la microbiología, es por
esta razón que los estudiantes deben comprender los procedimientos básicos en la técnica del manejo
de los microorganismos para lograr un buen aprendizaje de la microbiología.
Es importante que al final de la práctica, los estudiantes comprendan el uso de los instrumentos y
equipos que se usan y la importancia de tener una manipulación adecuada del material. El concepto
de asepsia y de trabajo ordenado ayuda al desarrollo de la práctica.
El trabajo de laboratorio representa uno de los aspectos fundamentales que contribuye en la definición
de la vocación tecnológica y científica del ser humano y en especial de los jóvenes por estar en un
periodo de formación intelectual, ya que ello permite que la teoría sea comparada con la práctica.
Es tarea fundamental de los docentes motivar la participación activa de los estudiantes en el desarrollo
de prácticas de laboratorio y de campo, con el fin de que se mejoren sus habilidades y destrezas en
cuanto al manejo de materiales y reactivos, con lo cual están en posibilidades de lograr un cambio o
transformación del entorno en donde vive, así como la de su propia realidad.
Por esta razón, creí conveniente la elaboración de esta guía de prácticas, cuyo contenido tiene como
finalidad brindar al estudiante un material ordenado y de fácil acceso al trabajo de laboratorio en la
asignatura de microbiología.
La presente guía consta de trece experiencias, las cuales se desarrollaron en varias etapas
mediante la recopilación de prácticas. Cada práctica inicia con el título en la parte central, el cual
se seleccionó de acuerdo a la dosificación del programa por semana. La competencia hace
referencia al aspecto significativo que logran los alumnos al final del experimento. El
fundamento teórico de cada una de las prácticas, fue elaborado en base a diversas referencias
bibliográficas. En la parte experimental, el procedimiento fue desarrollado consultando diversos
manuales de Educación Superior. El cuestionario en el que el alumno demuestra su
aprovechamiento logrado al final de la secuencia de aprendizaje, se elaboró basado en el aspecto
introductorio y resultados experimentales que se esperan de cada práctica.
Finalmente, agradezco anticipadamente a sus lectores por hacerlos de su conocimiento.
1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas correctamente uniformado de blanco y llevando
consigo mandil blanco, gorro, mascarilla y guantes descartables. Además plumón indeleble
para escritura en vidrio y lápices de colores.
2. El alumno que incumpla el ítem anterior no podrá ingresar a sala de prácticas.
3. Está prohibido comer, beber y fumar en sala de prácticas.
4. Sobre la mesa de trabajo sólo colocará materiales, guía práctica y libreta de apuntes.
5. Antes y después de cada práctica el estudiante desinfectará la mesa de trabajo, para lo cual
deberá contar siempre con un frasco de alcohol yodado, algodón y gasa.
6. Finalizada la práctica el estudiante eliminará los materiales de desecho al depósito
correspondiente.
7. Las láminas preparadas deberán ser colocadas en una caja para su archivo.
8. Todas las placas y tubos con medios de cultivo ya usados serán colocadas en las canastillas
para su autoclavado y desecho.
9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en recipientes con boca ancha
conteniendo desinfectante.
10. Los cultivos a incubarse deberán rotularse con los siguientes datos:
a. Nombre o iniciales del estudiante.
b. Nombre del microorganismo, número de mesa, sección y fecha.
c. Las placas se colocarán en forma invertida, salvo indicación contraria del docente. d. Los
tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas.
e. Los alumnos son responsables de colocar los cultivos en las estufas a temperatura y tiempo
adecuados.
f. Los alumnos son responsables de la observación macroscópica tras la incubación.
11. Al finalizar la práctica, el estudiante se responsabiliza de:
a. Limpiar los objetivos y platina del microscopio con algodón y alcohol isopropílico.
b. Ubicar el objetivo de menor aumento frente al condensador y verificar que no queden láminas
sobre la platina.
c. Desinfectar la mesa de trabajo. d.
Cerrar la válvula de gas.
e. Lavarse las manos con jabón carbólico.
12. El protocolo será controlado por el docente al final de cada práctica.
Contaminantes biológicos
Mecanismos de transmisión de las enfermedades infecciosas: Son las formas como se transmiten los
agentes biológicos de un lugar a otro. Intervienen en ello: el hombre, los animales y el medio ambiente,
dependiendo del tipo de microorganismo
Vía respiratoria: a través de la inhalación. Las sustancias tóxicas que penetran por esta vía
normalmente se encuentran en el ambiente difundidas o en suspensión (gases, vapores o
aerosoles). Es la vía mayoritaria de penetración de sustancias tóxicas.
Vía dérmica: por contacto con la piel, en muchas ocasiones sin causar erupciones ni
alteraciones notables.
Vía digestiva: a través de la boca, esófago, estómago y los intestinos, generalmente cuando
existe el hábito de ingerir alimentos, bebidas o fumar en el puesto de trabajo.
Vía parenteral: por contacto con heridas que no han sido protegidas debidamente.
Cuando la sustancia tóxica pasa a la sangre, ésta la difunde por todo el organismo con una rapidez que
depende de la vía de entrada y de su incorporación a la sangre.
Cuando las condiciones de trabajo puedan ocasionar que se introduzcan en el cuerpo humano, los
contaminantes biológicos pueden provocar en el mismo un daño de forma inmediata o a largo plazo
generando una intoxicación aguda, o una enfermedad profesional al cabo de los años.
Las tres condiciones que deben cumplirse para favorecer la actividad de los contaminantes biológicos son
la presencia de nutrientes, humedad y temperatura.
Durante el trabajo diario de la sección de microbiología, se dan situaciones de potenciales riesgos que
varían según el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las Normas de Bioseguridad pretenden
reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso.
El trabajo en el laboratorio de microbiología es, como en la mayoría de las otras secciones del Laboratorio
Clínico, un trabajo de grupo. La actitud ante las prácticas seguras de cada uno de los integrantes del
equipo, determinan su propia seguridad, así como la de sus compañeros y la de la colectividad del
Laboratorio.
Por otra parte, el equipamiento y el diseño del Laboratorio de Microbiología es parte fundamental
en el esfuerzo de protección de los empleados en el ejercicio de sus labores; sin embargo, las
características especiales del trabajo en la sección de Microbiología, hacen imperante un Manual que
sirva de guía a los trabajadores de la salud y particularmente a los microbiólogos en su trabajo diario. La
formación es pues clave en la eficacia de los programas de seguridad y ésta debe ser facilitada a todas
las personas que están expuestas a los riesgos del laboratorio.
Un programa de seguridad gestionado por profesionales bien entrenados, con un alto grado de
participación por parte de los trabajadores, puede llevar no sólo a una disminución del número de
lesiones y enfermedades, sino también a un incremento de la satisfacción del trabajador y de su
productividad.
El propósito de la presente práctica es entre otras cosas describir la metodología a seguir en un programa
de Bioseguridad en microbiología, de tal manera que sea una guía para el trabajo seguro en el laboratorio
que envuelve microorganismos potencialmente peligrosos.
a. Un huésped susceptible b.
Un agente infeccioso
c. Una concentración suficiente de éste d.
Una ruta de transmisión apropiada.
Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier área del laboratorio:
El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera que, en caso de
caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras
transportables. Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y resistentes a los golpes, contar con
materiales absorbentes en su interior y de fácil desinfección. Se etiquetarán o identificarán de forma
oportuna y no podrán ser utilizadas para otros fines. Bajo ningún concepto se deben transportar las
muestras a mano.
La ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas, etc. debe estar
disponible en todo momento. La ropa protectora de las áreas con nivel de contención 3 (batas) nunca
debe ser usada fuera del área de trabajo y si se quita debe de ser desechada automáticamente en una
bolsa de material contaminado. Jamás debe volver a ser usada.
Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales
potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o
cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del
área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se cogerá el
teléfono, se tocarán las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc.
Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.
Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o
aerosoles.
Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculación y de generación de
aerosoles.
F-CV3-3B-2 Rev. 3 – Mar. 2013
Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al profesor. y hacerse constar
por escrito.
Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con material
adecuado y cada trabajador será instruido para manejarlo debidamente.
En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel
contaminado es de muy difícil esterilización.
No deberán usarse lentes de contacto.
El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos está formalmente prohibido en el área de trabajo del
laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida.
El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la
jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usará un jabón antiséptico
y el secado se realizará con papel.
Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, serán comunicados al
responsable de la Sección correspondiente, así como al profesor que lo registrará haciendo
constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y
después es imprescindible ponerse guantes.
Los agentes biológicos se clasifican en grupos, según su diferente índice de riesgo de infección. Para
protegerse de los agentes biológicos se utilizan sistemas de protección física para que imposibiliten el paso
del agente biológico patógeno al organismo humano.
Según sea la virulencia del agente biológico patógeno que se encuentre en el puesto de trabajo existen
varios niveles de contención que corresponden a los niveles de bioseguridad que se deben alcanzar en
locales e instalaciones en las que se trabaje con agentes biológicos de los diferentes grupos de riesgo
Pipetas. Gorro.
Baguetas. Guardapolvo.
Mechero.
1.4 PROCEDIMIENTO
Mycobacterium tuberculosis
Salmonella typhi
Entamoeba histolytica
Bacillus anthracis
N° REQUISITOS SI NO
01 Uso de mascarilla
02 Uso de mandil de manga larga
03 Uso de guantes
04 Se lava la mano después de las prácticas
05 Sólo coloca su guía de práctica sobre la mesa de trabajo
06 Está vacunado contra la hepatitis B, tétanos
07 El laboratorio cuenta con extinguidores
08 En la puerta del laboratorio debe haber una señal de
bioseguridad
09 Se trabaja en cubículo
10 Uso de gorro si tiene cabello largo
11 Uso de collares, anillo, brazaletes
12 Uso de zapato alto
13 Comer , fumar dentro del laboratorio
14 Coloca la mano en la nariz, boca ojos durante la práctica
15 El área de trabajo se desinfecta antes y después de la
práctica
1.5 CUESTIONARIO
2. ¿Cuántas veces deben ser usados los guantes luego de atender a una paciente?
3. ¿Qué desinfectante se utiliza con frecuencia en el laboratorio de microbiología?
4. ¿Qué método de esterilización se emplea con las pinzas y tijeras?
5. Cite 3 medidas de bioseguridad
1.6 FUENTES DE INFORMACIÓN
MICROSCOPIO
El microscopio es indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de la morfología
y estructura de los microorganismos, así como su reacción a diferentes colorantes, lo cual junto con otros
criterios, permitirá su identificación, por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo. Antonio van
Leeuwenhoek, en 1676, gran apasionado en pulir lentes que utilizaba para examinar gran variedad de
materiales, fue el primero en observar bacterias y protozoarios en agua de lluvia, en infusiones diversas y
en su sarro dental.
La máxima amplificación que logró Leeuwenhoek en los diversos microscopios que construyó fue de 300
diámetros.
La perfección del moderno microscopio compuesto facilita intensamente el estudio de la morfología de
microorganismos y por lo menos de algunas de las grandes estructuras de la célula bacteriana.
A finales del siglo XIX surgieron avances importantes en Microscopía, período de gran progreso en
Microbiología.
MÉTODOS DE MICROSCOPIA
Examen de organismos vivos.
La forma más simple de examinar las bacterias y otros microorganismos vivos es suspenderlos en agua u
otro líquido, colocar una gota de esta suspensión en un portaobjetos ordinario y encima un cubreobjetos,
utilizando para su observación al microscopio los objetivos seco débil y seco fuerte. Existen otros métodos
como son el de gota pendiente y el microcultivo.
Examen de bacterias teñidas.
La forma y estructura de las bacterias se revelan con más claridad cuando son desecadas sobre un
portaobjetos y son coloreadas o examinadas contra un fondo teñido. Existen diversas técnicas de tinción.
Para la observación microscópica proceda según el siguiente orden:
La elección de la iluminación depende de la fuente de luz, aumentos empleados y otros
factores.
Enfoque de preferencia con el objetivo de menor aumento, que por lo común tiene un
tope inferior que impide la ruptura de las láminas a observar.
Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revólver y utilice el objetivo deseado.
Al usar el de inmersión, coloque previamente una gota de aceite de cedro sobre la
preparación. Al colocarse el objetivo en posición debe existir una continuidad entre ellas.
Para el enfoque preciso, use tornillo micrométrico.
AUTOCLAVE
HORNO (Horno Pasteur o Poupinel)
ESTUFA O INCUBADORA
REFRIGERADOR O NEVERA
CENTRÍFUGA
BALANZA BAÑO MARÍA
AGITADOR MECÁNICO
POTENCIÓMETRO
CONTADOR DE COLONIAS
MATERIALES DE VIDRIO
Materiales que deben ser de buena calidad, resistir acciones mecánicas y cambios bruscos de
temperatura, tener bajo coeficiente de dilatación y una mínima cantidad de álcali libre.
PLACA PETRI
TUBOS DE PRUEBA (Tubos de ensayo).
MATRACES Y BALONES
PIPETAS
PROBETA
FIOLAS
MATRAZ DE PRECIPITADO
LÁMINAS PORTA Y CUBREOBJETOS
OTROS MATERIALES
MANGOS DE KOLLE
ESPÁTULAS DE METAL
TRÍPODE
PIZETA O FRASCO LAVADOR
MECHERO BUNSEN
Trípode Pesetas
2.5 PROCEDIMIENTO
Reconozca y dibuje a escala cada uno de los materiales de laboratorio, colocando el nombre
respectivo y su uso.
2.3 CUESTIONARIO
1. Dibuje los diferentes equipos y materiales de laboratorio estudiados.
2. Describa y esquematice el modo de usar una pipeta y una placa Petri.
3. ¿Qué material de laboratorio utilizaría para medir volúmenes pequeños y exactos?
4. ¿Qué equipo de laboratorio utilizaría para esterilizar medios de cultivo?
5. ¿Qué volumen cree usted más exacto, el medido con una pipeta aforada o el medido con una
graduada?
6. ¿Qué implementos volumétricos miden vaciando?
7. ¿Para qué se usan los implementos que se le entregaron en esta sesión de laboratorio?
8. ¿Cuál es el objetivo de usar la rejilla de asbesto?
También es una tinción diferencial. Se denomina tinción ácido-alcohol resistente y es específica para una
serie de bacterias con estructura de pared particular, las micobacterias. La pared de las micobacterias no
está basada en péptidoglicano como las bacterias Gram positivas y Gram negativas, sino en ácidos
micólicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloración con ácido y alcohol que no se
produce en casi ningún otro tipo bacteriano.
Mycobacterium tuberculosis
FUNDAMENTO
La tinción de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la
preparación de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante. La
solución decolorante elimina el colorante primario excepto en los bacilos ácido alcohol resistentes.
(BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación.
Esta tinción es útil en la detección de bacterias del género Mycobacterium en muestras de esputo. La
presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis.
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos
micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan
ácido-alcohol resistente. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos
como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido- alcohol resistencia. La coloración
clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que
contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de
los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el
calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su
entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de
color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.
3.4 PROCEDIMIENTO
AZUL DE METILENO
TINCIÓN GRAM
Las Bacterias Grampositivas se colorean de violeta y las Bacterias Gramnegativas de color rojo grosella o
rosado.
PROTOCOLO
GRAMPOSITIVAS
PROTOCOLO
COLORACIÓN DE ZIEHL
NEELSEN
3.6 CUESTIONARIO
1. ¿Qué tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol?
2. ¿Cuáles son los componentes del azul de metileno?
3. ¿Qué estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?
4. ¿A qué se debe que las bacterias Gram negativas no retengan el complejo cristal violeta- yodo?
5. ¿A qué se debe que los colorantes básicos tiñan el núcleo de la célula?
6. ¿Con qué clase de colorante teñiría el protoplasma de la célula?
7. ¿Para qué clase de microorganismos es recomendable la coloración ácido alcohol resistente?
8. ¿Cuál es la función de la fucsina fenicada?
9. ¿A qué se denomina colorante primario y colorante de contraste?
Por su aspecto físico los medios de cultivo pueden ser clasificados en: Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y
por su uso en: Medios de cultivos básicos, Medios de cultivos especiales, tales como: mejorados,
selectivos, diferenciales, de transporte.
REACTIVOS GENERALES
Todos los reactivos generales utilizados como ingredientes en los medios de cultivo deben ser de grado
ACS o de calidad analítica.
COLORANTES
Para la preparación de los medios de cultivo sólo deben emplearse colorantes certificados.
A partir de estos ingredientes es posible preparar un medio de cultivo capaz de permitir el
crecimiento y desarrollo de diversos microorganismos heterótrofos.
1. MEDIOS COMUNES: Son aquellos que poseen los componentes esenciales mínimos para permitir el
crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. Ejemplos: Agua peptonada, Agar
Nutritivo, Agar TSA (Agar Tripticasa Soja), Agar Gelatina, Caldo Nutritivo, etc.
2. MEDIOS ESPECIALES: Son aquellos que se formar a partir de un medio común al cual se le adiciona
diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada. Pueden ser:
2.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS: Cuando se les adiciona sustancias de mayor poder nutritivo como
huevos, extracto de levadura, sangre, vitaminas, etc. Sirven para cultivar microorganismos exigentes en
sus necesidades nutricionales.
Ejemplos:
Agar Sangre: Cuando a un medio común se le adiciona entre 5 y 10% de sangre.
Permite el cultivo de bacterias patógenas.
Agar Ogawa o Lowenstein – Jensen: Medio enriquecido que permite el cultivo de
Mycobacterium tuberculosis (Bacilo de Koch).
Agar Chocolate: Se sintetiza al calentar el agar sangre a temperatura entre 60 –
80°C, tomando el color chocolate característico. Sirve para el crecimiento de
Neisseria meningitis (meningococo) y Neisseria gonorrhoeae (gonococo).
Caldo Cerebro – Corazón (Brain, Heart Infusión. BHI): Sirve para microorganismos
exigentes.
Caldo de Carne, Hemina y Vitamina K: Permite el crecimiento de microorganismos
anaerobios exigentes.
2.2. MEDIOS SELECTIVOS: Son medios de cultivo que tienen la finalidad de favorecer el crecimiento y
desarrollo de una bacteria y al mismo tiempo inhibir el desarrollo de otras. Para este fin se le adicionan
sustancias con efectos INHIBIDORES tales como sal, colorantes, antibióticos o sales biliares. A estos
medios también se les denomina Medios de Aislamiento. Ejemplos:
Agar Mac Conkey, para E. coli y otras Enterobacterias.
Agar Cetrimide, para Pseudomonas.
Agar Manitol Salado, para estafilococos.
Agar Mitis Salivarius, para estreptococos orales.
Agar Clindamicina, para Eikenella corrodens.
Agar GMC (Gelatina, Metronidazol y Cadmio), para el aislamiento de
Actynomices viscosus, Actynomices naeslundii y Actynomices
odontolyticus.
Agar TCBS, para Vibrio cholerae.
Agar Sabouraud, para hongos.
2.4. MEDIOS DE TRANSPORTE: Medios especiales que mantienen viables a los microorganismos
y permiten su transporte desde el lugar de muestra hasta el laboratorio.
Ejemplos:
Medio Cary Blair.
Medio Stuart.
Medio Amies.
Caldo Hajna.
Caldo Tioglicolato.
A veces se combina las características de cada uno de estos medios y por lo tanto el medio resultante
será Enriquecido, Selectivo y Diferencial. Esta clasificación es flexible y se plantea con fines didácticos.
4.2 COMPETENCIAS
Identifica y reconocerlos medios de cultivo de uso frecuente en microbiología.
Conoce y describe los requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento de
microorganismos.
Prepara y autoclava medios de cultivo.
1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria
según el volumen requerido.
2.- Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua destilada en el volumen requerido,
agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En el último paso se debe tener cuidado ya que el
recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias
quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede
utilizarse un baño maría para aumentar la solubilidad.
4.- Si se desea que el agar quede en tubos, entonces se esterilizará el agar directamente en ellos a
121°C durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen
inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20° a 30°
· sobre una varilla de vidrio.
5.-Para preparar el Agar base Sangre es necesario Adicionar en condiciones de asepsia sangre
desfibrinada estéril en concentración final de 15%. Después de la esterilización del Agar base Mezclar
cuidadosamente y poner en cajas Petri estériles.
6- Dejar Solidificar a temperatura ambiente. Las cajas de Petri colocarlas dentro de bolsas y guardarlas
en el refrigerador.
4.5 CUESTIONARIO
1. Investigue y señale la composición del Agar Nutritivo y Agar Sangre.
2. Indique 05 medios de cultivo selectivos y su importancia.
De líquido a líquido. c)
De sólido a líquido. d) De
sólido a sólido.
COLONIA: Es el conjunto de microorganismos resultantes del crecimiento y multiplicación en
un medio de cultivo sólido, y que está constituido por un mismo tipo de microorganismos. CULTIVO
PURO: Cultivo que consta de una sola especie bacteriana a partir de la cual se estudia sus
características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas.
CEPA: Es un cultivo puro plenamente identificado y ubicado en su taxonomía correspondiente.
MUESTRA BIOLÓGICA: Es cualquier material biológico de origen humano susceptible de conservación
y que alberga microorganismos. Pueden ser: sangre, orina, esputo, heces, LCR, uñas, pelos, fluido
gingival, paca dental, saliva, abscesos, etc.
TÉCNICAS DE SIEMBRA
La técnica de siembra a utilizar varía según el medio de cultivo a usar, ya sea líquidos o sólidos.
Si es líquido la Siembra por Inoculación será la indicada; si el medio es sólido las técnicas a usar pueden
ser Estría Simple, Por Puntura, Por Incorporación o Por Dispersión o Agotamiento.
B
A
de muestra y sembrar introduciendo la aguja hasta cerca del fondo del tubo que contiene medio sólido(a);
después al momento de retirar la aguja de abajo hacia arriba hacer una estría simple(b).
SIEMBRA POR INCORPORACIÓN
Técnica que sirve para el recuento de bacterias y determinar si son anaeróbicas facultativas o
microaerófilas. Consiste en diluir la muestra y añadir el medio de cultivo licuado y enfriado a
45°C, luego repartir la mezcla en placas Petri, dejar enfriar e incubar.
Giro de la placa
45°
45°
45°
45°
5.2 COMPETENCIAS
Identifica las diferentes técnicas de siembra y aislamiento de muestras microbianas en medios
de cultivo.
5.5 RESULTADOS
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE COLONIAS
Si se han seguido correctamente las técnicas de siembra y cultivo, sobre algunos planos del medio, se
podrá visualizar masas microbianas definidas y separadas entre sí, llamadas colonias en medio
sólido; y turbidez, sedimento, película o flóculos en medio líquido.
Cada colonia es el resultado de la multiplicación logarítmica de una bacteria depositada en un punto del
medio sólido, que en condiciones óptimas de crecimiento forman una progenie con sus características de
especie o de grupo, las cuales nos permitirán su identificación.
Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:
FORMA: Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.
ELEVACIÓN: Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
BORDE: Entera, ondulado, dentado, filamentoso.
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, granulada.
TAMAÑO: Diámetro en milímetros. CONSISTENCIA: Cremosa,
membranosa, mucosa. CROMOGÉNENESIS: Pigmentación verde,
amarilla, roja, etc. GRADO DE TRANSPARENCIA: Transparente,
translúcido, opaco.
4. ¿Con qué sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4.
5. ¿Qué es un medio de transporte y para qué sirve? De 2 ejemplos.
6. ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?
Como producto de fermentación de los azúcares, se puede formar Gas, que se detecta por la presencia
de burbujas, grietas o desplazamientos del medio de cultivo en el tubo.
De igual manera al medio se le ha adicionado Tiosulfato de Sodio como fuente de azufre para generar
H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado de color negro insoluble
denominado Sulfuro ferroso (FeS).
PRUEBA DE LA CATALASA
La Catalasa es una enzima que posee la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas y
que va a convertir el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno, de
acuerdo a la siguiente reacción:
2H2O2 2 H2O + O2
Los Citocromos son hemoproteínas que actúan como último eslabón de la cadena respiratoria aerobia,
transfiriendo electrones (H) al oxigeno con formación de agua. Este sistema de citocromos se
encuentra en los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos, permitiéndonos identificar a los
microorganismos que carecen de la enzima y los anaerobios estrictos.
En laboratorio se hace reaccionar a la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil - p –
fenilendiamina (Reactivo de Kovacs), y que se presenta en solución, discos o tiras llamados
comúnmente oxidasa.
PRUEBA DEL MANITOL
Para esta prueba se utiliza el agar manitol salado, medio de cultivo selectivo y diferencial que permite el
crecimiento de estafilococos, y que en su composición cuenta con el sustrato Manitol, el cual tras
su fermentación libera ácidos que serán detectados por el indicador rojo fenol el cual hará viraje a color
amarillo.
Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus del Staphylococcus epidermidis y otras
especies perteneciente a este género bacteriano.
PRUEBA DE LAS HEMOLOSINAS
Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir enzimas y toxinas que pueden ser detectadas
al sembrar los microorganismos en placas con Agar Sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos. Esta
capacidad de los microorganismos se relaciona directamente con su virulencia y patogenicidad.
Ahora, según el tipo de lisis que producen se pueden clasificar en Hemolisinas Alfa, que producen una
lisis parcial o incompleta de eritrocitos; y Hemolisinas Beta, productoras de una lisis total o completa.
PRUEBA DE LA COAGULASA
La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la conversión del
fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de
Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene S. aureus. La
coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama
staphylothrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que
se coagule la sangre.
La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y
puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que está cubierta de
fibrina del Staphylococcus es capaz de resistir la fagocitosis haciendo que esta bacteria tenga un factor
de virulencia mayor.
6.4 PROCEDIMIENTO EN
AGAR TSI
Con el asa de kölle, haga una siembra por puntura en el tubo con TSI.
Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.
PRUEBA DE LA CATALASA
Con el asa de siembra estéril, transferir parte el inóculo a una lámina portaobjeto.
Añadir 1 o 2 gotas de H2O2 al 3%.
Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después de añadir las gotas de H2O2 al 3%.
Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.
Precauciones: La prueba debe realizarse en cultivos hasta de 24 horas, cultivos más viejos pueden
perder su actividad catalasa dando un falso negativo. Además evitar el contacto de peróxido de hidrogeno
con la piel.
PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA
Método Directo: Se añade directamente a las placas sobre las colonias bacterianas 02 ó 03 gotas del
reactivo oxidasa.
PRUEBA DEL MANITOL
- Realizar siembra por estría simple de ambas cepas bacterianas.
- Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.
PRUEBA DE LAS HEMOLISINAS
- Con el asa de kölle realizar una siembra por estría simple en una placa con agar sangre.
- Incubar a 37°C por 24 horas.
6.5 RESULTADOS
2. PRODUCCIÓN DE H2S
- Producción de pigmento negro en fondo de tubo: H2S (+)
- No pigmento negro en fondo de tubo: H2S (-)
3. PRODUCCIÓN DE GAS
- Presencia de burbujas, grietas o desplazamiento en medio : Gas (+)
- No burbujas, no grietas, no desplazamientos: Gas (-)
PRUEBA DE LA CATALASA
- Formación de burbujas o efervescencia: Catalasa Positiva.
- No formación de burbujas y efervescencia: Catalasa Negativa.
Nota: Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2 dando
pocas burbujas diminutas durante 20 – 30´, estas no son Catalasa positiva.
En la hemolisis alfa, el enverdecimiento del medio se debe a la salida de un derivado del tipo de la
metahemoglobina, que al ser oxidado se convierte en un compuesto del tipo de la biliverdina.
PROTOCOLO
CATALASA
CITOCROMO
OXIDASA
MANITOL
HEMOLISINAS
COAGULASA
6.6 CUESTIONARIO
Esquematice y grafique los resultados obtenidos en la lectura de las pruebas bioquímicas
anteriormente realizadas.
6.7 FUENTES DE INFORMACIÓN
7.2 COMPETENCIA
Identifica los agentes físicos y químicos antibacterianos, aplicando e interpretando los
resultados en la prevención de las enfermedades.
7.4 PROCEDIMIENTO
Acción de los agentes físicos:
1. Flamear el asa de siembra antes y después de tomar las muestras microbianas.
El asa de siembra en aro que contenía inóculo y que fue sembrada directamente en el medio de
cultivo presentó desarrollo microbiano.
El asa de siembra en aro que fue flameada luego de tomar el inóculo y que
posteriormente fue sembrado no presentó desarrollo microbiano; lo que evidencia el correcto
uso de la llama directa como agente físico antimicrobiano.
Los materiales de vidrio que fueron correctamente preparados y sometidos a acción del calor
seco (Horno) fueron correctamente esterilizados.
Merthiolate, Violeta de genciana y alcohol yodado presentaron halo de inhibición para
Gram positivos.
Fenol, hipoclorito de sodio presentaron halos de inhibición para Grampositivos y gran
negativos.
Listerine y otros enjuagues bucales presentaron halos de inhibición para
Grampositivos.
Registre sus resultados:
7.6 CUESTIONARIO
1. ¿Qué método de esterilización utilizaría Ud. para el asa de siembra?
2. ¿Qué desinfectante se utiliza con frecuencia en el laboratorio de Microbiología?
3. Definir: Agente esterilizante, desinfectante, agentes antisépticos,
quimioterápicos.
4. ¿Cómo podemos saber que un microorganismo está “muerto”?
BACTERIAS GRAMPOSITIVAS
En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul
oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-positivas" o también
"Grampositivas". Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo
que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y
cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Posibacteria. Las restantes son las
bacterias Gram negativas.
Estructura
La célula bacteriana está rodeada por una envoltura que, observada al microscopio electrónico, se
presenta como una capa gruesa y homogénea, denominada pared celular. Luego en sección
(corte) se observa una estructura semejante a dos líneas paralelas separando una capa menos
densa; esto corresponde a la membrana plasmática. Entre la membrana plasmática y la pared
celular se encuentra el periplasma o espacio periplasmático. En el interior de la membrana plasmática se
encuentra el citoplasma que está constituido por una disolución acuosa, el citosol, en el cual se
encuentran ribosomas y otros agregados de macromoléculas, y en el centro se ubica la zona menos
densa llamada nucleoide, que contiene una madeja de hebras difícil de resolver (distinguir) y cuyo
principal componente es el ADN.
La pared externa de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva tiene como base química
fundamental el péptidoglicano, que es un polímero de N-acetil-2-D-glucosamina, unido en orientación ß-
1,4 con N-acetil murámico, a éste se agregan por el grupo lactilo cuatro o más aminoácidos. Esta
molécula se polimeriza gran cantidad de veces, de modo que se forma una malla especial, llamada
sáculo de mureína. Dicho compuesto es de vital importancia para
Membrana citoplasmática.
Capa gruesa de péptidoglicano.
Ácidos teicoicos y lipoteicoicos, que sirven como agentes quelantes y en ciertos tipos de
adherencia.
Polisacáridos de la cápsula.
Si algún flagelo está presente, este contiene dos anillos como soporte en oposición a los cuatro
que existen en bacterias Gram-negativas porque las bacterias Gram- positivas tienen solamente
una capa membranal.
Tanto las bacterias Gram-positivas como las Gram-negativas pueden presentar una capa superficial
cristalina denominada capa S. En las bacterias Gram-negativas, la capa S está unida directamente a
la membrana externa. En las bacterias Gram-positivas, la capa S está unida a la capa de péptidoglicano.
Es única a las bacterias Gram-positivas la presencia de ácidos teicoicos en la pared celular. Algunos
ácidos teicoicos particulares, los ácidos lipoteicoicos, tienen un componente lipídico y pueden asistir en el
anclaje del péptidoglicano, en
tanto el componente lipídico sea integrado en la membrana.
F-CV3-3B-2
http://www.pomif.com/pages/practicas/ba cteriologia/tinciones/gram
8.2 COMPETENCIAS
8.3 MATERIALES
8.4PROCEDIMIENTO
Realizar la tinción de Gram correspondiente a cada una de las muestras
Hacer la observación microscópica y determinar:
- Forma
- Configuración espacial
- Género
- Especies importantes
- Patologías
- Hábitat
8.5 CUESTIONARIO
PRÁCTICA Nº 09
BACTERIAS GRAMNEGATIVAS
Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina
pared celular de péptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una
membrana lipídica y la pared de péptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene
el colorante durante la tinción de Gram.
La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas está compuesta por una membrana
citoplasmática (membrana interna), una pared celular delgada de péptidoglicano, que rodea a la
anterior, y una membrana externa que recubre la
4
pared celular de estas bacterias. Entre la membrana citoplasmática interna y la membrana
externa se localiza el espacio periplásmico relleno de una sustancia denominada periplasma, la cual
contiene enzimas importantes para la nutrición en estas bacterias.
La membrana externa contiene diversas proteínas, siendo una de ellas las porinas o canales
proteicos que permiten el paso de ciertas sustancias. También presenta unas estructuras llamadas
lipopolisacáridos (LPS), formadas por tres regiones: el polisacárido O (antígeno O), una estructura
polisacárida central (KDO) y el lípido A (endotoxina).
Las bacterias Gram-negativas pueden presentar una capa S que se apoya directamente sobre la
membrana externa, en lugar de sobre la pared de péptidoglicano como sucede en las Gram-
positivas. Si presentan flagelos, estos tienen cuatro anillos de apoyo en lugar de los dos de las
bacterias Gram-positivas porque tienen dos membranas. No presentan ácidos teicoicos ni ácidos
lipoteicoicos, típicos de las bacterias Gram-positivas. Las lipoproteínas se unen al núcleo de
polisacáridos, mientras que en las bacterias Gram - positivas estos no presentan lipoproteínas.
Asa bacteriológica
9.4 PROCEDIMIENTO
Realizar la tinción de Gram correspondiente a cada una de las muestras
Hacer la observación microscópica y determinar:
- Forma
- Género
- Especies importantes
- Patologías
- Hábitat
9.5 CUESTIONARIO
1. Mencione las diferentes enfermedades que puede producir E. coli
2. ¿Con qué enfermedades se relacionan los siguientes microorganismos?
- Salmonella
- Neisseria
- Pseudomona
ANTIBIOGRAMA
Se siembra, con el germen a estudiar, una placa de un medio de cultivo adecuado. Sobre la superficie
del medio se colocan discos de papel impregnados con el antibiótico o quimioterápico a
ensayar. Si el germen estudiado es sensible, en torno al disco se observará un halo, en el cual no hay
proliferación de bacterias. Si el germen es resistente al antibiótico, crecerá uniformemente y no habrá
ningún halo de inhibición en torno al disco de papel.
Medios de cultivo.
Los distintos microorganismos tienen distintas exigencias tanto en los que se refiere al medio nutritivo en sí
como a la temperatura de incubación ya las condiciones atmosféricas. Casi todos los microorganismos
pueden cultivarse en medios nutritivos inertes. Hay medios de cultivo líquidos y sólidos; de hecho los
sólidos son medios de cultivo líquidos a los que se adicionan
diferentes sustancias, las más utilizadas son el agar y la gelatina.
Agar ordinario
Peptona 15 gr/l
NaCl 5gr/l
Agar 12gr/l
Agar nutritivo
Agar nutritivo
Los medios de cultivo deben estar ajustados a un pH adecuado. El Agar ordinario y el Agar nutritivo a un
pH = 7,2. El ajuste se realiza con NaOH y/o HCl en soluciones 1 N y 1/10N. Se acostumbra a hacer
antes de la esterilización, aunque, a veces, debe hacerse después. La esterilización de los medios de
cultivo se hace generalmente calentándolos en una autoclave a
121 ° C ya una atmósfera de presión de vapor, durante 15-30 minutos. Alternativamente puede utilizarse
una olla a presión adecuada.
- RESISTENTES
- SENSIBLES
- MUY SENSIBLES
Debe tenerse presente que el diámetro del halo de inhibición depende también de la difusibilidad del
antibiótico y, por tanto, no es una medida absoluta de la eficacia.
Los datos que proporciona el antibiograma son muy valiosos pero su aplicación no es tan
sencilla. Para la prescripción correcta de los antibióticos hay que tener en cuenta siempre la
Esta técnica, denominada de disco-difusión es fácil de realizar, barata, aceptada por los
organismos de estandarización y abierta en el sentido que permite analizar cualquier microorganismo y
cualquier antibiótico. Incluso puede aplicarse directamente sobre muestras clínicas en infecciones graves
como la meningitis.
Los discos con antibiótico deben conservarse en frió. El inóculo para sembrar las placas suele ajustarse
por turbidez y debe corresponder con el nivel 0,5 en la escala arbitraria de Mc Farland. Tras la
incubación se miden los diámetros de los halos de inhibición y se interpretan los resultados con ayuda
de los puntos de corte establecidos internacionalmente para cada microorganismo y para cada
antibiótico.
El sistema Epsilon-Test es un ingenioso método de antibiograma por difusión que en lugar de discos
utiliza tiras de papel graduadas con valores de CMI e impregnadas con un antibiótico en forma de
gradiente de concentración. La intersección del halo de inhibición con la tira de papel indica la CMI del
microorganismo para dicho antibiótico.
Anaerobios
Pueden utilizarse técnicas de dilución (microdilución) y de difusión (Epsilon-Test). Sólo se realizan en
aislamientos valorables clínicamente en los no existe intervención de microorganismos aerobios. Se
utilizan medios de cultivo específicos muy enriquecidos porque suele tratarse de microorganismos
exigentes. Se testan los antibióticos más eficaces frente a estos agentes. Por supuesto todos los
métodos deben realizarse asegurando la ausencia de oxígeno.
Micobacterias
Las micobacterias crecen muy lentamente, lo que dificulta enormemente las técnicas de
antibiograma y las limita a laboratorios de referencia. Existen varios sistemas pero ninguno de ellos esta
estandarizado, de modo que hay que tomar los resultados con precaución. El más utilizado es el
método de las proporciones que compara crecimiento en tubos con y sin antibiótico. El aumento en
los últimos años del número de casos de tuberculosis hace que se trabaje cada vez más en la resistencia
antibiótica de M. tuberculosis.
10.2 COMPETENCIA
Determina la sensibilidad in vitro de las bacterias frente a los quimioterápicos.
10.3 MATERIALES
Placas de Petri con Agar Mueller Hisopos estériles
H inton Bocales con desinfectante
Frascos con discos de antibióticos Pinzas
Cultivo bacteriano Incubadora
10.4 PROCEDIMIENTO
1. Con la ayuda de un hisopo sembrar el cultivo bacteriano (estandarizado con 0,5 de Mac Farland)
en tapete sobre el medio de cultivo en placa. Dejar en reposo 5 minutos.
2. Con la ayuda de una pinza recoger los discos de antibióticos presentes en los frascos y
depositarlos sobre la placa Petri con medio de cultivo. Dejar en reposo.
3. Repetir la misma operación para cada antimicrobiano.
4. Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
5. Realizar las lecturas con ayuda de una regla milimetrada. ( diámetro de inhibición)
6. Compararlo con la hoja que proporciona el proveedor donde se encuentran los valores en diámetro
para cada antibiótico vs cepas ATCC para determinar si el antibiótico es INTERMEDIO, SENSIBLE O
RESISTENTE.
10.5 RESULTADOS
1. Las lecturas de los halos de inhibición fueron comparadas con una tabla patrón dado por el proveedor
de los antimicrobianos. Obtuvimos que para los Grampositivos resultaron sensibles la dicloxacilina,
teraciclinas, ciprofloxacina.
2. Para los gramnegativos resultaron sensibles la gentamicina, nitrofurantoína, cefotaxima. Completar
el cuadro de resultados:
10.6 CUESTIONARIO
AMEBIOSIS
ESPECIE: Entamoeba histolytica (quiste): Es la forma infecciosa y presenta las siguientes características:
oTamaño: 10 – 20 m, esféricos.
o Núcleo: Hay cuatro en los quistes maduros. Puede haber menos de cuatro en los quistes
inmaduros. La cromatina es delicada y está distribuida uniformemente, a modo de
“cuentas”, a lo largo de la membrana nuclear. Cariosoma diminuto, compacto y, por lo
general, de ubicación central, aunque puede variar de posición.
o Citoplasma: El 10 % de los quistes pueden tener barras cromatoideas, con extremos
redondeados y lisos. Es posible observar vacuolas de glucógeno en los prequistes temprano.
Cuando los trofozoitos se van transformar en formas quísticas de resistencia expulsan todo el material
ingerido y se redondean, a esta forma se le denomina forma prequística, puede reconocerse por la presencia de
un único núcleo redondeado, ausencia de material fagocitado y la ausencia de pared quística.
La invasión de los trofozoitos provoca hemorragias, deterioro del revestimiento epitelial del intestino grueso,
debido a la producción de enzimas proteolíticas que puede ser superficial (mucosa) o generando ulceras “en
redoma” en la submucosa y en ocasiones la invasión a otros órganos extraintestinales como el hígado,
pulmón, por vía circulatoria (metástasis).
Los eritrocitos recién fagocitados aparecen como cuerpos de color gris pálido (H. férrica) y de color cereza
(Tricrómica modificada).
Diagnóstico
La amebiasis se diagnostica en el laboratorio examinando las heces de un individuo infectado; para establecer
el diagnóstico suele ser necesario analizar entre 3 y 6 muestras. Para observar el interior del recto y obtener una
muestra de tejido de cualquier úlcera que se encuentre puede utilizarse un rectoscopio (tubo flexible de
visualización).
Los enfermos con un absceso hepático casi siempre tienen en la sangre valores elevados de
anticuerpos contra el parásito. Sin embargo, como estos anticuerpos pueden permanecer en el flujo sanguíneo
durante meses o años, el hallazgo de valores elevados de anticuerpos no necesariamente indica que exista un
absceso. En consecuencia, si el médico piensa que se ha formado un absceso, puede prescribir un fármaco
que elimine las amebas (un amebicida). Si el fármaco resulta eficaz, se da por sentado que la amebiasis era el
diagnóstico correcto.
GIARDIASIS
ESPECIE: Giardia lamblia es el agente etiológico de la giardiosis.
El trofozoito de este protozoo presenta las siguientes características:
oTamaño: 9 - 21 m de largo y 5 – 15 m de ancho, simetría bilateral; forma de “pera”,
con extremos ahusados.
o
oCitoplasma: Espacio claro entre la pared del quiste y el citoplasma, produce el efecto de halo y
presenta cuatro cuerpos mediales.
Los síntomas orientan hacia el diagnóstico. Éste se confirma mediante los análisis de laboratorio que revelan la
presencia del parásito en las heces o en las secreciones del duodeno. Debido a que las personas que han sido
infectadas durante mucho tiempo tienden a excretar los parásitos a intervalos impredecibles, puede ser
necesario realizar exámenes seriados de las heces.
PALUDISMO (MALARIA)
ESPECIE: Plasmodium Vivax
TROPOZOÍTOS:
Temprano: Anillo relativamente grande (un tercio del tamaño del glóbulo rojo). Pueden verse anillos con
dos núcleos o células con dos o tres anillos.
Maduro: ameboide, con delicados seudópodos que fluyen llenando por completo el hematíe.
GAMETOCITOS: Redondos u ovales. Cuando maduran, llenan casi por completo la célula roja. Masas
grandes de cromatina. El pigmento es grueso y distribuido de manera uniforme.
ASPECTO DE ERITROCITOS: Tamaño normal; rara vez se observan puntos de Maurer o hendiduras.
La relación células infectadas / células normales es alta. Por lo común, no se observan formas en anillo
intermedias o esquizontes en sangre periférica. La duración del ciclo asexual es de
48 horas (“terciana maligna”).
TROPOZOÍTOS: Formas en anillo en extremo pequeña, que ocupan no más de un quinto del hematíe. Son
comunes los núcleos dobles y las células rojas con múltiples anillos. Las formas en aplique adheridas a la
membrana del hematíe son virtualmente diagnósticas.
GAMETOCITOS: Las formas características en medialuna o banana son prácticamente diagnósticas. Los
microgametocitos se tiñen de azul más claro que los macrogametocitos.
ARTRÓPODO VECTOR: Insecto triatomino. Los tripomastigotes metacíclicos en las heces del insecto son
las formas infectantes para el hombre.
TOXOPLASMOSIS
Diagnóstico
El diagnóstico de toxoplasmosis suele establecerse mediante un análisis de sangre que revele la
presencia de anticuerpos contra el parásito.
Sin embargo, si el sistema inmunológico del enfermo está debilitado, el profesional puede basarse en
una tomografía computadorizada (TC) y resonancia magnética (RM) del cerebro para establecer el
diagnóstico.
FUNDAMENTO TEÓRICO
ESPECIE: Trichomona vaginalis (trofozoito): Es la forma patógena que habita en un medio con pH
ácido y abundancia de bacterias.
oTamaño: 5 – 25 m de longitud y 5 – 8 m de ancho; con forma de “lágrima”.
o Motilidad: Posee 5 flagelos: cuatro son anteriores y libres, y el quinto se dirige hacia la
parte posterior del cuerpo celular asociado a la superficie celular formando una
membrana ondulante que no tiene porción libre del flagelo.
11.4 PROCEDIMIENTO
Hacer el montaje de las láminas correspondientes
Realizar el enfoque y visualizar con los objetivos secos y el objetivo húmedo
Observar la morfología de los diferentes parásitos
Esquematizar sus observaciones
TRICURIASIS
La trichuriasis es una infección causada por Trichuris trichiura, un gusano nematodo intestinal. Este
parásito se encuentra principalmente en los trópicos y subtrópicos, donde la falta de medidas
sanitarias y el clima cálido y húmedo brindan las condiciones necesarias para que los huevos incuben en
la tierra.
Síntomas y diagnóstico
Sólo una gran infección provoca síntomas tales como dolor abdominal y diarrea. Las muy graves pueden
provocar hemorragias intestinales, anemia, pérdida de peso y apendicitis. Ocasionalmente, el recto
puede protruir por el ano (una condición llamada prolapso rectal), especialmente en los niños o las
mujeres durante el trabajo de parto.
Los huevos con forma de barril suelen ser visibles en las muestras de heces examinadas al microscopio.
ASCARIASIS
La ascariasis es una infección causada por Ascaris lumbricoides, un gusano nematodo intestinal.
La infección se produce en todo el mundo, pero es más frecuente en zonas cálidas con deficientes
condiciones sanitarias, en donde persiste largo tiempo debido a la defecación incontrolada de los
niños.
El ciclo vital del parásito Ascaris se parece al del parásito que produce trichuriasis, a excepción de que las
larvas también migran hacia los pulmones. Una vez que ha madurado, migra por la pared del intestino
delgado y es transportada por los vasos linfáticos y el flujo sanguíneo hasta los pulmones. De allí pasa a
los sacos aéreos (alvéolos), asciende por el tracto respiratorio y es tragada. La larva madura en el
intestino delgado, donde permanece como gusano adulto. Los gusanos adultos oscilan entre 15 y 50
centímetros de largo y de 2,5 a 5 milímetros de diámetro. La sintomatología puede producirse debido a la
migración de las larvas a través de intestino y por la presencia del gusano adulto en el intestino.
Síntomas y diagnóstico
La migración de las larvas a través de los pulmones puede provocar fiebre, tos y respiración jadeante.
Una infección intestinal grave puede causar retortijones abdominales y en ocasiones obstrucción
intestinal. La deficiente absorción de nutrientes puede estar causada por una gran concentración de
gusanos. Los adultos en ocasiones obstruyen el apéndice, el tracto biliar o el conducto pancreático.
La infección con gusano adulto suele ser diagnosticada cuando se identifican huevos en una muestra de
heces. En ciertos casos, las pruebas de laboratorio revelan la presencia de los mismos en las heces o el
vómito o larvas en el esputo. Pueden aumentar en la sangre el número de eosinófilos, que son una
variedad de glóbulos blancos. En una radiografía de tórax se pueden observar signos de la migración
larvaria.
En el ciclo vital de cada gusano, los huevos se descargan en las heces y maduran en la tierra tras haber
incubado durante uno o dos días. Pocos días después, las larvas nacen y viven en la tierra. Un individuo
puede infectarse al caminar descalzo por una zona contaminada por heces humanas ya que las larvas
atraviesan la piel. Éstas llegan a los pulmones a través de los vasos linfáticos y el flujo sanguíneo. Luego
suben por el tracto respiratorio y son deglutidas. Alrededor de una semana después de haber atravesado
la piel, llegan al intestino. Se adhieren por medio de su boca al revestimiento mucoso del intestino
delgado superior y succionan sangre.
Síntomas y diagnóstico
En el punto en el que las larvas atravesaron la piel puede formarse una erupción cutánea aplanada y
algo sobre elevada que produce mucha picazón (prurito anquilostomiásico). La migración de las larvas a
través de los pulmones provoca en ciertas ocasiones fiebre, tos y respiración jadeante. Los gusanos
adultos suelen producir dolor en la parte superior del abdomen. El sangrado intestinal conduce a
una anemia por deficiencia de hierro y bajos valores de proteína en sangre. En los niños, la
importante pérdida de sangre de forma crónica puede generar retraso del crecimiento, insuficiencia
cardíaca y tumefacción generalizada de los tejidos.
Si la infección produce síntomas, los huevos suelen resultar visibles en una muestra de heces. Si ésta no
se examina durante varias horas, los mismos pueden madurar y liberar las larvas.
Esta enfermedad es una infección intestinal causada por el gusano (céstodo) Taenia saginata. La infección
es particularmente frecuente en África, Oriente Medio, Europa Oriental, México y América del Sur.
El gusano adulto vive en el intestino humano y puede llegar a medir entre 5 y 10 metros de largo. Las
secciones del gusano que contienen los huevos (proglótides) se eliminan por las heces y son ingeridas
por el ganado vacuno. Los huevos maduran en el ganado y atraviesan la
Síntomas y diagnóstico
A pesar de que la infección no suele causar síntomas, algunas personas tienen dolor en la parte
superior del abdomen y diarrea, y pierden peso. En ciertos casos, una persona infectada puede sentir que
una parte del gusano sale por el ano. Por lo general, el diagnóstico se hace cuando se encuentra un
trozo de gusano en las heces. El médico puede enganchar una cinta de celofán en el margen que rodea
el ano y luego la coloca sobre una placa de cristal para examinarla al microscopio en busca de huevos de
este parásito.
Síntomas y diagnóstico
La infección provocada por el gusano adulto no suele causar ningún síntoma. Las grandes infecciones
producidas por quistes pueden causar dolor muscular, debilidad y fiebre. Si la infección llega al cerebro y
las membranas que lo recubren, éstas pueden inflamarse. También pueden producirse convulsiones.
En las infecciones causadas por gusanos adultos, es posible ver huevos alrededor del ano o en las heces.
Para distinguir el gusano de la carne de cerdo de otros gusanos es necesario encontrar un proglótide o
bien la cabeza del gusano en las heces y examinarlas al microscopio.
12.2 COMPETENCIA
Reconoce macroscópica y microscópicamente los parásitos que se relacionan con
enfermedades en el ser humano.
El talo o colonia de moho consiste en largos filamentos celulares agrupados. Estos filamentos se
llaman hifas. En la mayoría de los mohos las hifas contienen unos tabiques llamados
septos que dividen a las hifas en unidades diferenciadas, mononucleares, semejantes a
células. Este tipo de hifas se denominan hifas tabicadas, sin embargo, en algunas clases de
hongos la hifa no contiene tabiques y aparecen como largas células continuas con numerosos
núcleos. Estas se conocen como hifas cenocíticas. Las hifas del talo crecen alargándose por sus
extremos. Cada parte de una hifa es capaz de crecer y, cuando se separa un fragmento, puede
alargarse para formar una nueva hifa. Cuando las condiciones ambientales son apropiadas las hifas
crecen, se entrelazan y forman una masa llamada micelio. La parte del micelio implicada en la obtención
de nutrientes de llama micelio vegetativo y la relacionada con la reproducción micelio reproductor o
aéreo, llamado así
porque se proyecta sobre la superficie del medio en el que crece el hongo.
Levaduras
Son hongos unicelulares no filamentosos, con una morfología característica esférica u ovalada. La
mayoría de las levaduras forman colonias de organismos unicelulares y la colonia crece a medida que
aumenta el número de levaduras. Este aumento suele ocurrir por gemación. En la gemación, la célula
forma una protuberancia o yema sobre su superficie externa. Algunas especies de levaduras forman
yemas que no logran separarse y dan lugar a una corta cadena
de células llamada “Pseudohifa”.
Las levaduras son capaces de crecer como anaerobias facultativas. Si disponen de oxígeno, realizan la
respiración aeróbica para metabolizar azúcares hasta CO2 y H2O. Por el contrario,
si carecen de oxígeno, fermentan azúcares produciendo Etanol y CO2.
HONGOS DIMÓRFICOS
Algunos hongos y especialmente, las especies patógenas, muestran dimorfismo, es decir, dos formas de
crecimiento. Estos hongos pueden crecer como moho o como levadura. A menudo, este dimorfismo
depende de la temperatura de incubación: a 37ºC el hongo es levaduriforme mientras que a 25ºC es
filamentoso.
El pH ligeramente ácido tiende a facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el
desarrollo de otros microorganismos.
A los medios de cultivo se le pueden añadir antibióticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de las
bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras. Los más usados son el Cloranfenicol y la
Gentamicina. Se añade también actidiona (Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos
saprófitos ambientales. Los medios cuya composición contengan actidione no deben ser utilizados
para el aislamiento de Cryptococcus neoformans, ya que inhibe su crecimiento.
Contiene un 2% de glucosa y es ligeramente ácido (pH= 6,9), se considera el medio estándar para
recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que pueden aislarse en el laboratorio de
micología clínica. Es el medio estándar para observar la morfología típica de los hongos, pero no es
medio ideal de crecimiento o para estudiar la esporulación. Permite el crecimiento de actinomicetos
aerobios.
Permite el crecimiento de casi todos los hongos filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a
una gran mayoría de bacterias.
Los medios de cultivo pueden ser preparados en placa o en tubo. Los medios en placa tienen la ventaja
de ofrecer mayor superficie para el aislamiento pero, para soportar la deshidratación durante el largo
periodo de incubación a que van a ser sometidos, han de contener una gruesa capa de medio. Son m{as
peligrosos a la hora de su manipulación y fáciles de contaminar. Mientras que los medios en tubo tienen
una superficie de trabajo mucho más pequeña, pero ofrecen máxima seguridad en su manipulación y
buena resistencia a la deshidratación y a la contaminación.
HONGOS CONTAMINANTES
Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayoría saprófitos, hallándose libres en la naturaleza,
especialmente en la materia orgánica en descomposición. Las condiciones necesarias para que un
hongo crezca en una superficie son: existencia de esporas, base de nutrientes, humedad y temperatura
entre 4 y 38º.
13.2 COMPETENCIAS
Diagnostica las micosis en el laboratorio.
Reconoce las principales características macro/microscópicas de los hongos.
Identifica las diferentes especies de interés médico.
Conoce la técnica de microcultivo, utilidad y procedimiento
Realiza el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente
13.4 PROCEDIMIENTO
TOMA DE MUESTRAS
Muestras de la Cabeza: recoger las escamas, los pelos (con raíz) o pasar la moqueta.
Muestras de las Uñas: tomar fragmentos pequeños de las uñas, o un raspado subungueal. Si hay un
exudado perungueal se recogerá la muestra con una torunda estéril.
Lesiones en mucosas orales, balanoprepucial, etc., se recogerá un exudado mediante una torunda.
Se tomarán preferiblemente dos muestras, una para examen microscópico y otra para
la siembra en un medio de cultivo.
Es importante que si las lesiones tienen más de una localización, se realicen tomas separadas. Además,
en los volantes deberá aparecer la fecha de la toma de muestra, la localización de la lesión y tipo de
muestra que se ha tomado, junto con otros datos de interés personales.
PREPARACIÓN EN FRESCO
Permite identificar muchas de las especies de hongos más habituales. El mayor inconveniente de la
observación en fresco es que se puede alterar el ordenamiento característico de las esporas al presionar
con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es válido en los casos en que es necesario
conocer la disposición de las esporas.
Realizar también el estudio microscópico a través del reconocimiento de las especies por
medio de la morfología de las esporas.
Coloración y Microscopía:
Las muestras de micosis superficiales deben ser desqueratinizadas con hidróxido de potasio al
10 ó al 20%, luego se colorean con Azul de Lactofenol; dependiendo del tipo de hongos que se busca.
Los hongos unicelulares o levaduriformes se incuban a 37 °C por 72 horas, mientras que los
pluricelulares o miceliales se incuban a la temperatura ambiental de 5 a 7 días.
Métodos indirectos para diagnóstico de micosis o profundas.
A. Intradermo – reacciones:
- Histoplasmina
- Paracoccidiodomicotina
- Esporotriquina
- Candidina
B. Reacciones Serológicas:
- Aglutinación
- Precipitación
- Fijación de complemento
- Inmunodifusión
1. Candidiasis
Muestras: Incluyen frotis y raspado de lesiones superficiales, sangre, líquido cefalorraquídeo,
biopsia de tejido, orina, exudados, material retirado del catéter intravenoso.
Microscopía: Buscando células en gemación y pseudohifas (lo que confirma la
presencia de Candida albicans).
Cultivo: En Sabouraud se observan las colonias cremosas y pequeñas. Se pueden hacer
algunas pruebas bioquímicas (fermentación de carbohidratos).
Serología: Estas pruebas tienen uso limitado, pudiendo usarse también Intradermo
reacciones como candidina.
2. Histoplasmosis
Muestras para cultivo: Esputo, orina, raspado de lesiones superficiales, aspirado de médula
ósea.
Coloración y Microscopía: Los cortes histológicos se colorean con Giemsa, se observan
levaduras en forma ovoides dentro de las células del tejido afectado.
Cultivo: En Sabouraud (a 25° ó 30 °C). También puede emplearse Agar sangre
glucosa cisteína 37 °C (la incubación se de cuatro semanas como mínimo).
Serología: Las pruebas se hacen positivas entre la segunda a quinta semana después de la
infección.
Intradermo – reacción: Esta prueba cutánea con histoplasmina se hace positiva
después de la infección y permanece positiva durante varios años.
3. Paracoccidiamicosis
Muestras Biológicas: Esputo, exudado de las lesiones bucales, biopsia.
Microscopía: En la microscopía directa de estas muestras, aparecen las levaduras.
Micosis bucales
Candidiasis bucal: Es un estado inflamatorio, infeccioso; caracterizado por la presencia de manchas
blancas con aspecto de leche coagulada localizadas en comisuras labiales, lengua, encía, paladar, al ser
removidos dejan una superficie sangrantes (agente causal: Cándida albicans).
Histoplasmosis: Micosis infecciosa inflamatoria afecta piel mucosas de la cavidad bucal,
ulcera granulada rodeada de decoloración purpurea (agente causal: Histoplasma capsulatum).
Paracoccidiomicosis: Pulmonar, mucosa nasal, mucosa bucal, son afectados por el hongo
Paracoccidioides brasiliensis, las lesiones que se observan son úlceras rojas con fondo
amarillento granular.
http://www.slideshare.net/yotsabeth/practica-1-micologia
Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier
Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005