IDENTIFICACIÓN MOLECULAR MEDIANTE ITS DE AISLAMIENTOS DEL

ENTOMOPATÓGENO Paecilomyces sp. PERTENECIENTES AL LABORATORIO

DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD FRANCISCO DE
PAULA SANTANDER

WENDY LORENA PEÑA BARRERA

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
PLAN DE ESTUDIOS DE INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA
SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA
2017
 IDENTIFICACIÓN MOLECULAR MEDIANTE ITS DE AISLAMIENTOS DEL
ENTOMOPATÓGENO Paecilomyces sp. PERTENECIENTES AL LABORATORIO
DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD FRANCISCO DE
PAULA SANTANDER

WENDY LORENA PEÑA BARRERA

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de
Ingeniero Biotecnológico

Modalidad: Investigación

Directora:
LILIANA YANETH SUÁREZ CONTRERAS
Licenciada en Biología y Química
Maestría en Biología énfasis Genética

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
PLAN DE ESTUDIOS DE INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA
SAN JOSÉ DE CÚCUTA
2017
A mis abuelitos Adán Barrera y Herminia Burgos,

quienes se negaron a sí mismos sin queja alguna,

por permitirme lograr cada una de mis pequeñas

metas desde el jardín de la vida.

 AGRADECIMIENTOS

Quiero que estas líneas reflejen mi más sincero agradecimiento a mi PAPÁ DIOS, por

seleccionarme con un propósito único del cual me ha dado algunas pistas, por sus dulces

promesas que han sido mi aliento para persistir y sé que este logro es un objetivo del

macroproyecto de Él en mi vida.

A mi alma máter: UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER, proveedora del

alimento intelectual y holístico necesario para mi formación académica y personal,

especialmente a TODOS los funcionarios del Complejo Biotecnológico, por haber contribuido

considerablemente en la realización de este proyecto, gracias.

A mi mami DORIS BARRERA, por ser la luz que siempre ha vencido la oscuridad e ilumina mi

vida, por su resilencia la cual ha sido mi fuente de determinación, por escucharme y estar

siempre conmigo aun en la distancia. A MARCE por su entereza y amor que la han consolidado

como mi aspiración más cercana. A JEISS por ser mi profesor personalizado sin importar las

circunstancias, por ayudarme a comprender tantos misterios inentendibles para mí.

Indudablemente a mi papá HÉCTOR PEÑA por su apoyo en el desarrollo de este sueño.

A mi directora LILIANA Y. SUÁREZ C., por la orientación y todo el tiempo invertido en la

realización de esta investigación. Su minuciosidad y esmero son valiosos para mí.

A LUIS QUINTERO por su asesoría científica, por su preocupación constante y desinteresada

para la culminación de este proyecto, por sus sugerencias originales para mantener la calma, por

el ánimo infundido y la confianza depositada en mí.

A ALBA RANGEL por enseñarme tantos tips morfológicos, por su disponibilidad de aclarar

siempre las dudas planteadas y corregir los errores.

A mi profesora MELISSA OBANDO, a quien tengo profunda admiración por ser la precursora

de mi amor por la investigación con su calidez y enseñanza.

A mis papás, hermanos, familiares y amigos que han estado siempre al tanto de mi avance

integral, gracias por ser parte de este gran sueño con su granito de arena.

MUCHAS GRACIAS…
 TABLA DE CONTENIDO

GLOSARIO

INTRODUCCIÓN

1 EL PROBLEMA ----------------------------------------------------------------------------------------- 1

1.1 TITULO --------------------------------------------------------------------------------------------- 1

1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ------------------------------------------------------- 1

1.2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA----------------------------------------------------- 2

1.3 JUSTIFICACIÓN ---------------------------------------------------------------------------------- 3

1.4 OBJETIVOS DEL PROYECTO ----------------------------------------------------------------- 4

1.4.1 Objetivo general ------------------------------------------------------------------------------ 4

1.4.2 Objetivos específicos ------------------------------------------------------------------------- 4

2 MARCO REFERENCIAL ----------------------------------------------------------------------------- 5

2.1 ANTECEDENTES --------------------------------------------------------------------------------- 5

2.2 MARCO TEÓRICO ------------------------------------------------------------------------------ 13

2.2.1 Control biológico ---------------------------------------------------------------------------- 13

2.2.2 Generalidades de Paecilomyces ----------------------------------------------------------- 14

2.2.3 Mecanismos de acción de Paecilomyces ------------------------------------------------- 15

2.2.4 Métodos de reproducción de Paecilomyces ---------------------------------------------- 17

2.2.5 Identificación molecular de hongos ------------------------------------------------------- 18

2.2.5.1 Reacción en cadena de la polimerasa ----------------------------------------------- 19

2.2.5.2 Mezcla de reacción--------------------------------------------------------------------- 20

2.2.5.2.1 Marcadores genéticos --------------------------------------------------------------- 20

2.2.5.2.2 Espaciadores internos transcritos (ITS) ------------------------------------------- 22

2.2.5.3 Termociclador -------------------------------------------------------------------------- 23

 2.2.5.4 Secuenciación del ADN --------------------------------------------------------------- 24

2.3 MARCO LEGAL --------------------------------------------------------------------------------- 25

2.4 HIPÓTESIS ---------------------------------------------------------------------------------------- 25

2.4.1 Hipótesis alternativa ------------------------------------------------------------------------- 25

3 DISEÑO METODOLOGICO------------------------------------------------------------------------- 27

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN ------------------------------------------------------------------- 27

3.2 UNIVERSO Y MUESTRA ---------------------------------------------------------------------- 27

3.2.1 Universo--------------------------------------------------------------------------------------- 27

3.2.2 Muestra ---------------------------------------------------------------------------------------- 27

3.2.3 VARIABLES --------------------------------------------------------------------------------- 27

3.2.3.1 Variables dependientes ---------------------------------------------------------------- 27

3.2.3.2 Variables independientes -------------------------------------------------------------- 27

3.2.3.3 Variables intervinientes --------------------------------------------------------------- 27

3.3 FASES DE LA INVESTIGACIÓN ------------------------------------------------------------ 29

3.3.1 OBTENCION Y CONSERVACION DE Paecilomyces sp. -------------------------- 29

3.3.1.1 Obtención de cultivos puros de Paecilomyces sp. --------------------------------- 29

3.3.1.2 Conservación y depuración de los aislamientos de Paecilomyces sp. ---------- 31

3.3.1.3 Caracterización microscópica de los aislamientos de Paecilomyces sp. ------- 32

3.3.1.4 Siembra de Paecilomyces sp. en caldo PDB --------------------------------------- 32

3.3.2 EXTRACCION DEL ADN DE Paecilomyces sp. -------------------------------------- 33

3.3.3 PURIFICACION Y VERIFICACION DEL ADN de Paecilomyces sp. ------------ 34

3.3.4 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) -------------------------- 35

3.3.5 SECUENCIACIÓN DE LOS FRAGMENTOS ITS Y COMPARACION DE

SECUENCIAS CON BASES DE DATOS ---------------------------------------------- 36

4 DISCUSION Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------------- 38

 4.1 OBTENCION Y CONSERVACION DE Paecilomyces sp. -------------------------------- 38

4.1.1 Obtención de cultivos puros de Paecilomyces sp. -------------------------------------- 38

4.1.2 Descripción macroscópica de aislamientos de Paecilomyces sp. --------------------- 39

4.1.3 DESCRIPCION MICROSCOPICA DE AISLAMIENTOS DE Paecilomyces sp. 45

4.1.4 Siembra de Paecilomyces sp. en caldo PDB --------------------------------------------- 45

4.2 EXTRACCION Y VERIFICACION DEL ADN de Paecilomyces sp. ------------------- 46

4.3 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ------------------------------- 47

4.4 SECUENCIACIÓN DE LOS FRAGMENTOS ITS Y COMPARACION DE

SECUENCIAS CON BASES DE DATOS ------------------------------------------------------ 51

5 CONCLUSIONES -------------------------------------------------------------------------------------- 55

6 RECOMENDACIONES ------------------------------------------------------------------------------- 57

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS--------------------------------------------------------------------59
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 67
 LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Cebadores más comunes para identificación de hongos. 23

Tabla 2. Operacionalización de variables en la identificacion molecular de . 29

Paecilomyces sp.
Tabla 3. Códigos de cepas de Paecilomyces sp. existentes en el laboratorio de 30
Biotecnología Molecular de la UFPS.
Tabla 4. Caracterización macroscópica de cada cepa de Paecilomyces sp. 41

Tabla 5. Cantidades y concentración de reactivos para PCR de Paecilomyces sp. 49

Tabla 6. Identificación molecular de las cepas registradas como Paecilomyces sp., en 54

el laboratorio de Biotecnología Molecular de la UFPS
Tabla 7. Clasificación taxonómica de Purpureocillium, Paecilomyces y Penicillium 55

Tabla 8. Diferencias de identificación morfológica y molecular de Paecilomyces 56

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Morfología microscópica de Paecilomyces lilacinus. 15

Figura 2. Amplificación de ADN a través de PCR. 20

Figura 3. Representación esquemática del cluster del ARNr. 23

Figura 4. Geografía de los aislamientos de Paecilomyces sp. 32

Figura 5. Proceso de observación microscópica de los aislamientos de Paecilomyces sp. 33

F
Figura 6. Obtención del micelio de Paecilomyces a partir de PDB 34

Figura 7. Protocolo de extracción de ADN hongos. 35

Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa. 36

Figura 9. Protocolo y Termociclador CFX96™ Touch Real-Time usado para PCR. 37

Figura 10. Secuenciador ABI PRISM® 3730XL Analyzer 38

Figura 11. Cepa de Paecilomyces con agar agotado. 39

Figura 12. Repiques de cepas a identificar en viales para su purificación. 40

Figura 13. Partes del hongo Paecilomyces sp. 46

Figura 14. Morfología microscópica de los aislamientos de Paecilomyces sp. en 46

microscopio en 40X.

Figura 15. Crecimiento del micelio de Paecilomyces en caldo PDB. 47

Figura 16. Verificación de calidad de ADN, mediante electroforesis de ADN en gel de 48

agarosa al 1% de las extracciones de ADN

Figura 17. Protocolo de PCR propuesto por Suárez 50

Figura 18. Protocolo de PCR propuesto por Martin L 50

Figura 19. Protocolo de PCR propuesto por Perdomo 51

Figura 20. Protocolo estandarizado de PCR para obtención de amplicones de cepas de 51
. Paecilomyces sp. del laboratorio de Biotecnología Molecular
Figura 21. Gel de agarosa 1.5 % (p/v) de productos de amplificación con iniciadores 52
ITS4, e ITS5 a partir de ADN de Paecilomyces sp.
Figura 22. Plataforma de BLAST 53

Figura 23. Género y especie según el estado de reproducción de Paecilomyces sp. 55

 LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1. Cuantificación del ADN de cada extracción. 69

ANEXO 2. Electroferogramas de las secuencias 70

ANEXO 3. Formato cepas de control biológico identificadas molecularmente 77

 RESUMEN

El biocontrolador Paecilomyces es un hongo de interés biológico debido a su acción

entomopatógena frente a insectos, fitopatógenos y nemátodos que afectan distintas

plantaciones, generando pérdidas económicas significativas para los cultivadores. Diversos

estudios han demostrado el papel de Paecilomyces como antagonista de Moniliophthora

roreri fitopatógeno causal de la moniliasis, en el cultivo del cacao en Norte de Santander,

Colombia. Con el fin de caracterizar molecularmente catorce cepas biocontroladoras de

Paecilomyces sp., aisladas de diferentes cultivos de cacao en municipios de Norte de

Santander, Colombia, se estandarizó un protocolo para la identificación molecular mediante la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR); se utilizaron espaciadores internos transcritos

(ITS) universales para hongos. El producto de los amplicones obtenidos se verifico con

electroforesis en gel de agarosa en gel Red y se compararon con el marcador molecular de 1

Kb. Los ITS generados se secuenciaron y compararon con las secuencias en el banco de genes

(NCBI); para esto, se utilizaron BLAST y RDP sequence match, los resultados del análisis

taxonómico de las secuencias de 500 pb de HC002, HC003, HC004, HC006, HS021, HS022,

HZ002,GIAV2,GIAV3,GIAV8,GIAV9 y GIAV13 contra la base de datos del NCBI, indican

que estas cepas tiene un porcentaje de identidad entre 87 y 100% en el total de su longitud

con secuencias de ITS pertenecientes a las especies Purpureocillium lilacinum, GIAV12

perteneciente a Penicillium paxilli y GIAV14 perteneciente a Penicillium copticola. La

caracterización molecular de las cepas de Paecilomyces sp. se logró mediante la

estandarización de los ITS. Los resultados son relevantes, porque las cepas entomopatógenas

nativas aisladas de los cultivos de cacao contaminados, fueron identificadas como

Purpureocillium lilacinum, hongo de interés para el control biológico de enfermedades, como

la moniliasis, de acuerdo a los estudios de antagonismo in vitro realizados sobre

Moniliopthora roreri.

Palabras clave: Purpureocillium lilacinus, PCR, marcadores molecures, ITS, control

biológico.
 ABSTRACT

The biocontrol Paecilomyces is a fungus of biological interest due to its

entomopathogenic action against insects, phytopathogens and nematodes that affect different

plantations, generating significant economic losses for growers. Several studies have

demonstrated the role of Paecilomyces as an antagonist of phytopathogenic Moniliophthora

roreri causal of moniliasis, in the cultivation of cocoa in Norte de Santander, Colombia. In order

to molecularly characterize fourteen biochemical strains of Paecilomyces sp., isolated from

different cacao crops in the municipalities of Norte de Santander, Colombia, a protocol for

molecular identification was standardized by the polymerase chain reaction (PCR); Universal

transcripts (ITS) for fungi were used. The product of the amplicons obtained was checked with

agarose gel electrophoresis in Red gel and compared with the 1K molecular marker. The

generated ITS were sequenced and compared with the sequences in the gene bank (NCBI); For

this, BLAST and RDP sequence match, the results of the taxonomic analysis of the 500 bp

sequences of HC002, HC003, HC004, HC006, HS021, HS022, HZ002, GIAV2, GIAV3,

GIAV8, GIAV9 and GIAV13 against the base of Data from the NCBI indicate that these strains

have a percentage of identity between 87 and 100% in their total length with STI sequences

belonging to the species Purpureocillium lilacinum, GIAV12 belonging to Penicillium paxilli

and GIAV14 belonging to Penicillium copticola. The molecular characterization of the strains of

Paecilomyces sp. was achieved through the standardization of ITS´s. The results are relevant

because the native entomopathogenic strains isolated from contaminated cocoa crops were

identified as Purpureocillium lilacinum, a fungus of interest for the biological control of

diseases, such as moniliasis, according to studies of in vitro antagonism carried out on

Moniliopthora roreri.

Key words: Purpureocillium lilacinus, PCR, molecular markers, ITS, biological control.
 GLOSARIO

 Biocontrolador: organismo vivo utilizado con el objeto de controlar y prevenir la incidencia

de fitopatógenos en un cultivo y reducir el uso de fungicidas químicos.

 Cepa: conjunto de células homogéneas, o clones, que deriva de la reproducción de una célula

inicial única, seleccionada y aislada. También suele referirse a las cepas como colonias puras

de bacterias.

 dNTP: deoxinucleósido trifosfato. Se distinguen el dATP, dCTP, dTTP y dGTP. El grupo

trifosfato se encuentra siempre localizado en posición 5'. Son los precursores utilizados en

reacciones de polimerización de DNA. Por ej. en replicación de DNA y ensayos de PCR

 Electroforesis en gel: grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas

basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico.

La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una

técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrometría de

masas, PCR, clonación o secuenciación de ADN.

 Entomopatógenos: microorganismos que producen enfermedades a los insectos, siendo el

agente causal muy diverso. Penetran en la especie plaga a través del tubo digestivo o del

tegumento dando lugar a la expresión de la enfermedad que provoca la muerte del

hospedante. Los entomopatógenos son los únicos que no buscan de forma activa a sus presas,

a excepción de los nemátodos.

 Especie: (del latín species), o más exactamente especie biológica, es la unidad básica de

la clasificación biológica.

 Fitopatógeno : microorganismo que causa enfermedades en las plantas por medio de

disturbios en el metabolismo celular causado por la secreción

de enzimas, toxinas, fitoreguladores y otras sustancias, además, por la absorción de nutrientes

de la célula para su propio crecimiento. Algunos fitopatógenos pueden causar también

enfermedades por crecer y multiplicarse en el xilema y en el floema de la planta y, por ende,

por bloquear el transporte de agua y nutrientes desde la raíz hacia las hojas o el flujo

de savia desde las hojas hacia el resto de la planta.

 Género :categoría taxonómica que se ubica entre la familiay la especie; así, un género es un

grupo de organismos que a su vez puede dividirse en varias especies (existen algunos géneros

que son monoespecíficos, es decir, contienen una sola especie).

 ITS (Espaciadores internos transcritos): es el segmento ribosomal de ADN que se utiliza

rutinariamente para estudios de taxonomía y filogenia porque presentan una alta variabilidad

intraespecífica y se encuentran repetidos en tándem. La región ITS (ITS1-5.8S-ITS2) es el

marcador genético más frecuentemente secuenciado en hongos y es utilizado en general para

sistemática, filogenia e identificación de cepas a nivel de especie incluso por debajo de éste.

La región 5.8S es codificadora y conservada y muestra una baja variabilidad intraespecífica

que no permite la delimitación entre cepas de una misma especie, sinembargo la zona de los

ITS, que es una región no codificadora e hipervariable, permite el reconocimiento a nivel

interespecífico. Las diferencias en las secuencias nucleotídicas de las diferentes especies dan

lugar a fragmentos de distintos tamaños que son examinados por electroforesis. Los ITS1 e

ITS2 son secuencias de ARN no funcionales situadas entre el ARNr en el transcrito primario.
 Marcador molecular: segmento de ADN con una ubicación física identificable (locus) en un

cromosoma y cuya herencia genética se puede rastrear. Un marcador puede ser un gen, o

puede ser alguna sección del ADN sin función conocida. Dado que los segmentos del ADN

que se encuentran contiguos en un cromosoma tienden a heredarse juntos, los marcadores se

utilizan a menudo como formas indirectas de rastrear el patrón hereditario de un gen que

todavía no ha sido identificado, pero cuya ubicación aproximada se conoce. Los marcadores

se usan para el mapeo genético como el primer paso para encontrar la posición e identidad de

un gen. Son ampliamente utilizados en genética humana, vegetal, animal y microbiana.

Permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos

individuos, modifiquen éstas o no su fenotipo. Funcionan como señaladores de diferentes

regiones del genoma.

 Moniliasis: enfermedad causada por el hongo Moniliophthora roreri,un hongo que ataca

únicamente las mazorcas o frutos de cacao en cualquier edad, causando Pudrición de los

granos. A esta enfermedad también se le conoce como: Moniliasis del cacao, Pudrición

acuosa, Mano de Piedra, Helada, Mancha ceniza o enfermedad de Quevedo. La severidad del

ataque de la Monilia varía según la zona y época del año, de acuerdo con las condiciones

del clima. Aparentemente las temperaturas altas son más favorables para la diseminación de

la misma.

 Paecilomyces: Hongo generalmente entomopatógeno usado como biocontrolador, este

género posee diversas especies, siendo las más frecuentes P. lilacinus, P. tenuipes y P.

fumosoroseus. Ha sido observado su potencial antagonista sobre Lepidópteros, Coleópteros y

Orthópteros.
 PCR (reacción en cadena de la polimerasa): es una técnica de molecular cuyo objetivo es

obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un

mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde, esta

técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación

resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes

de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el

ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en

una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para

llevarla a cabo.

 Secuenciación del ADN : conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la

determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La

secuencia de ADN constituye la información genética heredable que forman la base de los

programas de desarrollo de los seres vivos (de procariotas, de eucariotas en el núcleo celular,

y en los plásmidos, en la mitocondria y en cloroplastos de las plantas).

 INTRODUCCIÓN

Actualmente es necesario solucionar de la manera más sustentable posible cualquier

inconveniente que se puedan presentar en la naturaleza, para garantizar un desarrollo sostenible.

Es por esto que, desde la biotecnología, se han diseñado metodologías para usar herramientas

biológicas en las diversas situaciones y no recurrir a tratamientos químicos. Tal es el caso de las

enfermedades en los cultivos de interés agrícola, donde se puede controlar o eliminar

enfermedades que llevan a la pérdida económica de estos con ayuda de microorganismos

biocontroladores, por ejemplo las bacterias antagónicas consideradas agentes de control

biológico para el manejo de fitopatógenos, como es el caso de Bacillus subtilis, que posee la

capacidad para inhibir el crecimiento y esporulación de una gama amplia de fitopatógenos (Ruiz-

Sánchez et al., 2016), lo cual permite reducir el uso de fungicidas químicos.

Por otra parte, se han distinguido hongos entomopatógenos causales de enfermedad y

posterior muerte de nematodos y fitopatógenos como Paecilomyces (Núñez-Camargo et al.,

2012), este se utiliza como un bionematicida y se considera un biocontrolador por su papel

antagonista. En ensayos in vitro realizados por Suárez y Rangel (2013), Paecilomyces sp.

presentó porcentajes de inhibición de crecimiento radial medio de 80.72 % para control biológico

de moniliasis, que es una enfermedad producida por Moniliophthora roreri, hongo que afecta el

cacao (Theobroma cacao), y es considerada como la enfermedad más severa del cacao causando

daños hasta del 100% en una plantación (Jaimes y Aranzazu, 2010).

 Dada la importancia socioeconómica que ha adquirido en Norte de Santander el cultivo

del cacao, es preciso identificar cuáles son las especies que ejercen efecto biocontrolador sobre

Moniliophthora roreri. Tal identificación se puede hacer de diversas maneras, ya sea por su

morfología macro y microscópica comparándolas con la bibliografía, pero este método no es

confiable ya que hay gran similitud entre los diferentes géneros. Por lo tanto se recurre a las

herramientas de identificación molecular basadas en el ADN de cada microorganismo usando

marcadores moleculares. Algunos marcadores moleculares utilizados para la identificación de

hongos son ITS (espaciadores internos de transcritos), correspondientes al ADNr, los cuales

permiten estudiar las regiones de ADNr polimórficas, pues son únicas para cada especie, y

determinar la correspondencia entre las secuencias de cada aislamiento con las incluidas en las

bases de datos determinando género y especie, como indica Suárez y Cabrales (2008); la región

ADNr (ITS-5.8s) también ha permitido caracterizar géneros y especies de hongos como

Metarhizium sp. (Ma4, Ma5 y Ma6) como Metarhizium anisopliae (Sanjaya et al., 2016).

En el presente estudio se estandarizo un protocolo de identificación molecular para

aplicarlo en cepas del biocontrolador Paecilomyces sp., y se identificó las especies nativas

aisladas con mayor potencial antagónico para control biológico de Moniliophthora roreri

conservadas en el Laboratorio de Biotecnología Molecular de la Facultad de Ciencias Agrarias y

del Ambiente de la UFPS.

 1

1 EL PROBLEMA

1.1 TITULO

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR MEDIANTE ITS DE AISLAMIENTOS DEL

ENTOMOPATÓGENO Paecilomyces sp. PERTENECIENTES AL LABORATORIO DE

BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA

SANTANDER.

1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las enfermedades causadas por hongos fitopatógenos son uno de los factores principales

del desplome en la calidad y producción de cacao, las enfermedades más comunes que atacan los

cultivos de cacao en Colombia son la ‘escoba de bruja’, enfermedad causada por el hongo

Moniliophthora perniciosa, antes conocido como Crinipellis perniciosa (Meinhardt et al., 2014)

y la Moniliasis, enfermedad causada por el hongo Moniliophthora roreri , esta última es

considerada como la enfermedad más severa del cacao causando daños hasta del 100% en una

plantación (Jaimes y Aranzazu, 2010).

Para controlar esta enfermedad y evitar las altas perdidas económicas, se ha recurrido al

control biológico, implementando organismos vivos nativos para la erradicación o reducción de

este fitopatógeno. Para que sea optimo este tipo de control, debe ser utilizado conjuntamente con

otros microorganismos (Sánchez y Garcés, 2012). En Perú se encontraron resultados promisorios

utilizando una combinación de Trichoderma sp., Clonostachys rosea y C. byssicola para

controlar M. roreri (Krauss et al., 2003). En Colombia se reportan inhibiciones hasta de 95% en

el crecimiento bajo condiciones de laboratorio de M. roreri con diferentes cepas controladoras de

 2

crecimiento como Trichoderma sp. (Suárez, 2006) ,89% con Bacillus brevis y 80,72% con

Paecilomyces sp. (Suárez y Rangel, 2013).

En el banco de cepas ubicado en la sede de Campos Elíseos de la Universidad Francisco

de Paula Santander, Colombia, se han conservado aproximadamente 75 especies de hongos

provenientes de diversos proyectos, entre ellos las 14 cepas nativas del biocontrolador

Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biotecnología Molecular, aisladas de los

municipios de Sardinata, Tibu, El Zulia y Cúcuta cuyo porcentaje de inhibición de crecimiento

de Moniliopthora roreri es hasta 81% en ensayos in vitro (Suarez y Rangel, 2013), las cuales han

sido clasificadas utilizando técnicas de identificación macroscópicas, microscópicas

(observación de las estructuras celulares y las colonias) y bioquímicas, sin embargo, esta

clasificación no es del todo confiable, ya que hay diferentes géneros que presentan similitud en

su aspecto externo y en su ruta metabólica, razón que puede llevar a una confusión en la

clasificación de los microorganismos y por ende a usos incorrectos.

Con el fin de identificar la especie de catorce de las cepas biocontroladoras de

Paecilomyces sp., aisladas de diferentes cultivos de cacao en municipios de Norte de Santander,

Colombia, se propone un protocolo para la caracterización molecular mediante la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) usando espaciadores internos transcritos (ITS) para hongos y de

esta manera establecer con certeza la identidad de este antagonista de M. roreri para su control

biológico.

1.2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ¿Al identificar molecularmente los aislamientos

del género Paecilomyces presentes en el banco de cepas aisladas en el Laboratorio de

Biotecnología Molecular de la Universidad Francisco de Paula Santander, nativas del

 3

Departamento Norte de Santander mediante ITS permitirá presentar una clasificación

taxonómica acertada y diferente al presunto género y especie?

1.3 JUSTIFICACIÓN

En el departamento de Norte de Santander hay diversidad de cultivos alimenticios, y en

cada uno de ellos hay una gran riqueza de microorganismos como hongos. Los estudiantes de

Ingeniería Biotecnológica de la Universidad Francisco de Paula Santander, a través de diversas

investigaciones que han llevado a cabo en cultivos de cacao en el departamento, han logrado

aislar de este cultivo un número considerable de hongos, los cuales han sido clasificadas según

sus características macroscópicas y microscópicas de manera poco confiable; tal es el caso del

género Paecilomyces sp. hongo de interés biológico debido a su acción entomopatógena frente a

insectos, nemátodos y fitopatógenos como Moniliophthora roreri, causal de la moniliasis que

afecta plantaciones de cacao, generando pérdidas económicas especialmente para los cocoteros

de la región.

Una herramienta para la correcta identificación molecular de los hongos, es amplificando

la región intergénica (ITS) de los genes ribosomales mediante la técnica de amplificación por

reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual es muy usada debido a su alta especificidad y

confiabilidad, basada en el estudio de los genes del organismo analizado, determina su verdadera

clasificación comparándolo con otras especies, determinando la variabilidad de la misma

especie, o entre especies del mismo género.

Con el fin de identificar la especie de las cepas Paecilomyces sp., aisladas de diferentes

cultivos de cacao en municipios de Norte de Santander, Colombia, es importante estandarizar un

 4

protocolo para la caracterización molecular mediante PCR utilizando ITS eficientes para este

hongo y así establecer con certeza la o las especie del hongo antagonista de que se habita en los

cultivos del cacao.

1.4 OBJETIVOS DEL PROYECTO

1.4.1 Objetivo general Identificar molecularmente mediante ITS los aislamientos del

entomopatógeno Paecilomyces pertenecientes al laboratorio de Biotecnología Molecular de la

Universidad Francisco de Paula Santander, Colombia.

1.4.2 Objetivos específicos

 Reactivar las cepas de Paecilomyces sp, en medios óptimos para su desarrollo.

 Estandarizar un protocolo para la identificación molecular para el biocontrolador

Paecilomyces sp. mediante ITS.

 Determinar las secuencias obtenidas de los fragmentos ITS para el biocontrolador

Paecilomyces sp., para definir las especies de Paecilomyces sp. pertenecientes al laboratorio de

Biotecnología Molecular.
 5

2 MARCO REFERENCIAL

2.1 ANTECEDENTES

 Ziems, H. M. P. (2011). Caracterización fenotípica y molecular de hongos filamentosos

oportunistas: scedosporium, acremonium, phialemonium, lecythophora y paecilomyces: tesis

doctoral (Doctoral dissertation, Universitat Rovira i Virgili. Faculat de Medicina i Ciències

de la Salut).

En este proyecto se escogieron cinco géneros de hongos anamórficos, que por la gravedad

de las infecciones que causan algunas de sus especies y por la confusa taxonomía que presentan,

su estudio representa un verdadero reto para los microbiólogos clínicos e investigadores en

general. Dichos géneros son Scedosporium, Acremonium, Phialemonium, Lecythophora y

Paecilomyces.

 Ayra, L., Cabrera, I., Gómez, M., y Hernández, D. (2001). Empleo de marcadores

bioquímicos y de DNA en la caracterización molecular de hongos entomopatógenos. Dpto.

de ácaros y hongos entomopatógenos, Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical

(IIFT). Habana.

Presenta una revisión sobre el tema de los marcadores moleculares en hongos

entomopatógenos exponiendo el principio teórico de cada marcador, sus ventajas y desventajas,

así como algunas de sus más importantes aplicaciones.

 Inglis, P. W. Tigano, M. S. (2006). Identificación y taxonomía de algunos aislamientos

entomopatógeno Paecilomyces spp. (Ascomycota) utilizando rDNA-SUS

secuencias. Genética y Biología Molecular vol. 29, no 1, p.132-136.

 6

En esta investigación, se realizó un análisis filogenético del rDNA 5.8S y el espaciador

transcrito interno (ITS1 e ITS2) de entomopatógenos Paecilomyces encontrándose gran variedad

de especies como, Paecilomyces variotii y Paecilomyces leycettanus, Sin embargo, la mayoría de

P. lilacinus y P. marquandii aislados formaron un subgrupo distinto y alejado, mientras que el

otro subgrupo importante contenía Paecilomycesfarinosus, amoeneroseus Paecilomyces,

Paecilomyces fumosoroseus y Paecilomyces tenuipes.

 Vidal, Daniel. (2007).Identificación y caracterización biotecnológica de especies de

hongos filamentosos de interés agroalimentario .Instituto Nacional de Investigación y

Tecnología Agraria y Alimentaria-INIA.

El objetivo general de este proyecto fue la consolidación de una colección de hongos

filamentosos de relevancia en la industria agroalimentaria en la que cada ejemplar se encuentre

identificado, por medio de análisis de los fragmentos de restricción del DNA ribosómico (rDNA-

RFLPs) para su posterior secuenciación del fragmento de amplificación que incluye las regiones

ITS1, ITS2, y el gen que codifica el 5,8S rRNA. Después de una aproximación a varios

marcadores moleculares, se han estudiado las secuencias del espacio intergénico ITS1 del rDNA

y las secuencias del factor de translación elongación.

 Becerra, V., Paredes, M., Rojo, C., & France, A. (2007). RAPD e ITS Detectan

Variación Molecular en Poblaciones Chilenea de Beauveria bassiana.Agricultura

técnica, 67(2), 115-125.

En este estudio, se analizaron 36 aislamientos de B. bassiana provenientes de diversas

regiones geográficas del país. El análisis genético se realizó mediante el ADN Polimórfico

Amplificado al Azar (RAPD) y la Reacción en Cadena de la Polimerasa-Fragmentos de

 7

Restricción Polimórficos (PCR-RFLP) de los espaciadores internos transcritos (ITS) de las

secuencias ribosomales del ADN (ITSrDNA). El análisis de RAPD indicó una alta diversidad

genética entre los aislamientos, con un promedio de 43% de similitud. Por otro lado, el análisis

de los ITS determinó una menor diversidad, con un 83% de similitud entre aislamientos. La

región ITS 1 mostró un mayor número de sitios de restricción que la región ITS2. Los RAPD

fueron más eficientes para discriminar (o identificar) entre cepas debido al bajo número de

haplotipos detectados con los ITS. Para los dos marcadores utilizados en este estudio, la

diversidad genética no estuvo asociada con el origen geográfico de los aislamientos.

 Hernández-Leal, T. I., Carrión, G., & Heredia, G. (2011). Solubilización in vitro de

fosfatos por una cepa de Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson.Agrociencia, 45(8), 881-

892.

La eficiente capacidad solubilizadora de Paecilomyces lilacinus hacia los fosfatos de

calcio y en menor medida hacia los fosfatos de hierro fue comprobada in vitro. Este hongo

nematófago usado con fines de control biológico tiene el potencial para favorecer la

disponibilidad de fósforo en el suelo, en presencia de fosfatos de calcio. Sin embargo, es

necesario realizar experimentos en condiciones de invernadero y campo, para evaluar la

solubilización de los compuestos fosfatados al interactuar con los microorganismos del suelo.

 González, M. Amaya, I. Berlanga, A. Lara, F.Aguilar, C.Rodríguez, Raúl.

(2012). Aislamiento, cultivo e identificación morfológica y molecular de hongos

entomopatógenos. BioTecnology. 6, 386-395.

En esta investigación se realizó la identificación morfológica y molecular de cepas de

hongos caracterizados como entomopatógenos y de otros que fueron aislados de suelos

cultivados a través de la infección del insecto Tenebrio molitor. La identificación morfológica se

 8

llevó a cabo por observación microscópica y macroscópica. Para la identificación molecular, se

recurrió a la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para posteriormente detectar

variaciones en las secuencias nucleotídicas de los productos amplificados y poder diferenciar el

género y la especie de los hongos analizados.

 Almaraz-Sánchez, A., Alvarado-Rosales, D., Tlapal-Bolaños, B., & Espinoza-Victoria,

D. (2012). Identificación de hongos antagonistas a Phytophthora cinnamomi Rands en

bosques de encino del Arrayanal, Colima y Tecoanapa, Guerrero. Revista Chapingo. Serie

ciencias forestales y del ambiente, 18(3), 341-355.

El objetivo del estudio fue identificar morfológica y molecularmente la micoflora que

posee propiedades antagonistas sobre Phytophthora cinnamomi, asociada al suelo del bosque de

encino (Quercus sp.) de El Arrayanal, Colima, y de Tecoanapa, Guerrero. Los hongos se

caracterizaron molecularmente amplificando la región intergénica (ITS) de los genes ribosomales

mediante la técnica de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).Los

aislamientos de Trichoderma, Cordyceps bassiana y Paecilomyces son los que ejercieron mejor

biocontrol al reducir el desarrollo de P. cinnamomi mostrando mecanismos sobresalientes de

competencia por espacio y micoparasitismo.

 San Román Lazo, M. L. (2012). Caracterização e patogenicidade de fungos

entomopatogênicos isolados do percevejo-bronzeado do eucalipto, Thaumastocoris

peregrinus (Hemiptera: Thaumastocoridae).

Este trabajo tuvo como objetivo realizar la caracterización morfológica, biológica, patogénica y

molecular de Paecilomyces sp. Aislado de T. peregrinus. También se realizó un estudio de

infección del insecto como biocontrolador, visualizado por medio del uso de microscopía

electrónica de barrido.
 9

 Suárez L., y A. Rangel. (2013). Aislamiento de microorganismos para control biológico

de Moniliophthora roreri. Acta Agronómica. 62: 370-378.

En esta investigación se evaluaron microorganismos de control biológico de M. roreri en

Norte de Santander, Colombia. Los mejores porcentajes de inhibición de crecimiento radial

(PICR) se alcanzaron con Paecilomyces sp. (HC002) vs M. roreri, con una media de 80.72%,

seguido del tratamiento con Paecilomyces sp. (HZ002) vs M. roreri con 79.45%. Se demostró

que el hongo Paecilomyces sp.también tiene un alto potencial antagónico in vitro frente a M.

roreri.

 Figueroa M., W., J.A. Ramírez S. y A.K. Sigarroa R. (2013). Efecto de las cepas nativas
Paecilomyces sp.. (Bainier) y Lecanicillium sp. (Zimm) en el control de Carmenta

foraseminis Eichlin (Lepidoptera: Sesiidae) en cultivos de cacao (Theobroma cacao L.). Acta

Agronómica, Palmira, 62: 276-289.

El pasador del fruto, Carmenta foraseminis Eichlin, es un insecto que ha acentuado su

ataque en cultivos de cacao (Theobroma cacao L.) en los últimos años en Norte de Santander

(Colombia). El objetivo de este estudio fue evaluar la patogenicidad de las cepas nativas

Paecilomyces sp. Lecanicillium sp. sobre larvas de C. foraseminis. Para el efecto, se realizaron

aislamientos a partir de muestras de suelo recolectadas en el municipio de Tibú, Norte de

Santander. La infección fue realizada mediante inmersión de larvas en las suspensiones de los

aislados en concentraciones de 0, 106, 107 y 108 conidios/ml. En ambos aislados se observó una

tendencia lineal respecto a la mortalidad, la cual fue directamente proporcional a las

concentraciones del inóculo.

 Suárez, L. (2016). Identificación molecular de aislamientos de Moniliophthora roreri en

huertos de cacao de Norte de Santander, Colombia. Acta Agronómica, 65(1), 51-57.

 10

En este estudio, 56 aislamientos de M. roreri fueron obtenidos de 8 municipios y

corregimientos del departamento. El Zulia, (8 aislamientos); Cúcuta, (7 aislamientos); Tibú (5

aislamientos); Sardinata (6 aislamientos); Bucarasica (11 aislamientos); Teorama (5

aislamientos); Agua clara (6 aislamientos); El Tarra (8 aislamientos) con fines de extracción de

ADN y análisis de PCR. Las regiones ribosomales “ITS” (espaciadores internos de transcritos)

correspondientes al ADNr 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 y 25S, fueron amplificadas y secuenciadas.

Amplicones de 600 pb (8 aislamientos); 740 pb (12 aislamientos) y de 750 pb, para los 36

aislamientos restantes fueron obtenidos. Los tamaños de los amplicones corresponden a los

esperados para la especie M. roreri, y los análisis de “BLAST” confirman este nivel de

caracterización.

 Alean C, I. Morales R, A. Holguín A, C.y Bellotti, A. (2004). Patogenicidad de diferentes

hongos entomopatógenos para el control de Aleurotrachelus socialis (Homoptera:

Aleyrodidae) bajo condiciones de invernadero. Revista Colombiana de

Entomología, 30(1), 29-36

El principal objetivo de este estudio fue determinar la patogenicidad de aislamientos de

hongos entomopatógenos de las especies Beauveria bassiana, Verticillium lecanii y

Paecilomyces fumosoroseus sobre huevos, ninfas y adultos de Aleurotrachelus socialis bajo

condiciones de invernadero. El aislamiento CIAT 215 de Verticillium lecanii fué seleccionado

como el aislamiento más promisorio para el control de A. socialis por presentar los niveles

mayores de infección sobre los diferentes estados de desarrollo del insecto bajo condiciones de

invernadero. El estado de desarrollo de A. socialis más susceptible a los hongos

entomopatógenos es el de huevos próximos a eclosionar, esto favorece el manejo del insecto

 11

pues se reflejaría en un menor consumo de la savia elaborada y la disminución de pérdidas en

rendimiento.

 Suárez, L. (2006). Aislamiento e identificación de Moniliophthora roreri causante de la

moniliasis en municipios del nororiente colombiano y ensayos preliminares para su control

biológico. Universidad Francisco de Paula Santander.Revista Respuestas. Año 11, No. 1: 3-

8.Cúcuta, Norte de Santander.

Este proyecto de investigación definió las zonas de influencia de la moniliasis. Se aisló e

identificó el hongo Moniliophthora roreri como causal de la enfermedad. Se realizaron pruebas

preliminares de inhibición antagónica mediante la técnica Igarashi con Trichoderma sp., donde

se evidenció la posibilidad de controlar biológicamente al fitopatógeno Moniliophthora roreri.

Se obtuvieron resultados preliminares favorables del 55% de inhibición antagónica.

 Suárez L. y C. Cabrales. (2008). Identificación de especies de cepas nativas de

Trichoderma sp., Bacillus sp. y evaluación de su potencial antagonista in vitro frente al

hongo fitopatógeno nativo Moniliophthora roreri en el departamento de Norte de

Santander. Universidad Francisco de Paula Santander. Revista Respuestas. Año 13, No. 1:

45-56. Cúcuta, Norte de Santander.

Se evaluaron seis cepas del hongo Trichoderma sp. las cuales para determinar su potencial

antagónico frente a siete cepas nativas del hongo fitopatógeno Moniliophthora roreri.

Estableciendo que, durante los 8 días de evaluación, se ejerció un efecto antagónico e

hiperparásitico significativo de (a=0.05) por parte de las cepas de Trichoderma sp. frente las

cepas de M. roreri, las cepas del hongo antagónico fueron identificadas molecularmente

mediante ITS como Trichoderma asperellum y Trichoderma longibrachiatum.

 12

 Suárez, L. (2005). Extracción y purificación del ADN de Moniliophthora roreri hongo

que ataca el cacao, en Norte de Santander. Universidad Francisco de Paula Santander.

Revista Respuestas. Año 10, No. 2: 3-7.

Esta investigación tuvo como objetivo definir la metodología de extracción de ADN y

purificación para Moniliophthora roreri y aplicarla a 56 aislamientos de Moniliophthora roreri

obtenidos en los municipios y corregimientos de Cúcuta, Agua Clara, Sardinata, El Tarra, Tibú,

Bucarasica, Teorama y El Zulia del departamento de Norte de Santander (Colombia). Una vez se

estandarizó el protocolo de extracción, se probó con otros hongos: Metarhizium sp, Botritys

cincrea, Fusarium culmorum, Phytophthora cinnamomi. Con este trabajo se pretende continuar

con la investigación en el área de Biología Molecular de Moniliophthora roreri y otros

fitopatógenos de importancia económica para la región, fomentando así la investigación.

 Quintero, L. (2014).Caracterización de La diversidad genética de Moniliophthora roreri

mediante la utilización del marcador molecular RAPDs en Norte de Santander,

Colombia. Universidad Francisco de Paula Santander. Tesis de grado.

Se evaluó la variación molecular de 14 aislamientos de M. roreri que fueron

obtenidos de siete municipios de Norte de Santander: El Zulia, Cúcuta, Sardinata, El Tarra,

Agua Clara, Tibú y Bucarasica. Se obtuvo los siguientes rangos de tamaños de amplicones

para cada oligo: Oligo 4 un rango de 300 a 3500pb, Oligo 8 de 300 a 2800pb, Oligo 10 de

350 a 3000pb y OPA 10 de 250 a 3500pb.Se realizó el análisis estadístico con XLSTAL

2014. Donde se obtuvo un dendograma para cada oligo, mostrando más polimorfismo OPA

10, con cinco agrupamientos, indicando que el aislamiento Ac (Agua Clara) y Ta2 (El Tarra)

son los más diversos genéticamente con un índice de similitud de 0.5 moderadamente bajo,

mientras que los aislamientos M16 (Agua Clara), S8 (Sardinata) presentaron un índice de
 13

similitud de 0.941 muy altos. En cuanto al oligo 4 el dendograma mostró tres agrupamientos,

el oligo 8, cuatro agrupamientos y el oligo 10, tres agrupamientos, indicando en todos los

casos un alto polimorfismo para Moniliophthora roreri con un rango del 98-100% de

polimorfismo. El análisis de coordenadas principales mostró una alta similitud genética entre

la población excepto en las antes mencionadas. Los aislamientos pertenecientes a El Zulia y

Cúcuta, registraron los más altos niveles de variabilidad genética con valores altos del índice

de Shannon: 0,668; el aislamiento de El Tarra mostró un índice de Shannon: 0,479 indicando

una moderada variabilidad genética y no baja. En cuanto al análisis de varianza molecular

(AMOVA) con el oligo 4, el porcentaje de variación dentro de los municipios fue del 98%,

para OPA 10 fue del 92%, y para el oligo 8 y 10 fue del 100%. Y la variación entre

municipios de Norte de Santander, para el oligo 4 fue del 2%, para OPA 10 fue del 8% y para

el oligo 8 y 10 fue del 0%.

2.2 MARCO TEÓRICO

2.2.1 Control biológico En solo 1995 se reportaron al menos 30 agentes comerciales para el

control de patógenos con origen en el suelo en el mercado mundial. Dentro de los diferentes

patógenos del suelo que atacan el sistema radical de tos cultivos se encuentra diferentes especies

de hongos de los géneros Fusarium, Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia y especies de

nematodos de los géneros Meloydogyne, Pratylenchus, Aphelenchus, entre otros, los cuales

ocasionan daños considerables a las plantas cultivadas (Wilson y Backman, 1999).

Algunos de los factores responsables del sustancial esfuerzo dirigido hacia el biocontrol

de patógenos del suelo y el relativo alto nivel de satisfacción (juzgado por el número de

productos comercializados) incluyen:

 14

 la falta de variedades de plantas resistentes para muchos patógenos del suelo.

 la ausencia de bactericidas y la escasa disponibilidad de funguicidas para el uso en

contra de patógenos del suelo.

 el alto costo de tratamientos con agentes químicos en campos grandes.

 la dificultad de proteger con un químico contra la infección tratando todo el lugar

debajo de la tierra.

 la relativa facilidad de proteger los lugares de infección usando semilla inoculada con

un agente de biocontrol.

 la gran abundancia de información sobre la ecología de los patógenos con origen en el

suelo comparado con los patógenos foliares.

De los diferentes organismos que se utilizan para el control biológico de patógenos del

suelo se encuentra Trichoderma harzianum, Trichoderma hamatum, Verticillium

biguttatum, aislamiento de Fusarium oxysporum no patogénico Fo47, y Paecilomyces lilacinus

(Khanet al., 2001)

2.2.2 Generalidades de Paecilomyces Paecilomyces es un género de hongos nematófagos,

familia Trichocomaceae, clase Eurotiomycetes, y perteneciente al phylum Ascomycota (Samson,

1974). Colonias de crecimiento moderadamente rápido (40-50 mm, PDA, 25 °C, 14 días), de

color rosa pálido a vináceo, de flocosas a pulverulentas. Conidióforos de hasta 500 µm de

longitud, rugosos, portadores de un compacto grupo de ramas hacia el ápice, en cuyos extremos

se desarrollan grupos (verticilos) de fiálides. Fiálides de base más o menos hinchada y cuello

largo (lageniformes), 7-10 x 2,5- 3,5 µm. Conidios en largas cadenas divergentes, subhialinos,

unicelulares, elipsoidales o fusiformes, 2-3 x 2-2,5 µm, lisos o ligeramente equinulados.

Clamidosporas ausentes (Figura 1). Hasta la fecha, se han descrito un total de 80 especies de
 15

Paecilomyces, de las cuales, ocho especies de Paecilomyces son oportunistas para el hombre,

pero las dos más frecuentes en el área agrícola son P. lilacinus y P. variotii. (Vera, 2007).

Figura 1. Morfología microscópica de Paecilomyces lilacinus.

(Fuente: Yasem de Romero et al., 2008)

Paecilomyces lilacinus es una de las especies más usadas en el área agrícola por su acción

entomopatógena y presenta hifas hialinas septadas, conidióforos de ramificación irregular, con

fialides y/o metulas de organización similar a las especies de Penicillium. Las fialides pueden

formarse directamente a partir de la hifa solitarios, en pares o múltiples, son delgadas y largas, de

base ancha, que se va estrechando en la parte distal, textura densamente algodonosa, color inicial

blanco y posteriormente lila, y por el reverso es amarillo o beige.

2.2.3 Mecanismos de acción de Paecilomyces Dentro de las diferentes estrategias que se tienen

para el manejo de plagas se encuentra el uso de hongos entomopatógenos entre los que

destacan Paecilomyces fumosoroseus, porque no contamina el ecosistema, respetando la fauna

benéfica y a los seres humanos, (Alatorre, 2004), además las plagas no suelen ser resistentes al

control biológico (Garza y Rivas, 2003).

 16

En general, la manera inicial de infección de los entomopatógenos es a través de las

esporas que se adhiere y germina sobre la cutícula del insecto penetrando dentro del hemocelo

para desarrollarse en el interior del insecto lo cual generalmente provoca su muerte, terminando

allí el desarrollo parasítico del hongo, posteriormente el micelio emerge del cadáver de este bajo

condiciones favorables (especialmente alta humedad) para formar el micelio característico sobre

el integumento del insecto muerto (Tanada y Kaya,1993). Las temperaturas presentes en la

mayoría de los agroecosistemas varían entre 10°C y 40°C y generalmente no afectan a estos

organismos (Ignoffo, 1992).

Los microorganismos antagonistas, que se emplean para el control de otros patógenos

actúan por diferentes mecanismos: hiperparasitismo, antibiosis, competencia de nutrientes y por

el nicho ecológico, las más frecuentes son las dos primeras. En su acción además intervienen

varios factores que pueden beneficiar o no la actividad antagónica del microorganismo como son

temperatura, pH, humedad relativa y la presencia de otros microorganismos, entre otras.

Paecilomyces lilacinus aplicado en concentraciones mayores a 107 U.F.C/ml parasita los

huevos y las hembras de los nematodos, causando múltiples deformaciones y reducción de la

eclosión; también produce toxinas que afectan el sistema nervioso de los nematodos y efectos

teratogénicos en las larvas (Hernández y Velasco, 2011). El crecimiento de este hongo sobre las

larvas afectadas, es generalmente blanco y posteriormente toma un color lila. Las conidias se

desprenden del cuerpo del insecto muerto y son esparcidas por el viento, ayudando así a que

otros insectos puedan ser afectados. Este hongo parasita los huevos y hembras de los nematodos

con la participación de enzimas líticas causando deformaciones que afectan el sistema nervioso a

pH ligeramente ácidos y destrucción de ovarios.

 17

Además de ser una herramienta sustentable, el control biológico presenta mejores

resultados que los productos convencionales para el tratamiento de plagas y enfermedades

agrícolas, como lo indica el estudio llevado a cabo en el sur de Tamaulipas (México), se realizó

un trabajo en tomate Cherry donde se evaluó la efectividad biológica de algunos productos para

el control de mosca blanca (Bemisia tabaci) durante el periodo del 2 de marzo al 25 de mayo de

1999, época donde el insecto alcanza su más alta densidad (Avila-Valdez y Hinojosa-Reyes,

2000);En los resultados de los muestreos se observó que los insecticidas biológicos a base de B.

bassiana y P. fumosoroseus se comportaron estadísticamente igual que los productos

convencionales: ENDOSULFAN Y AMITRAZ.

2.2.4 Métodos de reproducción de Paecilomyces Para la selección del método de reproducción

es importante tener en cuenta no sólo la factibilidad tecnológica y económica, sino el mecanismo

de acción ya que en el producto final deben estar presentes las estructuras infectivas y los

metabolitos activos de forma estable y con su mayor potencial biológico (Chet,1987).

Los aspectos a tener en cuenta son:

1. Selección de la cepa adecuada

2. Selección de un medio de cultivo con un balance de nutrientes que permita obtener un

desarrollo del hongo con el máximo potencial patogénico y con eficiencia económica.

3. La posibilidad tecnológica y económica de escalar el proceso a nivel de producción.

4. Formulación que permita periodos de almacenamiento prolongados, facilidad de

aplicación y estabilidad en condiciones de campo.

En general se emplean cuatro formas de producción;

 18

1. Cultivos sobre soportes sólidos en bandejas, frascos o bolsas.

2. Cultivos líquidos agitados en zaranda. (Fermentación sumergida)

3. Cultivos líquidos en condiciones estáticas (frascos)

4. Cultivos bifásicos, donde se realiza el inóculo en forma líquida agitado o estático y

posteriormente se pasa al soporte sólido

En la actualidad se encuentran en desarrollo en Cuba y en otros países tecnologías para la

reproducción masiva de hongos entomopatógenos y antagonistas mediante fermentación

sumergida en fermentadores de grandes volúmenes y en todos los casos es la etapa de recobrado

y formulación la que aún no ha sido resuelta eficientemente (López, 1992).

2.2.5 Identificación molecular de hongos Dentro del diagnóstico de microorganismos podemos

encontrar diversas estrategias para la detección, los métodos clásicos son los cultivos in

vitro, la tinción química (tinción de Gram, tinción de Giemsa y Wright, tinción argéntica,

tinción ácido periódico de Schiff, etc.) o las pruebas bioquímicas o inmunológicas (ensayo

inmunoenzimático ELISA, inmunofluorescencia directa IFD, inmunofluorescencia

indirecta IFI). Estos métodos son indirectos (no hay detección del ADN o ARN del

microorganismo) aunque son los más utilizados para la caracterización morfológica y fisiológica

de los microorganismos. Estas metodologías son menos precisas que las moleculares las

cualesestán basadas en la detección del genoma del microorganismo. Para poder usar un método

molecular debe conocerse parte del genoma o el genoma completo del microorganismo que se

pretende detectar, ya sea levadura, un hongo o una bacteria. Los métodos moleculares más

importantes que se utilizan en la actualidad son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),

la secuenciación y la electroforesis de campo pulsante (CHEF). Estos métodos son directos y nos
 19

indican la presencia o ausencia del material genético del microorganismo (Montiel, F. y Guzmán

D.1997).

2.2.5.1 Reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se

fundamenta en la propiedad natural del ADN polimerasa para replicar hebras de ADN, para lo

cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN

recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de

ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente (Figura 2). La reacción en cadena de

la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation

en California, en la década de 1980 (Bartlett & Stirling, 2003). Inicialmente la técnica era lenta,

ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario

agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las

fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se

emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas

temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos,

generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (Taq polimerasa), Pyrococcus

furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se

emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de

errores (Montiel y Kaltwasser, 1990).

 20

Figura 2. Amplificación de ADN a través de PCR.

(Fuente: Google, 2015)
2.2.5.2 Mezcla de reacción Para llevar a cabo la PCR, es necesario usar una mezcla de reacción

que contenga la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos que

servirán como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro

desoxirribonucleótidos triofosfato dATP, dGTP, dCTP y dTTP o una mezcla de dNTP´s

(Sambrook y Russel 2001). Esta mezcla se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a

una fase de desnaturalización, una de hibridación y una de elongación.

2.2.5.2.1 Marcadores genéticos Un marcador genético o marcador molecular es un segmento

de ADN con una ubicación física identificable (locus) en un cromosoma y cuya herencia

genética se puede rastrear. Un marcador puede ser un gen, o puede ser alguna sección del ADN

sin función conocida. Dado que los segmentos del ADN que se encuentran contiguos en un

cromosoma tienden a heredarse juntos, los marcadores se utilizan a menudo como formas
 21

indirectas de rastrear el patrón hereditario de un gen que todavía no ha sido identificado, pero

cuya ubicación aproximada se conoce. Los marcadores se usan para el mapeo genético como el

primer paso para encontrar la posición e identidad de un gen. Son ampliamente utilizados

en genética humana, vegetal, animal y microbiana. Permiten evidenciar variaciones

(polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen éstas o no su

fenotipo. Funcionan como un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no

corresponder a un gen (Picca et al, 2004).

Actualmente, la forma más certera de determinar los niveles de diversidad y estructura

genética intraespecífica es a través del uso de estos. Principalmente se han usado cuatro tipos de

marcadores moleculares para determinar la diversidad genética de hongos: los fragmentos de

restricción polimórficos (RFLP) (Maurer et al., 1997), el ADN polimórfico amplificado al azar

(RAPD) (Piatti et al., 1998; Gaitan et al., 2002), las secuencias simples repetidas (SSR)

(Kretzner et al., 2000); y los espaciadores internos transcritos (ITS) del ADNr (Buscott et al.,

1996; Coates et al., 2002). Todos estos marcadores han sido efectivos determinando diferencias

genéticas entre aislamientos, pero en forma complementaria y con un poder de discriminación

diferente entre ellos (Couteaudier et al., 1998).

La metodología mayormente usada en estudios de diversidad genética han sido en gran

medida las secuencias ribosomales nucleares, especialmente los ITS 1 y 2, mostrando tasas

diferenciales en cambios nucleotídicos, lo cual permite la comparación de aislamientos a nivel

inter e intraespecífico en hongos (Neuvéglise et al., 1994; Iturralde, 2005). Para amplificar las

regiones consideradas como secuencias conservadas ITS, se han diseñado cebadores universales

que amplifican estas zonas genéticamente conservadas para establecer su nivel de diversidad

(White et al., 1990).

 22

2.2.5.2.2 Espaciadores internos transcritos (ITS) El segmento de ADN a amplificar está

compuesto por dos hebras (a y b), para ello se utilizan dos oligonucleótidos llamados

«cebadores» o «primers», la secuencia de uno de los oligonucleótidos hibrida en uno de los

extremos del segmento y es complementaria a la hebra a, el segundo oligonucleótido hibrida en

el otro extremo del segmento y es complementario a la hebra b. Para que exista amplificación del

fragmento es imprescindible que ambos oligonucleótidos hibriden en secuencias

complementarias presentes en las hebras del ADN en estudio. La presencia de mutaciones en el

sitio de hibridación de cualquiera de los oligonucleótidos impide la amplificación del fragmento.

(Buscott et al., 1996).

Los espaciadores internos transcritos son regiones no codificantes de la secuencia de

ADN que separan los genes que codifican para los ARN ribosomales 28s, 5.8s y 18s; estos genes

de ARN ribosomales son altamente conservados a lo largo de la taxa mientras que los espacios

entre ellos pueden ser especie-específicos (Tabla 1).

Tabla 1. Cebadores más comunes para identificación de hongos.

Cebador Secuencia Región que amplifican
ITS 4 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´ Amplifican un segmento

ITS 5 5’GGAAGTAAAAG TCGTAACAAGG-3´ comprendiendo las secciones:

18s (parcial), ITS1, 5.8s, ITS2,

25s (parcial)

Las secuencias ribosomales nucleares, especialmente los ITS, han mostrado tasas

diferenciales en cambios nucleotídicos, lo cual permite la comparación de aislamientos a nivel

inter e intraespecífico en hongos (Neuvéglise et al., 1994); para amplificar las regiones ITS se
 23

han diseñado cebadores universales que amplifican estas zonas genéticamente conservadas para

establecer su nivel de diversidad (Figura 3) (White et al., 1990)

Figura 3. Representación esquemática del cluster del ARNr.

ETS: espaciador transcrito externo; NTS: espaciador no transcrito;
IGS: espaciador intergenico e ITS: espaciador interno transcrito
(Fuente: Baldwin et al., 1995)

La región ITS ahora es quizás la región de ADN secuenciado más ampliamente en los

hongos. Ha sido por lo general más útil para la identificación molecular a nivel de especie, e

incluso dentro de cada especie (por ejemplo, para identificar razas geográficas). Debido a su

alto grado de variación que otras regiones génicas de rDNA (SSU y LSU), la variación entre

individuo rDNA se puede observar tanto en el ITS y regiones IGS. Además de los cebadores

ITS1 estándar + ITS4 utilizados por la mayoría de los laboratorios, se han descrito distintos

cebadores, que permiten la amplificación selectiva de secuencias de hongos (Gardes y Bruns,

1993).

2.2.5.3 Termociclador Todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato

llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la

temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen
 24

uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo

la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una

buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi

todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar

la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este

sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte

superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos. (Schwartz DC y

Cantor CR, 1984).

2.2.5.4 Secuenciación del ADN Luego de la amplificación del ADN de interés, es necesario

secuenciar para determinar el orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un

oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable

que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos (de procariotas,

de eucariotas en el núcleo celular, y en los plásmidos, en la mitocondria y en cloroplastos de las

plantas). Así pues, determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación

básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como la

investigación forense. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente

la investigación y los descubrimientos en biología. Las técnicas actuales permiten realizar esta

secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de

secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados,

en ocasiones fruto de la colaboración investigadora a escala mundial, han establecido la

secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos.Entre

los segmentos más comúnmente amplificados y posteriormente secuenciados se encuentran los

genes ribosomales (16S en el caso de procariotas y 18S en el caso de eucariotas), los espacios
 25

entre el conjunto de genes ribosomales (espacios intergénicos IGS) y los espacios internos

transcritos (ITS) del conjunto de genes ribosomales (Butler, 2005).

2.3 MARCO LEGAL

El Convenio sobre la Diversidad Biológica (CDB), acordado en Río de Janeiro el 5 de

julio de 1992, reafirma la soberanía de los estados sobre sus recursos biológicos y genéticos y los

ubica como responsables de la conservación de la diversidad biológica y de su utilización

sostenible. Al mismo tiempo, el CDB estableció el compromiso de facilitar regímenes de acceso

bajo términos mutuamente acordados. Posteriormente, en el año 2000 en Colombia se expidió el

Decreto 309 sobre investigación en recursos biológicos, el cual reglamenta los permisos de

estudio con fines de investigación científica sobre diversidad biológica (PEFIC). Esta norma se

apoya en el principio constitucional que garantiza y promueve la libertad de enseñanza,

aprendizaje e investigación, así como en el deber del Estado de proteger la diversidad e

integridad del ambiente. De acuerdo con la Ley 99 de 1993 corresponde al Ministerio de

Ambiente y Desarrollo Sostenible, coordinar y promover la investigación sobre el medio

ambiente y los recursos naturales, establecer el Sistema Nacional de Información Ambiental y

organizar el inventario de biodiversidad y de los recursos genéticos nacionales, así como regular

la importación y exportación de especies de flora y fauna silvestres.

2.4 HIPÓTESIS

2.4.1 Hipótesis alternativa Mediante la técnica ITS se puede identificar molecularmente el

hongo entomopatógeno Paecilomyces aislado en cultivos de la región en el laboratorio de

Biotecnología Molecular ya que dicha información es importante para establecer usos acertados

de este microorganismo en la docencia, investigación y extensión; además es el primer paso para

 26

formular un protocolo de identificación de los demás hongos presentes en el Banco de cepas y

estrategias de manejo para el control de la moniliasis, enfermedad que causa grandes pérdidas al

sector cacaotero de Colombia.

 27

3 DISEÑO METODOLOGICO

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN

El tipo de investigación es cuantitativa y su enfoque cuasi-experimental, ya que se

establecieron procedimientos de investigación antes de llevar a cabo el estudio, prediciendo los

procesos observados y las causas de los fenómenos, controlando los factores contextuales que

podían interferir con la reactivación e identificacion del hongo, minimizando los posibles errores

a través de la modificación temperaturas y tiempos en el protocolo de PCR, haciendo posible la

replicación del protocolo de identificacion de Paecilomyces mediantes ITS estandarizado, para

lograr los objetivos propuestos.

3.2 UNIVERSO Y MUESTRA

3.2.1 Universo Se obtuvo como población cepas pertenecientes al género Paecilomyces sp.,

nativas de Cúcuta, El Zulia, Sardinata y Tibu, municipios de Norte de Santander.

3.2.2 Muestra Se trató como muestra las catorce cepas de este entomopatógeno, las cuales

representan la cantidad de aislamientos de Paecilomyces sp. reactivados de los diferentes

municipios tomados como población pertenecientes al Laboratorio de Biotecnología molecular.

3.2.3 VARIABLES
3.2.3.1 Variables dependientes Aislamiento del microorganismo, contaminación exógena

durante las fases de la investigación y secuenciación de ADN de las muestras (Tabla 2).

3.2.3.2 Variables independientes Sustratos para la purificación y conservación del hongo

Paecilomyces (Tabla 2).

3.2.3.3Variables intervinientes Las diferentes especies del hongo Paecilomyces presentes en el

Laboratorio de Biotecnología Molecular de la Universidad Francisco de Paula Santander (Tabla

2).
 28

Tabla 2.Operacionalizacion de variables en la identificacion molecular de Paecilomyces sp.

Variable Aislamiento del Contaminación Sustratos específicos Diversidad genética de los
microorganismo exógena para la purificación y hongos aislados
conservación del
hongo
Tipo de Variable Dependiente Dependiente Independiente Interviniente
Operacionalización Método por el cual se Tipo de Medio fijo en el que se Características genéticas dentro
puede obtener un contaminación que desarrolla el de cada especie.
cultivo puro de la cepa causada por agentes microorganismo.
de interés externos
Categorización Inoculación del contaminación por -Purificación en Diferencia en la identificacion
microorganismo equipos de laboratorio sustratos líquidos molecular entre los hongos
y transporte -Conservación en aislados y su presunto genero
sustratos solidos
Definición Crecimiento efectivo contaminación en -purificación y Presencia de diversos géneros y
del hongo en el agar incubadora, cuarto de conservación del especies en las cepas aisladas
PDA. siembra, movimiento hongo en agar PDA y del suelo Norte Santandereano
en el laboratorio caldo PDB

Indicador Proliferación del Perdida de inocuidad Desarrollo normal del Identificacion molecular
hongo de cada cepa en el hongo en medio de mediante ITS de cada
medio de cultivo cultivo en corto aislamiento
tiempo
Nivel de Medición Nominal Nominal Nominal Ordinal
Unidad de Medida Excelente crecimiento Nulo crecimiento del Calidad de ADN y Comparación de ADN en base
y pureza en caja Petri. microorganismo o tiempo que tarda el de datos
presencia de otro microrganismo en
microrganismo en la crecer en el medio de
caja Petri cultivo y
Índice Índice de pureza del Índice de Índice de crecimiento Índice de variabilidad genética
hongo en medio PDA contaminación externa hongo en medio PDA
Valor -Cultivo puro -Cepa no contaminada -Creció De una a catorce especies
-Cultivo impuro -Cepa contaminada -No creció
 29

3.3 FASES DE LA INVESTIGACIÓN

3.3.1 OBTENCION Y CONSERVACION DE Paecilomyces sp.

3.3.1.1 Obtención de cultivos puros de Paecilomyces sp. Inicialmente se obtuvieron 14

aislamientos del Laboratorio Biotecnología Molecular de la Universidad Francisco de Paula

Santander (Tabla 3), rotulados con diferentes códigos e identificados como pertenecientes al

género Paecilomyces sp.

Tabla 3. Códigos de cepas de Paecilomyces sp., existentes en el laboratorio de

Biotecnología Molecular de la UFPS.

NUMERO CODIGO CODIGO

ANTIGUO NUEVO

1 HA010 GIAV2

2 HA011 GIAV3

3 HA012 GIAV8

4 HA013 GIAV9

5 HA014 GIAV12

6 HA015 GIAV13

7 HA016 GIAV14

8 HS021 HS021
 30

9 HS022 HS022

10 HC002 HC002

11 HCOO3 HCOO3

12 HC004 HC004

13 HC006 HC006

14 HZ002 HZ002

Donde HA quiere decir Hongo Antagonista, por su parte las letras C, Z y S indican el

lugar del aislamiento tal como Cúcuta, Zulia y Sardinata respectivamente.

Las cepas fueron aisladas en diversos proyectos previos sobre control biológico de la

UFPS, entre ellos el proyecto titulado: “Aislamiento de microorganismos para control

biológico de Moniliophthora roreri”, realizado por Suárez y Rangel en el 2013 donde se

obtuvieron los aislamientos de Paecilomyces sp estudiados en este proyecto de los municipio

de Sardinata, Tibu, El Zulia y Cúcuta (Figura 4).

 31

Figura 4. Geografía de los aislamientos de Paecilomyces sp.

3.3.1.2 Conservación y depuración de los aislamientos de Paecilomyces sp. Para la

conservación se siguió el protocolo de desinfección previamente reportado por Suárez (2006) y

se sembró en cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) Composición: 200g de infusión de

papa, 20 g de glucosa y 15 g de Agar-agar; se incubaron a 28°C bajo monitoreo durante siete

días; luego se hicieron repiques en PDA hasta obtener cultivos puros para posterior siembra en

Caldo Papa Dextrosa (PDB).

 32

3.3.1.3 Caracterización microscópica de los aislamientos de Paecilomyces sp. El cultivo del

hongo se preparó en cámara humedad, y se utilizó el protocolo de González de Buitrago (2004),

que consistió en introducir en un caja Petri un disco de papel filtro y una varilla en forma de “V”,

que soporta un portaobjetos que contiene un trozo de medio de cultivo estéril muy delgado

(PDA) en el cual se inoculó el hongo por punción, luego el papel filtro se humedeció con 3

mL de agua estéril. La placa se incubó a 28 °C durante ocho días. Después, se cubrió la muestra

con Azul de lactofenol y se observó al microscopio. (Figura 5).

Observacion en
microscopio

Teñir con azul de

lactofenol

Preparacion de camara
humeda

Figura 5. Proceso para la observación microscópica de los aislamientos de

Paecilomyces sp.

3.3.1.4 Siembra de Paecilomyces sp. en caldo PDB A partir de los cultivos puros obtenidos en

PDA, se pasaron repiques en Erlenmeyer con caldo papa dextrosa (PDB) (Figura 6a), cuya

composición es: 200 g de infusión de papa y 20 g de glucosa; se mantuvo cada cultivo en

 33

zaranda durante 24 horas (Figura 6b) y luego se incubo cada uno por ocho días hasta obtener el

micelio totalmente formado (Suárez, 2004).

a b

Figura 6. Obtención del micelio de Paecilomyces a partir de PDB. a) Siembra de

Paecilomyces sp., en caldo PDB. b) Cultivos microbianos en caldo PDB en zaranda.

3.3.2 EXTRACCION DEL ADN DE Paecilomyces sp. El protocolo de extracción de ADN

para Paecilomyces sp. fue el propuesto por Suárez (2005). Al micelio que creció previamente

(0.5-0.75 g) en PDB, se le macero y trituro en una caja Petri y posteriormente se agregó en un

microtubo de 2 mL y se le adicionó un volumen de 500 mL de buffer de extracción (50 mM Tris-

HCl pH= 7,5; 50 mM EDTA; 2 % (p/v) de SDS y 1 % (p/v) de Na2SO3). Se procedió a macerar

la muestra con ayuda del rotor durante 1 min; luego se agitó en vortex por un minuto y

posteriormente se centrifugó a 6000 x g, por 10 min; el sobrenadante se incubó a 70 °C durante

15 min. Después, se adicionó un volumen fenol/cloroformo de (1:1) a cada muestra y se

centrifugó a 10.000 x g, por 10 min. Se transfirió la fase acuosa a otro microtubo y se le agregó

un volumen de isopropanol. Se dejó en congelación 10 min, nuevamente se centrifugó a 10.000 x

g, durante 10 min, el precipitado se secó a 37 °C, se resuspendió en 50 mL de TE 1X pH= 8 y se

adicionó 1 µL de RNAsa (4 mg mL-1) Promega, a cada extracción. (Figura 7).

 34

1.OBTENCIÓN DEL 2. TRITURACION 3. OBTENCION DE 4. ADICIONAR 500 µl

MICELIO A PARTIRA DEL MICELIO LA MUESTRA A BUFFER
DEL CALDO PDA EXTRAER. EXTRACCION

5. MACERAR LA
MUESTRA CON 6. VORTEX 7. CENTRIFUGAR A 8. INCUBAR AL
PISTILO DURANTE DURANTE 1 min 6000 rpm POR 10 BAÑO MARIA A 75
1min . min °C DURANTE 15 min

9. AGREGAR FENOL- 10. CENTRIFUGAR 11. TRANSFERIR LA 12. AGREGAR

CLOROFORMO A 10000 rpm POR 10 FASE SUPERFICIAL A ISOPROPANOL EN
PROPORCION 1:1 min OTRO MICROTUBO PROPORCION 1:1

13. MANTENER EN 14. DESCARTAR 15. DEJAR SECAR A 16. AGREGAR 50 µl DE

CONGELACION SOBRENADANTE T° AMBIENTE TE Y 1 µl DE RNAsa a
DURANTE 15 min cada extraccion.

Figura 7. Protocolo de extracción de ADN hongos

3.3.3 PURIFICACION Y VERIFICACION DEL ADN de Paecilomyces sp. Para la

purificación de las extracciones de ADN se utilizó etanol y fueron verificadas mediante

electroforesis en un gel de agarosa al 0.7 % (p/v) en solución de Buffer TBE 1X (Tris base PM

121.14, ácido bórico PM 61,84 y EDTA 0,5 M, pH 8,0) propuesto por Suárez (2005) (Figura 8a).

Para la preparación de la muestra, se tomó 8 µL del ADN extraído y se agregó 2µL de buffer de

carga Merck (Figura 8b); durante la preparación del gel, se adicionó 2µL de bromuro de etidio;
 35

la electroforesis se corrió a 100 V durante 20 min en cámara y fuente de poder de Biorad (Figura

8), se visualizó en el transiluminador UV, y se cuantifico el ADN en el Nanodrop.

a.

Pesar 0.28 Disolver en 40 ml de Enfriar, agregar 2µl

de Bromuro de etidio colocar el
gramos de TBE 1X y calentar a polimerizar y llevar
agarosa 75°C en plancha y agregar en la cubeta
armada a la camara
b.

Agregar 2 μl de
Buffer de Carga Cargar la Llevar a la
Agregar 8 μl de muestra en el cámara de conectar a la fuente de
ADN al pozo Electroforesis poder
microtubo

Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa.a) Preparación de la muestra de ADN para introducir

en los pozos. b) Preparación del gel de agarosa para electroforesis al 0.7%.

3.3.4 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Se amplificó la región ITS

mediante iniciadores ITS4 e ITS5, se utilizó el protocolo propuesto por Suárez (2016) como

sigue: La reacción de PCR se llevó a cabo en tubos de 0,5 mL con un volumen final de 25 µL

que contenía: 1 µL de ADN, 16,65 µL de agua nanopura Merck, 0,75 µL de MgCl 2 (1,5 mM)

TucanTaq, 2.5 µL de Buffer (1X) TucanTaq, 1.25 µL de ITS 4(0.5 mM), 1.25 µL de ITS 5 (0.5

mM) Macrogen, 0.1 µL de Taq polimerasa Promega, 0.5 µL de DNTP’s (0.2 mM) Bioline.

La reacción se realizó en un termociclador (CFX96™ Touch Real-Time PCR,) y

se utilizó el siguiente programa: 94 ºC por 5 min para la desnaturalización inicial, seguido

de 35 ciclos de 30 segundos 94 ºC para la desnaturalización, 58 ºC por 1 min para el

 36

anillamiento y 72 ºC por 1 min para la extensión; se finalizó con una elongación de 72 ºC por 10

min (Figura 9). También se utilizaron los ITS1 e ITS2 con las condiciones antes mencionadas.

Los amplicones fueron observados en gel de agarosa al 1.5 % (p/v), se utilizó gel Red como

intercalante para el ADN y la electroforesis se corrió a 100 V por 1 hora.

Paso 1:
Desnaturalización
94 ° C 1min
Paso 2:
PCR

35 ciclos
Hibridación
52 ° C 45 seg
Paso 3:
Extensión
72 °C 1 minuto

Figura 9. Protocolo y Termociclador CFX96™ Touch Real-Time usado para PCR.

3.3.5 SECUENCIACIÓN DE LOS FRAGMENTOS ITS Y COMPARACION DE

SECUENCIAS CON BASES DE DATOS Los amplicones ITS generados fueron enviados al

laboratorio de Corpogen donde secuenciaron el resultado de PCR obtenido usando el

aecuenciador ABI PRISM® 3730XL Analyzer (Figura 10); posteriormente los resultados de la

secuenciación de cada aislamiento se compararon con las reportadas en el NCBI utilizando

BLAST y RDP sequence match (programas informáticos de alineamiento de secuencias). Se

comprobó la secuencia problema con una gran cantidad de secuencias que se encontraron en

la base de datos y se indicó el género y la especie correspondiente a cada cepa.

 37

SECUENCIACIÓN

Figura 10. Secuenciador ABI PRISM® 3730XL Analyzer

 38

4 DISCUSION Y RESULTADOS

4.1 OBTENCION Y CONSERVACION DE Paecilomyces sp.

Inicialmente se obtuvieron 18 cepas de Paecilomyces del laboratorio de Biotecnología

Molecular, pero algunas cepas tenían un código antiguo que coincidía con uno nuevo y de las

otras cepas no se logró la reactivación debido a la pérdida de humedad y el agotamiento de la

fuente de carbono del medio PDA en el que estuvieron conservadas (Figura 11) (Pinzón et al.,

2009).

Figura 11. Cepa de Paecilomyces con agar agotado.

Por lo tanto se continuo esta investigación con catorce cepas de Paecilomyces sp que se lograron

reactivar.

4.1.1 Obtención de cultivos puros de Paecilomyces sp. Luego de incubar la cepa en PDA, en

cajas Petri, se sembró cada cepa en viales distintos para purificarlas (Figura 12), luego se

hicieron repiques nuevamente en cajas Petri para su purificación.

 39

Figura 12.Repiques de cepas a identificar en viales para su purificación.

4.1.2 Descripción macroscópica de aislamientos de Paecilomyces sp. Luego se purificaron las

cepas en agar PDA, y posteriormente se observó morfológicamente, desde el color hasta la

textura del micelio para cada cepa (Tabla 4), las cuales presentaron color rosa-grisáceo típico de

Paecilomyces.
 40

Tabla 4. Caracterización macroscópica de cada cepa de Paecilomyces sp.

MACROSCOPIA DE LOS AISLAMIENTOS DE Paecilomyces sp.

CODIGO CARACTERISTICAS CARACTERISTICAS CARACTERÍSTICAS

FRONTALES ENVES MACROSCÓPICAS

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

esporuladas en agar PDA presentan un color rosa - grisaceo ,
HZ002 textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

HS021 esporuladas en agar PDA presentan un color rosa - grisaceo ,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.
 41

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

HS022 esporuladas en agar PDA presentan un color rosa-grisaceo,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

HC002 esporuladas en agar PDA presentan un color rosa-grisaceo,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.

HC003
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar
esporuladas en agar PDA presentan un color rosa-grisaceo,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.
 42

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

HC004 esporuladas en agar PDA presentan un color rosa - grisaceo ,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

HC006 esporuladas en agar PDA presentan un color rosa-grisaceo,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.

En agar PDA presentan un color rosa-grisaceo, textura

GIAV2 polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.
 43

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

GIAV3 esporuladas en agar PDA presentan un color rosa-grisaceo,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

GIAV8 esporuladas en agar PDA presentan un color rosa-grisaceo,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

GIAV9 esporuladas en agar PDA presentan un color rosa-grisaceo,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.
 44

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

GIAV12 esporuladas en agar PDA presentan un color verde-grisaceo,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

GIAV13 esporuladas en agar PDA presentan un color purpura-
grisaceo, textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.

Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar

GIAV14 esporuladas en agar PDA presentan un color verde-grisaceo,
textura polvorienta, borde irregular y color de reverso beige.
 45

4.1.3 DESCRIPCION MICROSCOPICA DE AISLAMIENTOS DE Paecilomyces sp. El hongo

Paecilomyces visto en un microscopio Olympus con cámara incorporada presentó en su morfología

conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con metulas cortas y fialides con

el ápice puntiagudo, de donde nacen los conidios lisos o equinulados, (Figura 13).

Figura 13. Partes del hongo:(1) Conidióforo,(2) Métula,(3) Fialide,(4) Conidia y (5)Septos

Tal como lo indican Arias y Piñeros (2008). Así mismo se formaron largas cadenas, sin

ramificar, con aspecto característico de pincel, según Barnett y Hunter (1999) (Figura 14).

a b c

Figura 14.Microscopia de las cepas a 40X. a y b) Morfología microscópica característica del

grupo 2 (HC002). c) Morfología microscópica de GIAV 14.

4.1.4 Siembra de Paecilomyces sp. en caldo PDB Luego del tiempo de incubación, se obtuvo el

micelio de cada una de las cepas totalmente formado en el caldo PDB (Figura 15).
 46

a. b.

c.

Figura 15. Crecimiento del micelio de Paecilomyces sp.en caldo PDB.a) Vista frontal del
micelio; b) Características típicas del micelio GRUPO 1; C) Micelio GRUPO 2.

4.2 EXTRACCION Y VERIFICACION DEL ADN de Paecilomyces sp.

Luego de la siembra del hongo el caldo PDB, para obtener el micelio, se seleccionaron las

mejores siembras y se procedió a la extracción del ADN siguiendo el protocolo establecido en la

metodología, se obtuvo aproximadamente entre 1 a 2 g/ l de ADN a partir de esta extracción, cantidad

suficiente para realizar pruebas moleculares (Suárez, 2005), de los que se escogieron las más

sobresalientes de acuerdo a su calidad y cantidad de pellet de ADN obtenido.

Las extracciones de ADN, se chequearon en el gel después de corrida la electroforesis y se

visualizó una buena cantidad (Anexo 1) y calidad de ADN, (Figura 16); cada extracción se cuantificó

en el Nanodrop Thermo Scientific 2000 c, y se indicó que con una concentración mínima de 743.5 ng

µ𝐿−1 para HS021 y una máxima de 1591.6 ng µ𝐿−1para HS022, se consiguieron amplicones después de

realizar la PCR.
 47

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Figura 16. Verificación de calidad de ADN, mediante electroforesis de ADN en gel de agarosa al
1% de las extracciones de ADN. 1. HZ002; 2. HS021; 3.HS022; 4.HC002; 5.HC003; 6.HC004; 7.HC006;
8.GIAV2; 9.GIAV3; 10.GIAV8; 11.GIAV9; 12.GIAV12; 13.GIAV13; 14.GIAV14.

4.3 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Con cada extracción de ADN de Paecilomyces sp.seleccionada, se llevó a cabo la PCR.

Inicialmente se utilizó el protocolo propuesto por Suárez (2016) usando las cantidades y concentración

de reactivos propuestas para PCR (Tabla 5), Se inició la PCR, con un ciclo de denaturación de 94 °C

por 1 min, 35 ciclos de 94 °C por un min, el anillamiento 52 °C por 45 segundos, la extensión 72 °C

por 1 min y un ciclo final de 72 °C por 7 min (Figura 17). En estos ensayos iniciales, no se obtuvo

amplicones para Paecilomyces, sólo para Moniliophthora roreri (control positivo).

Tabla 5. Cantidades y concentración de reactivos para PCR de Paecilomyces sp.

Componentes Concentración Concentración Una muestra

Stock Final

Buffer 10x 1x 2.5 µL

MgCl2 50 mM 1.5 Mm 0.75 µL

Cebador ITS4, 10 Mµ 0.5 µM 1.25 µL

Cebador ITS5, 10 Mµ 0.5 µM 1.25 µL

 48

DNTPs 10 mM 0.2 mM 0.50 µL

Taq polimerasa 5 U/ µL 0.02 U/ µL 0.10 µL

Agua nanopura - - 16.65 µL

SueroFetal bovino 5 ng / µL 0.4 ng / µL 1.0 µL

Solución de ADN - - 1.0 µL

Volumen final - - 25.0 µL

Figura

17. Protocolo de PCR propuesto por Suárez, 2016

Sin embargo, se llevó a cabo la PCR de acuerdo a las temperatura y cantidad de ciclos

propuestos por Martin (2012), así: primero un ciclo de denaturación a 95 °C por 5 min, 25

ciclos de 94 °C por 1 min, el anillamiento 58 °C por 1 min, la extensión 72 °C por 1 min y un

ciclo final de 72 °C por 10 min (Figura 18), y se obtuvo el amplicon de la cepa GIAV 14.
 49

Figura 18. Protocolo de PCR propuesto por Martin L., 2012

Posteriormente se implementó el protocolo propuesto por Perdomo et al. (2013), que indica un

ciclo de denaturación de 94 °C por 5 min, 35 ciclos de 95°C por 30 seg, el anillamiento 55 °C por

1min, el tiempo de anillamiento no estaba especificado en el protocolo, por lo tanto se mantuvo 1 min

ya que era el tiempo usado en el protocolo de Martin (2012), la extensión 72 °C por 1 min y un ciclo

final de 72 °C por 3 min (Figura 19), pero no se obtuvo ningún amplicon.

2
95°C por 30
segundos

Figura 19. Protocolo de PCR propuesto por Perdomo, H. et al. 2013

 50

Así que se modificó el número de ciclos en el protocolo de Martin (2012), y llevando a

cabo la PCR de gradiente con temperatura de anillamiento de 58 °C y 55 °C (Figura 20), se

adquirieron los amplicones (Figura 21) de las cepas HC002, HC003, HC004, HC006, HS021,

HS022, HZ002, GIAV2, GIAV3, GIAV8, GIAV9, GIAV12, GIAV13, GIAV14 y el control

positivo (Moniliopthora roreri).

seg

35 ciclos
Figura 20.Protocolo estandarizado de PCR para obtención de amplicones de cepas de
Paecilomyces sp. del laboratorio de Biotecnología Molecular

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

1000
pb
500 pb

250 pb

Figura 21. Gel de agarosa 1.5 % (p/v) de productos de amplificación con iniciadores ITS4, e
ITS5 a partir de ADN de Paecilomyces sp. Pozos: 1 y 9 Marcador 1Kb; 2. HZ002; 3. HS021; 4. HS022;
 51

5. HC002; 6.HC003; 7.HC004; 8.HC006; 10.GIAV2; 11.GIAV3; 12.GIAV8; 13.GIAV9; 14.GIAV12;

16.GIAV13; 16.GIAV14; 17.Control positivo (M. roreri).

4.4 SECUENCIACIÓN DE LOS FRAGMENTOS ITS Y COMPARACION DE SECUENCIAS

CON BASES DE DATOS

El tamaño de los amplicones para HZ002, HS021, HS022, HC002, HC003, HC004, HC006,

GIAV2, GIAV3, GIAV8, GIAV9, GIAV13 y GIAV14 fue aproximadamente de 660 pb. y para

GIAV12 fue de 690 pb; El resultado del análisis taxonómico de estas secuencias (Anexo 2) según la

base de datos BLAST del NCBI (Figura 22) , indicó que las secuencias tienen entre 87 y 100 % de

identidad en el 100 % de su longitud con secuencias de ITS pertenecientes a las especies

Purpureocillium lilacinum.(Tabla 6).

Figura 22. Plataforma de BLAST

Fuente: NCBI
 52

Tabla 6. Identificación molecular de las cepas registradas como Paecilomyces sp., del
laboratorio de Biotecnología Molecular de la UFPS

CÓDIGO GÉNERO ESPECIE %

IDENTIDAD

GIAV2 Purpureocillium lilacinum 99

GIAV3 Purpureocillium lilacinum 95

GIAV8 Purpureocillium lilacinum 99

GIAV9 Purpureocillium lilacinum 99

GIAV12 Penicillium copticola 94

GIAV13 Purpureocillium lilacinum 98

GIAV14 Penicillium paxilli 100

HS021 Purpureocillium lilacinum 99

HS022 Purpureocillium lilacinum 100

HC002 Purpureocillium lilacinum 99

HC003 Purpureocillium lilacinum 99

HC004 Purpureocillium lilacinum 87

HC006 Purpureocillium lilacinum 99

HZ002 Purpureocillium lilacinum 99

Las cepas objeto de este estudio se habían clasificado morfológica, macro y microscópicamente

como Paecilomyces, pero la identificación molecular determino al género y especie Purpureocillium

 53

lilacinum, de acuerdo con la literatura se denominaba anteriormente Paecilomyces lilacinus, pero

después de una revisión taxonómica se clasificó en un nuevo género llamado Purpureocillium debido a

varias diferencias fenotípicas con especies del género Paecilomyces (Figura 23) (Rehner et al.,2011;

Luangsa-ard JJ, et al., 2011).

Paecilomyces
Perfecto (sexual)
lilacinus
Género y especie
según el estado
de reproducción
Imperfecto Purpureocillium
(asexual) lilacinum

Figura 23. Género y especie según el estado de reproducción de Paecilomyces sp.

Por su parte se encontró vinculo taxonómico en las cepas pertenecientes al género Penicillium y

Purpureocillium (Tabla 7), ya que Penicillium lilacinum se transfirió al género Paecilomyces y

posteriormente al relativamente nuevo género Purpureocillium lilacinum.

Tabla 7. Clasificación taxonómica de Purpureocillium, Paecilomyces y Penicillium

 54

Se identificaron GIAV2, GIAV3, GIAV8, GIAV9, GIAV13, HC002, HC003, HC004, HC006,

HS021, HS022 y HZ002 como pertenecientes al género y especie Purpureocillium lilacinus. El

resultado del análisis de la secuencia de GIAV12 identificó esta cepa como Penicillium copticola; y

GIAV14 se caracterizó molecularmente como Penicillium paxilli, con lo cual se demostró que la

identificación bioquímica de las cepas realizada previamente, no corresponde a la identificación

molecular, evidenciando la necesidad de este tipo de estudios moleculares (Tabla 8).

Tabla 8.Diferencias de identificación morfológica y molecular de Paecilomyces

La diversidad genética presentada por los aislamientos de estudio, fue de dos géneros (Purpureocilium

sp. y Penicillium sp.) y tres especies (Purpureocilium lilacinum, Penicillium paxilli y Penicillium

copticola), lo cual indica la conservación del genotipo de Purpureocillium en los municipios del

departamento estudiados (ver Anexo 3).

 55

5 CONCLUSIONES

Se identificó el hongo Purpureocillium lilacinum como el biocontrolador responsable del papel

antagonista frente al fitopatógeno Moniliopthora roreri, hongo que produce grandes pérdidas en los

cultivos de cacao (Theobroma cacao), esto permite usar tratamientos biológicos eficaces para

contrarrestar esta enfermedad principal en Norte de Santander, Colombia. Purpureocillium lilacinum

también es considerado de interés industrial para el control biológico de nematodos como Globodera

rostochiensis en cultivos de papa (Solanum tuberosum).

Mediante esta técnica molecular de ITS se logró establecer con precisión el reconocimiento de

género y especie de los aislados, ya que se presumía un género diferente al identificado por la

caracterización molecular, debido a que hay gran similitud entre géneros y especies de hongos.

En este investigación se evaluaron tres protocolos de amplificación del ADN del

entomopatógeno Purpureocilium lilacinum, obteniéndose finalmente el amplicon de este hongo con la

estandarización de un nuevo protocolo a partir de estos ,siendo imprescindible manejar una

temperatura de anillamiento entre 58 °C y 55°C para obtener amplicones de Purpureocillium a través

de la PCR, utilizando los cebadores universales ITS4 y ITS5,teniendo en cuenta que esta temperatura

depende directamente de la longitud y composición de los primers. Además, el protocolo de reacción

en cadena de la polimerasa propuesto en esta investigación no solo es útil para obtener amplicones del

género Purpureocillium, sino también Moniliopthora y Penicillium.

 56

El ADN obtenido fue extraído de los aislamientos de Purpureocilium que fueron obtenidos de

los municipios de Cúcuta, El Zulia Sardinata y Tibu, para un total de 14 extracciones de cuatro

municipios de Norte de Santander.

La diversidad genética presentada en el análisis en la base de datos del NCBI por los

aislamientos de estudio, fue de dos géneros (Purpureocilium y Penicillium) y tres especies

(Purpureocilium lilacinum, Penicillium paxilli y Penicillium copticola), lo cual indica la conservación

del genotipo de Purpureocillium en los municipios del departamento de los cuales se obtuvieron los

aislados. La propagación del hongo biocontrolador en Norte de Santander podría relacionarse con la

diseminación natural de las esporas del hongo, por las corrientes que genera el viento y la dispersión de

mazorcas infectadas de cacao por M. roreri o C. foraseminis en el movimiento de estas por el hombre.
 57

6 RECOMENDACIONES

Para mantener la viabilidad de las cepas identificadas, es necesario realizar repiques de la cepa

madre en PDA, por lo menos cada dos meses, para evitar el agotamiento de la fuente de carbono y

posterior muerte del hongo.

Resulta de interés hacer una formulación de inoculante biológico de esta cepa caracterizada

molecularmente junto con Trichoderma asperellum o Trichoderma longibrachiatum, cepas que

también fueron identificadas en el laboratorio de Biotecnología molecular de la Universidad Francisco

de Paula Santander, para evaluar si en equipo pueden asegurar en un 100 % el control biológico sobre

el fitopatógeno Moniliopthora roreri.

Al momento de repicar el hongo de medio de cultivo solido a líquido debe considerarse un

cultivo joven que lleve un promedio de cinco a diez días de inoculado para facilitar el aislamiento y

optimizar el crecimiento del hongo. Además en caldo PDB es recomendable tener un periodo de

incubación no mayor a diez días de incubación para obtener buenas calidad de ADN.
 58

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 67

ANEXOS
 68

ANEXO 1. CUANTIFICACIÓN DEL ADN DE CADA EXTRACCIÓN.

MUESTRA CONCENTRACION (ng/µL)

HC002 815,7

HC003 900.3

HC004 1405.8

HC006 824.3

HS021 743.5

HS022 1591.6

HZ002 1220.1

GIAV2 1303.2

GIAV3 831

GIAV8 750.2

GIAV9 816

GIAV12 1131.6

GIAV13 1238.3

GIAV14 817

La concentración mínima de ADN cuantificada en el Nanodrop necesaria para llevar a cabo la reacción

de cadena de la polimerasa y obtener amplicones fue de 743,5 (ng/µl) y la máxima de 1591.6 (ng/µl).
 69

ANEXO 2. ELECTROFEROGRAMAS DE LAS SECUENCIAS

 HC002

 HC003
 70

 HC004

 HC006
 71

 HS021

 HZ002


 72

 HS022

 GIAV2
 73

 GIAV3

 GIAV8
 74

 GIAV9

 GIAV12
 75

 GIAV 13

 GIAV14
 76

ANEXO 3.FORMATO DE CEPAS CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE

Código cepa GIAV3

Genero Purpureocillium Especie lilacinum
Lugar de aislamiento Cacao
Fecha de aislamiento I semestre del 2011
Fecha de identificación molecular II semestre del 2015
Nombre del proyecto Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomycespertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander
Nombre de quien lo identifico Wendy Lorena Peña Barrera
Morfología microscópica
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con metulas
cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios lisos o
equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto característico de
pincel.

Morfología macroscópica
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.

Secuencia de nucleótidos 5’-AAACCCTTAAAGGGGCAAGTCGCAAAGGAAATTACCGAGTATATACAACTCCCAAACCCACTGTGAA

CCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGAACGCCCCGGCCGCCTGCCCCCGCGCCGGCGCCGGACCCAGGCGCC
CGCCGCAGGGACCCCAAACTCTCTTGCATTACGCCCAGCGGGCGGAATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAGC
AAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAA
TGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAG
CATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCCTTTCAACCCTCGAGCCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGG
GGACGGCACACCAGCCGCCCCCCATATGAACTTGCTACCCCGCCGAAGCCTCACCTGGGTAGGATACCCG
ATCTCGTTCCGGAAAGTGGACGCGGTCACAGCCGTAAAACGCCCAACCTTCTTAGAGTTGACCTCTGATC
ATGTATGAATACCCGCTGAACTTATCATATTTATATTTGGATGAAGGTGTTTTTTTTTGTTGTTTTCTCGTCT
CCTCATTTTCTTTATTTTCTTTTTCTTTTTGCTTTTTTTTTATTTGTTA-3´

Código cepa
Genero
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
77
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS
MOLECULARMENTE
GIAV9
Purpureocillium Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2011
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del
entomopatógeno Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de
Biología Molecular de la Universidad Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos,
con metulas cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen
los conidios lisos o equinulados, formando largas cadenas, sin
ramificar, con aspecto característico de pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas
en agar PDA presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta,
borde irregular y color de reverso beige.
5’-GTTAATACCACACTACGTGTTCCGAGGTAACTCTAAGAAAAGTTGAGG
CGTTTTACGG GTGACCGCCTCCGCGCTCCGGTGCGAGGTGTGTG
CTACTACGCAGGGGAGGCTGCGGCGGGGTCGCCACTGCATTTCGGGGGCGGC
TGGTGTGCCGTCCCCCAACACCGAGGCCCCCGGGGGGGCTCGAGGGTTGAAA
TGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTT
CAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTC
GCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGA
TTCATTTGTTTTTGCTTGTGCAACTCAGAGAAGAAATTCCGCCCGCTGGGCGT
AATGCAAGAGAGTTTGGGGTCCCTGCGGCGGGCGCCTGGGTCCGGCGCCGGC
GCGGGGGCAGGCGGCCGGGGCGTTCCCGCCGAGGCAACTGAGGTAAGGTTC
ACAGTGGGTTTGGGAGTTGTATAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACC
AACGGAGACCTTGTTACGATTTTTACTTCCAAAGGGGGGGGCGGGGGGCGTC
TTTGGTATTTTGTTATCTTTTATTTATTATTTATATTTTTTAA-3´

FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Penicillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
78
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
GIAV12
Especie copticola
Cacao
I semestre del 2011
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color verde-grisaceo, textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.
5’-AAAATAATTAGTGTACTGCGGAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGT
GTTTTCCGAACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCTTCCGCCCCCGGGCCCGCGCC
CGCCCAAGACACCTGTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAGAAACTAGCTAAATTAGTTAAAACTTTCAA
CAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCTATTAATAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCATAATTC
AGTGAATCATCTAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCCGAGGGCATGCCTGTCCGAACGTCCT
TGCTTCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGCCCCCCCGAGCTGGGGGGGGCGGGCCCCAAACGTA
GCGGCAGCACCGCGTCCGGTCCTCTATCGTATGGAGCTTCCGCACCCGCTCTTTTTAGCCCGGCCGGCGCCAG
ACGACACCCCTCTATCTCTTTTTTCAGGTTGACCTCCGATCACGTATGGATACCCCCAGAACTTTACCATATTT
GTGGCGGTATGAACCTTAAGCACATTTTACACGATTTTAAGATCACATATAACAACCCTCGCGATAGATATAG
GGGCTAAATAGCGTGTGACTAACTCGCAAAAGAGGCATAAGATCGCTCTTATAACACTCGCACTGAAATTTG
ATTCACACTGCACGAGGGGAACTCCACACTTTGATAACGCACGATGAAATGACACATATATAAGCAACATTA
AAAAAAAAATAAAATGTTTTTATTTGATTTGTTTTTCTATATATTCTAATTAGCTCGATGTTTGT-
3´ACTTGCGAATTACTATATGTCTCAGTTCTCTT-3´
 79

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE

Código cepa GIAV13

Genero Purpureocillium Especie lilacinum
Lugar de aislamiento Cacao
Fecha de aislamiento I semestre del 2011
Fecha de identificación molecular II semestre del 2015
Nombre del proyecto Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander
Nombre de quien lo identifico Wendy Lorena Peña Barrera
Morfología microscópica

conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con metulas

cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios lisos o
equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto característico de
pincel.

Morfología macroscópica Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.

Secuencia de nucleótidos 5’-TTTTCATTGCGACCACGTGTTCCGATGTCACTCTATAAAGTTACGAG

GCGTTTTACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCGGTGCGAGGTGTGTGCTAC
TACGCAGGGGAGGCTGCGGCGGGGTCGCCACTGCATTTCGGGGGCGGCT
GGTGTGCCGTCCCCCAACACCGAGCCCCCCGGGGGGGCTCGAGGGTTGAA
ATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTG
CGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCG
CATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAA
AGTTTTGATTCATTTGTTTTTGCTTGTGCAACTCAGAAAAGAAATTCCGCC
CGCTGGGCGTAATGCAAGAGAGTTTGGGGTCCCTGCGGCGGGCGCCTGGG
TCCGGCGCCGGCGCGGGGGCAGGCGGCCGGGGCGTTCCCGCCGAGGCAA
CTGAGGTAAGGTTCACAGTGGGTTTGGGAGTTGTATAACTCGGTAATGAT
CCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCCA-3´
 80

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE

Código cepa GIAV14

Genero Penicillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Especie paxilli
Cacao
I semestre del 2011
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera

Morfología macroscópica Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color verde-grisaceo, textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Purpureocillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
81
HC002
Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2010
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con metulas
cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios lisos o
equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto característico de
pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.
5’-CCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGAACGCCCCGGCCGCCTGCCCCCG
CGCCGGCGCCGGACCCAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCCAAACTCTCTTGCATTACGCCCAGC
GGGCGGATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAGCAAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGG
ATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATTCAGTGATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCC
TGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGGGACGGCACAC
CAGCCGCCCCCAAATGCAGTGGCGACCCCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTC
GCACCGGAGCGCGGAGGCGGTCACGCCGTAAAACGCCCAACTTTCTTAGAGTTGACCTCGGA
TC-3´

FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Purpureocillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
82
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
HC003
Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2010
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con metulas
cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios lisos o
equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto característico de pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color rosa-grisaceo, textura polvorienta, borde irregular y color de reverso
beige.
5´-GTTCCATAATAATTTTGATGATGCAGAGGTCACTCTAAGAAAGTTGGGCGTTTTACGGCGTGA
CCGCCTCCGCGCTCCGGTGCGAGGTGTGTGCTACTACGCAGGGGAGGCTGCGGCGGGGTCGCCAC
TGCATTTCGGGGGCGGCTGGTGTGCCGTCCCCCAACACCGAGGCCCCCGGGGGGGCTCGAGGGTT
GAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTC
GATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAG
AACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTTGCTTGTGCAACTCAGAGAAGAAA
TTCCGCCCGCTGGGCGTAATGCAAGAGAGTTTGGGGTCCCTGCGGCGGGCGCCTGGGTCCGGCGC
CGGCGCGGGGGCAGGCGGCCGGGGCGTTCCCGCCGAGGCAACTGAGGTAAGGTTCACAGTGGGT
TTGGGAGTTGTATAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTT
TTACTTCCAAAAAAAAAGAGA-3´

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Purpureocillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
83
HC004
Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2010
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la
Universidad Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con metulas
cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios lisos o
equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto característico de
pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.
5´-TTCAGTTCTCACTTACCATTCACAAAATTTCTTTTATATAATTGTGCGTTTTTCTTTGTTAT
CTCCTCCCTTCTCCGTGTTCTATGTGTGTGTTTCTCCTCAGGGCAGGCTTCTGCGGGGCCCCC
ACTTCATTTCTGGGGCTGCTGGTGTGCCTTCTCCCAACACAGATGCCCCCCGGGGGGCTCCA
GGGTTGAAATTACTCTTAACAGGCCTGCCCCCCAGAATGCTGGCTGGCTCAATGTGCCATTC
AAAGATTCTATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCTCTTTCCCTCCCTTCT
TCCTCTTTGCCTTAACCAACAGATCCGTTGTTGAAACTTTTGATTCATTTGTTTTTGCTTGTG
CAACTCACAGAAGAAATTCCGCCCGCTGGGCGTAATGCAAGATACTTTGGGGTCCCTGCGG
CGGGCTCTTGGGTCCGGCGCCGGCGCGGGGGCATGTGGCCGGGGCGTTCACGCCTAGGCAA
ATGAGGTAAGGTTCACCGCGTGGCTGCGAGTTGTACAACTCGGTAATGAGCCCTCCGCGGG
TTCACCCACTTAGACCTTGTTACAACTTGACATCCACATTCCCATGTGGAGTGCTTTTAGTGT
TAACTTCGTTTACTTGCTATTCTATCTCCTTACGCCTTCATTCTCTTTATCAGCATCTCAA-´3

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Purpureocillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
84
HC006
Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2010
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con metulas
cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios lisos o
equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto característico de
pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.
5´-TGTATTCTTTTCCCACTCCTGAGTTCTTACAGTCACTCTACAGAAGTTGGGCGTT
TTACGG CGTGACCGCCTCCGCGCTCCGGTGCGAGGTGTGTGCTACTACGCAGGG
GAGGCTGCGGCGGGGTCGCCACTGCATTTCGGGGGCGGCTGGTGTGCCGTCCCCC
AACACCGAGGCCCCCGGGGGGGCTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATG
CCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGA
ATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAAC
CAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTTGCTTGTGCAACTCAGAG
AAGAAATTCCGCCCGCTGGGCGTAATGCAAGAGAGTTTGGGGTCCCTGCGGCGGG
CGCCTGGGTCCGGCGCCGGCGCGGGGGCAGGCGGCCGGGGCGTTCCCGCCGAGGC
AACTGAGGTAAGGTTCACAGTGGGTTTGGGAGTTGTATAACTCGGTAATGATCCCT
CTGCTGGTTCACCAACGGACACCTTGTTACGACTTTTACTTCCACTTTTTTAAAAAA
AAAAATTAAATAATAACTTTATCTATCAAAATCACTTCATACCATTTAAAACGTAA
TCTAA-´3

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Purpureocillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
85
HS021
Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2010
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomycespertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con metulas
cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios lisos o
equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto característico de
pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.
5´-GGGTTCGACTCTCTTCATGTATCAGAGGTCACTCTAAGAAAGTTGGGCGTTTT
ACGGC GTGACCGCCTCCGCGCTCCGGTGCGAGGTGTGTGCTACTACGCAGGGG
AGGCTGCGGCGGGGTCGCCACTGCATTTCGGGGGCGGCTGGTGTGCCGTCCCCC
AACACCGAGGCCCCCGGGGGGGCTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCAT
GCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACT
GAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAG
AACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTTGCTTGTGCAACTC
AGAGAAGAAATTCCGCCCGCTGGGCGTAATGCAAGAGAGTTTGGGGTCCCTGCG
GCGGGCGCCTGGGTCCGGCGCCGGCGCGGGGGCAGGCGGCCGGGGCGTTCCCGC
CGAGGCAACTGAGGTAAGGTTCACAGTGGGTTTGGGAGTTGTATAACTCGGTAA
TGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCCAAAA
TTAAAAAAAACCCCAA-´3

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Purpureocillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
86
HS022
Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2010
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la
Universidad Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con
metulas cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios
lisos o equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto
característico de pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar
PDA presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y
color de reverso beige.
5´-GGGAAACTGCACACTTCATCAACATTATATAGTCTTTCATCACAAG
TTGGGCGTTTTA CGGCGTGACCGCCTTGTTACGACTTTTACTTCCAAA
TTCTAGACTGCGGAAAGAAGGAGAGATAGCCCGCCACAAGGGCAAA
GATTCCTGTGGTCCACCCTGCGACTGGGGAAAGAA CACCTCTTG
TACACGCAGACGAACTATGATAGCCAAATGATGTTCTTCCGATGCAAA
CGCAGGTGCTATTGTTCACTCAAAGGCATAATTATGAATATGCAGGTT
TATTTTTACTAATATCTGTAAAGAACAGAGCTCTTGTTTGTTAGAGTAA
CAATAGATTGTTATCATAAATATTATTAATGAGGCCTAAAGACAGAAG
AAATTTATTTCTGTAAACTATTTGTTTGCTGTTAAGATTAAATCTTTTG
ATCGCTTTATAGGGGTCTATGTGGTTATTCCTACTCTATAGGTATTATC
ACTTTTCTTCACCCCTTATACTCTACCCATCTATCATCTCATCTTTACTT
TATCACATCTCATAATTCTTTATTTTTTA-´3

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Purpureocillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
87
HZ002
Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2010
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomyces pertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la
Universidad Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con
metulas cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios
lisos o equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto
característico de pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar
PDA presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y
color de reverso beige.
5’-CCCCTATGGGGGGACGCGGAGGGACATTACCGAGTTATACAACTCCCAAACCCACTGT
GAACCTT ACCTCAGTTGCCTCGGCGGGAACGCCCCGGCCGCCTGCCCCCGCGCCGGCGCC
GGACCCAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCCAAACTCTCTTGCATTACGCCCAGCGGGCGGA
ATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAGCAAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCT
CTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAA
TTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATG
CCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGGGACGG
CACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCCCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGC
ACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGGCGGTCACGCCGTAAAACGCCCAACTTTCTTAGAG
TTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAA
AATACGCCCATTTTAGTAAATATCCATATCACTTCGCAAGAGCCACCTGATAGAATAAAT
GCGCTACAATATCTTTTGATTTTGCTCCCATAAGAGGGCGTAATAACGATCCATTACATAA
GCTCGCACCTAGATTTTTATCGGACATTTGCACCGTGTGGGTAACTCACACTTGTCGTTGA
CAAAACGCATGGCGTGAAGTTGTATAAATTTTTTCTTACGCTAGGAAATTAATGGTATAG
AAATGTAAGGGGATGTGGGTGGGGGGGGATTTTGTTTTATTATGTTTTTTCGATGTGGTCT
TTGGATCGATTATTTCTTAGTAGTTACGACTTCAGGAGATTTTTTAATTATGAACTTTGAG
TCTCCTTTTTATAAGCT-3´

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Purpureocillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
88
GIAV8
Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2011
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomycespertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad
Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con metulas
cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios lisos o
equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto característico de
pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar PDA
presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y color de
reverso beige.
5’-CCATTAGCTGGTATCTACTGCATCAGAGGTCACTCTAAGAAAGTTGGGCGTTT
TACGGC GTGACCGCCTCCGCGCTCCGGAGCGAGGTGTGTGCTACTACGCAGG
GGAGGCTGCGGCGGGGTCGCCACTGCATTTCGGGGGCGGCTGGTGTGCCGTCCC
CCAACACCGAGGCCCCCGGGGGGGCTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGC
ATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCA
CTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCC
AGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTTGCTTGTGCAA
CTCAGAGAAGAAATTCCGCCCGCTGGGCGTAATGCAAGAGAGTTTGGGGTCCCT
GCGGCGGGCGCCTGGGTCCGGCGCCGGCGCGGGGGCAGGCGGCCGGGGCGTTCC
CGCCGAGGCAACTGAGGTAAGGTTCACAGTGGGTTTGGGAGTTGTATAACTCGG
TAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCCA
GTGGGT-3´

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
FORMATO CEPAS DE CONTROL BIOLOGICO IDENTIFICADAS MOLECULARMENTE
Código cepa
Genero Purpureocillium
Lugar de aislamiento
Fecha de aislamiento
Fecha de identificación molecular
Nombre del proyecto
Nombre de quien lo identifico
Morfología microscópica
Morfología macroscópica
Secuencia de nucleótidos
89
GIAV2
Especie lilacinum
Cacao
I semestre del 2011
II semestre del 2015
Identificación molecular mediante ITS de aislamientos del entomopatógeno
Paecilomycespertenecientes al Laboratorio de Biología Molecular de la
Universidad Francisco de Paula Santander
Wendy Lorena Peña Barrera
conidióforos tabicados de paredes lisas y ramificados en sus extremos, con
metulas cortas y fialides con el apice puntiagudo, de donde nacen los conidios
lisos o equinulados, formando largas cadenas, sin ramificar, con aspecto
característico de pincel.
Las colonias inicialmente son blancas, pero luego de estar esporuladas en agar
PDA presentan un color rosa - grisaceo , textura polvorienta, borde irregular y
color de reverso beige.
5’-GTTTATGATACTTTTGATGCCTGCAGAGGTCACTCTAAGAAAGTTGGGCGTTTTACG
GCGTGACCGCCTCCGCGCTCCGGTGCGAGGTGTGTGCTACTACGCAGGGGAGGCTGCG
GCGGGGTCGCCACTGCATTTCGGGGGCGGCTGGTGTGCCGTCCCCCAACACCGAGCCC
CCCGGGGGGGCTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTG
GCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGC
AATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGAT
CCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTTGCTTGTGCAACTCAGAGAAGAAATTCCG
CCCGCTGGGCGTAATGCAAGAGAGTTTGGGGTCCCTGCGGCGGGCGCCTGGGTCCGGC
GCCGGCGCGGGGGCAGGCGGCCGGGGCGTTCCCGCCGAGGCAACTGAGGTAAGGTTCA
CAGTGGGTTTGGGAGTTGTATAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCA
CCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTTACTTCCAAAATCTGGATAAAGGGAAAAA-3´