Cromatografía HPLC

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Contenido:
† Introducción
† Equipo y operación
1. Columnas (fase estacionaria)
2. Solventes
3. Bombas
4. Detectores

† Tipos de HPLC (según su fase estacionaria)

† Cromatograma (Resultados)
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 ¿Qué es HPLC?
Es una forma de cromatografía en columna automatizada

HPLC significa:
* High Performance Liquid Chromatography
* High Pressure Liquid Chromatography

Originalmente el término “HPLC” se refirió a la presión alta (500psi) que

fue necesaria para generar el flujo requerido para la cromatografía de
líquidos en columnas empacadas.

El desarrollo de esta técnica cromatográfica tuvo sus origenes a mediados

de los 70´s. Hoy en día los equipos de alcanzan presiones hasta 6000 psi.

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Usos y aplicaciones
† HPLC preparativa: aislamiento y purificación de
compuestos

† HPLC analítica: Se basa en obtener información de la

muestra (identificación, cuantificación y resolución de la
muestra).

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Equipo

Equipo HPLC
Partes de un equipo HPLC

Puerto de inyección 5
Bombas
 Columnas HPLC
Las columnas HPLC son cilindros de acero inoxidable
empacados con la fase estacionaria

Logitud:
100 mm (más común)
50 mm y 30 mm (para CL/EM)

Parámetros
† Diámetro interno de columna (DI)
† Tamaño de partícula
† Tamaño de poro
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 Diámetro interno de la columna
•El diámetro interno en la columna (DI) HPLC es un aspecto crítico que
determina la cantidad de analito que puede ser llenada la columna y también
influye en la sensibilidad.

•DI grande. Alrededor de 10mm y son usadas para purificar cantidades

considerables de un compuesto.

•Escala analítica. Alrededor de 4.6mm; son comúnmente usadas para el

análisis cuantitativo de muestras y a menudo usadas con detectores UV-VIS.

•Columnas de diámetro angosto (1-2mm). Son usadas cuando se requiere

mayor sensibilidad en la detección.

•Columnas capilares. Por debajo de 0.3mm; usadas con métodos alternativos

de detección como espectrómetro de masas y esta hecha de silicio fundido.

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 Tamaño de partícula (fase
estacionaria)
La fase estacionaria esta formada de una capa que recubre a pequeñas
partículas de silicio de forma regular o irregular.

Los tamaños más comunes son de 5μm

Tamaños más pequeños proporcionan

mayor área de superficie y mejor
separación, aunque la presión requerida
para una velocidad linear óptima
incrementa inversamente al diámetro de la
partícula al cuadrado.

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 Tamaño de poro
Muchas de las fases estacionarias son porosas para proporcionar mayor área
de contacto.

Poros pequeños: proporcionan mayor área de superficie

Poros grandes: Proporcionan mejor cinética para moléculas grandes.

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 Eficiencia
El poder de separación es determinado por la longitud de la columna y el tamaño de partícula

Diferente longitud de
la columna

Diferente tamaño de
partícula
 Solventes (fase móvil)
La fase móvil esta compuesta por mezcla de solventes
polares y no polares
• Solventes Polares

Agua > Metanol > Acetonitrilo > Etanol >

Oxydipropionitrilo

* En columnas de fase reversa se pueden adicionar pequeñas cantidades de sales

inorgánicas (NaCl, (NH4)2 SO4) y soluciones buffer que controlen el pH.

• Solvents no-polares

n-Decano > n-Hexano > n-Pentano > Ciclohexano11

 Sistemas de flujo o elusión
Isocrático: La composición de los solventes en la fase móvil permanece
constante

Gradiente: La composición de la fase móvil va cambiando durante el proceso de

separación

Estos cambios se hacen involucrando diferentes porcentajes adicionados a la

fase móvil de una solución o solvente A con respecto a un solvente o solución B
en un módulo de tiempo.

Esto modifica la polaridad de la fase móvil y por consecuencia la elusión o

retención de los componentes de la muestra a separar.

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 Bombas
Las bombas varían en su capacidad de generar presión, pero su desempeño se
mide en su habilidad de generar una proporción de flujo reproducible

Las bombas pueden alcanzar presiones de 6000psi (~40MPa o al rededor

de 400 atmósferas).

Sistemas modernos de HPLC usan bombas que trabajan a mayor presión

(Ultra High Performance Liquid Chromatography), 15,000psi (~100MPa o al
rededor de 1000 atmósferas)

Las bombas manejan flujos de 50 a 5000µL/min

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 Requerimientos en los detectores
† Bajo nivel de ruido e inclinación de la línea base

† Alta sensibilidad y selectividad

† Respuesta rápida
*Sensible a la masa
*Sensible a la concentración
h = Altura del pico
w = ancho de pico a 0.607 de la altura del pico (cm)
F = flujo (ml/min)
M = masa del soluto inyectado
s = velocidad de carta (cm/min)

† Diseño de celdas
† Insensibilidad a cambios del solvente, proporción de flujos y temperatura
† Simple de operar
† Debe de ser fácil de calibrar para optimizar la detección
† Debe ser resistente
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 Detectores

1. Detector Ultravioleta
200-400nm (longitud de onda variable)
254 nm (longitud de onda fija)

2. Detector de índice de refracción

Detector universal
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 Detector UV
La radiación de un rayo electromagnético que pasa por una celda puede sufrir
cambios en su intensidad debido a la interacción de este con una molécula
(principalmente con sus grupos funcionales), Absorbancia.

Ley Lambert-Bear
La absorbancia de la radiación es proporcional a la concentración de un
compuesto en la celda y la longitud de esta.
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 Detector de índice de refracción
El principio de medición involucra los cambios en el índice de refracción observados
en el efluente que viene de la columna y pasa a través de la celda de medición.

Este valor de índice de refracción incrementado (que produce un compuesto) esta

comparado con índice de refracción que produce la fase móvil sola.
Ventajas:
1. Respuesta universal
2. Tiene baja sensibilidad a las burbujas
3. Cubre un amplio rango de índice de refracción
(1000-1750 RI)

Desventajas:
1. Baja sensibilidad
2. Difíciles de remover para limpiarlos

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 Tipos de HPLC
† Fase normal

† Fase reversa (RP)

† Intercambio iónico

† Exclusión por tamaños (permeación y

filtración en gel)
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21
22
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24
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 Cromatograma
† Tiempo de retención (tR)

† Resolución

† Factor de selectividad (α)

† Ensanchamiento de señal
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 Tiempo de retención (TR)
Es el tiempo que tarda en viajar una muestra desde el puerto de inyección hasta
llegar al detector

Response

5 10 15 20 25

Retention Time
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 Resolución
Es la separación de los centros de las señales o de los picos
A A

B B

WA WB WA WB

Traslape de señales Señales resueltas

W = Ancho de base
NOTA: Buena resolución se adquiere cuando se tiene un valor de R= 1.5 28
 Calculo
(tR)B - (tR)A
R=
1/2(WA + WB)

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NOTA: Buena resolución se adquiere cuando se tiene un valor de R= 1.5
 Selectividad
Es el grado de ausencia de interferencias debidas a otras especies contenidas en
la matriz de la muestra.

Ratio of Net Retention Time of 2 components.

α=
X2 - X0
(Distribution Coefficient)
R esponse
X1 - X0

X 2

X1

X0

1 3 6
R e te n tio n T im e 30
 Ensanchamiento de la señal

•Difusión de Eddy

•Difusión longitudinal

•Resistencia a la
transferencia de masa

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Cromatograma de jugo de naranja

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 Factores que ayudan a la
separación
• Incrementar la longitud de la columna
• Disminuir el diámetro de la columna
• Disminuir la proporción del flujo
• Empacar la columna uniformemente
• Fase estacionaria uniforme (material empacado)
• Disminuir el tamaño de la muestra
• Seleccionar la fase estacionaria adecuada
• Seleccionar la fase móvil apropiada
• Usar una presión adecuada
• Usar un gradiente de elusión
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Vocabulario
El analito La muestra a ser separada en la cromatografía.

Cromatografía Analítica es usada para determinar la existencia y posiblemente la

concentración del o los analitos en una muestra.

Cromatograma es el resultado visual del cromatógrafo.

El cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada e.g. separación

en gases o en líquidos.
Cromatografía es el procedimiento fisicoquímico que permite separar los
componentes o sustancias integrantes de una mezcla en movimiento por adsorción o
separación diferencial de estos componentes sobre una superficie estacionaria o
inmóvil.

El efluente es la fase móvil que sale de la columna.

.
La fase móvil es la fase compuesta por solventes o gases que arrastra a la muestra
y contribuye a la separación en la columna cromatográfica.

Cromatografía Preparativa es usada para purificar cantidades grandes de sustancia

para su uso posteriores en lugar de análisis. 34
 Cont.
Tiempo de retención es el tiempo que tarda el analito en pasar desde el puesto de
inyección al detector.

La muestra es la materia analizada en la cromatografía. Esta puede estar

constituida de un solo componente o de una mezcla de estos.

El soluto se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografía de

partición.

El solvente se refiere a cualquier otra sustancia capaz de solubilizar a otras

sustancias y puede formar la fase móvil en la cromatografía de líquidos.

La fase estacionaria es la sustancia la cual esta fija en un lugar y que en

combinación con la fase móvil ayuda en el proceso de la separación, lo cual
constituye la base de la cromatografía.

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