domingo, 21 de febrero de 2016

Técnicas de Análisis Instrumental en Enología

TÉCNICAS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL EN ENOLOGÍA

Conocer y aplicar las técnicas de análisis instrumental, que son más comunes en los
laboratorios de las bodegas o asesorías vitivinícolas. Para ello hay que conocer el fundamento
teórico de las técnicas, además de saber interpretar los procedimientos de análisis y llevarlos
a la práctica.

Dado que estas técnicas analíticas están en constante evolución, es necesario insistir en que
hay que comprender a la perfección sus fundamentos teóricos. Esta circunstancia favorecerá
nuestra adaptación a los continuos avances en el equipamiento instrumental.

- Conceptos generales de caracterización del análisis instrumental.

- Conocer las técnicas basadas en métodos electroanalíticos, como la determinación de pH y
las aplicaciones potenciométricas.
- Las técnicas ópticas espectroscópicas y no espectroscópicas, en las que debemos
familiarizarnos con determinaciones de color, ácido málico o análisis de turbidez y
refractometría.
- El fundamento y la aplicación de las técnicas cromatográficas, de gran importancia actual y
de cara al futuro.

- Identificar las distintas técnicas de análisis instrumental, con aplicación en el ámbito del
análisis enológico.
- Conocer el fundamento y las especificaciones de cada técnica, para poder adecuarnos a los
cambios continuos de este tipo de técnicas, sin que sea necesario un periodo de formación
cada vez que se cambia el equipo o se mejora la técnica. Además un mismo tipo de equipo
puede ser utilizado para fines muy diferentes, según las necesidades.
- Aplicar estas técnicas en el laboratorio siguiendo los procedimientos, teniendo en cuenta el
código de buenas prácticas y obteniendo unos resultados acordes con el problema planteado.
- Llevar a cabo o establecer un programa de mantenimiento de estos equipos, de manera que
se garantice la fiabilidad de los resultados y la duración de los mismos.
ANÁLISIS INSTRUMENTAL

En los laboratorios enológicos cada vez hay menos material y equipos clásicos, que van siendo
sustituidos por aparatos e instrumentos electrónicos.

En efecto, los avances tecnológicos y los trabajos de investigación, nos demuestran que pese
a la elevada inversión inicial que supone la adquisición de equipos de análisis instrumental, su
rentabilidad es indiscutible siempre y cuando el volumen de muestras sea el suficiente.

La elección, mantenimiento y buen uso de los modernos equipos de análisis, requiere una
comprensión de cuales son los principios fundamentales en los que se basan. Sólo de esta
manera es posible aplicar los procedimientos con un espíritu crítico, eligiendo la mejor opción
y conscientes de que también tienen limitaciones. Además, en la mayoría de los casos, siguen
necesitando de un proceso de preparación de la muestra, lo que asocia el análisis
instrumental a los procesos habituales y clásicos de laboratorio.

Una de las ventajas de las técnicas instrumentales, es que van abriendo el camino a la
posibilidad de implantación de métodos automáticos de análisis. Por ejemplo, en el control
de materia prima en la recepción de una bodega, donde una sonda extrae una muestra y
analiza el contenido enazúcares, pH y testigos de podredumbre (actividad enzimática).

En la actualidad existen equipos de análisis automático (autoanalizador) que pueden realizar

una analítica completa del mosto en cuestión de minutos. Obteniendo una información que
nos abrire un abanico de posibilidades a la hora de decidir como procesar las uvas, además
de poder aceptar o rechazar la partida analizada.

Otra posibilidad, que nos da el desarrollo de técnicas instrumentales, es la monitorización de

los procesos de elaboración, donde, en una pantalla, se nos permite observar
instantáneamente, los parámetros analíticos de cada parte del proceso, permitiéndonos
tomar decisiones sin tener que esperar a los resultados analíticos.

Las técnicas actuales de análisis instrumental son muchas y muy diversas, por lo que es
necesario centrarse en aquéllas que tienen una aplicación en los laboratorios enológicos. Aún
así debemos ser conscientes de que es un campo en constante evolución, lo que supone que
técnicas que hoy en día no son usuales en los laboratorios enológicos, en un futuro próximo se
pueden convertir en habituales.
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS ANALÍTICAS INSTRUMENTALES

La importancia de las clasificaciones radica en que agrupar técnicas con un fundamento

común, facilita su estudio y comprensión.

Ya que según la finalidad o información que se busca con el análisis, puedemos clasificar las
técnicas analíticas en cualitativas y cuantitativas y que, según cual sea la propiedad
medida, hablamos de análisis gravimétrico, volumétrico e instrumental.

El análisis instrumental puede tener una finalidad cualitativa, cuantitativa o ambas. Según
la propiedad que se va a medir y simplificando mucho, hablaremos de métodos ópticos,
métodos electroanalíticos y métodos cromatográficos.

Casi todos ellos tienen aplicación en el campo analítico de la enología, aunque no en los
laboratorios de control de una bodega o asesoría vitivinícola.

1. Métodos ópticos: La señal medida está relacionada con la radiación electromagnética.

- Absorción de radiación.
- Emisión de radiación.
- Dispersión de la radiación.
- Refracción.
- Rotación.

2. Métodos electroanalíticos: La señal está relacionada con parámetros eléctricos como:

- Potencial eléctrico.
- Carga eléctrica.
- Resistencia eléctrica.
- Razón masa - carga.
- Otros.

3. Métodos cromatográficos: En realidad se trata de métodos de separación de componentes,

pero que siempre necesitan alguno de los métodos anteriores como paso final para obtener
una medida analítica.
- Cromatografía de líquidos.
- Cromatografía de gases.
- Cromatografía de fluidos supercríticos.
PARÁMETROS DE TRABAJO EN ANÁLISIS INSTRUMENTAL

Es necesario fijar cuáles son las características de funcionamiento que necesitamos que
cumplan los instrumentos analíticos.

La manera más directa de hacerlo es, definir unos criterios cuantitativos que te permitan
saber y decidir si un determinado método instrumental, es el más adecuado para resolver el
problema analítico al que nos enfrentemos.

Los términos numéricos que definen estos criterios, son los parámetros de calidad para un
trabajo determinado y nos permiten elegir entre los métodos instrumentales disponibles,
descartando aquellos que no cumplan con estos parámetros. Los parámetros más importantes
son:

- Precisión: Si analizamos una misma muestra un número determinado de veces y de la misma

forma, entendemos como precisión, el grado de concordancia entre los resultados obtenidos.

Los parámetros de calidad para evaluar la precisión, son términos estadísticos como la
desviación estándar, la desviación relativa de la media o la varianza.

- Exactitud: Entendida como la diferencia existente entre el valor medio del resultado
obtenido y el valor real de la magnitud medida. Para evaluarla es necesario recurrir
a patrones de referencia. Los parámetros de calidad para evaluar la exactitud se basan en
cuantificar el error sistemático. Se suelen corregir mediante calibración o mediante el ajuste
con un blanco.

- Sensibilidad: Entendida como la capacidad que tiene un equipo, para distinguir entre dos
muestras con características muy próximas. Los factores de calidad para evaluar la
sensibilidad, están asociados al resultado de la calibración, sobre todo a la pendiente de la
curva de calibración cuando es lineal.

- Límite de detección: Es la cantidad o concentración mínima de analito que es capaz de

detectar el equipo. Como parámetro de calidad se busca que el límite de detección, sea el
que corresponda a una lectura igual a la lectura del blanco más 5 veces su desviación
estándar.

Además de estos criterios, es necesario tener en cuenta la capacidad del equipo para ser
selectivo con el analito que se pretende determinar y, por supuesto, que permita adaptarse al
rango de concentraciones de las muestras para las que se destina.

Cuando son varios los equipos cuyos parámetros cumplen con los requisitos exigidos, se
pueden tener en cuenta otra serie de características como coste, rapidez, tamaño, etc. que
completarán el proceso de elección del equipo más adecuado.
ESTANDARIZACIÓN Y CALIBRACIÓN

En la actualidad, con la implantación de sistemas de control de la calidad en los laboratorios

analíticos, las normas de certificación y acreditación de competencia (ISO-EN 9000, ISO-EN
17025, etc.) y las exigencias de trazabilidad, hacen que estos terminos sean relavantes en las
funciones del laboratorio.

- Estándar: Es un término adaptado de la lengua inglesa, sinónimo de patrón.

- Estandarización: Significa comparación de un valor con un patrón de referencia y puede ser

aplicado a un equipo, a un método analítico o simplemente a una disolución. Este término es
usado, al establecer la concentración de una disolución frente a un patrón primario,
empleando el término de valoración o estandarización indistintamente.

- Calibración: Es un término definido por la norma ISO como "el conjunto de operaciones que
permiten establecer, en determinadas condiciones experimentales, la relación que existe
entre los valores indicados por un aparato o sistema de medida, con los valores obtenidos de
la medida de un valor conocido."

Es una operación de comparación entre la respuesta obtenida con la muestra problema y la

obtenida con un patrón de valor conocido.

Ambas definiciones son muy semejantes, por lo que los términos de estandarización y
calibración son empleados en los laboratorios indistintamente, para comprobar la fiabilidad
de los resultados analíticos, sobre todo, en técnicas de análisis instrumental.

Los equipos se deben calibrar, ya que esta necesidad obedece a que los componentes
envejecen, a que el funcionamiento está condicionado por la humedad y temperatura de los
locales, así como por el trato de los operarios y operarias del laboratorio. Estos factores
hacen que sus funciones sufran un deterioro paulatino, lo que supone una pérdida de
fiabilidad de los resultados obtenidos. Para evitarlo se recurre al calibrado.

Una correcta calibración, proporciona resultados acordes a las especificaciones de cada

equipo.
Existen diferentes procedimientos de calibrado:

- Procedimientos absolutos: Se basan en relacionar la señal del aparato con una magnitud
física y realizar el ajuste de la escala o sistema de medida. La calibración de una balanza con
una pesa patrón o la de un refractómetro con agua destilada, son ejemplos de este tipo de
calibración.
- Procedimientos estequiométricos: Se trata de aplicar un mismo procedimiento analítico a
un patrón valorado y a una muestra con relación definida entre ellos. La valoración de un
reactivo para volumetría es un buen ejemplo.
- Procedimientos comparativos: Se aplica el mismo procedimiento a patrones y muestras,
relacionándolos mediante una función numérica o gráfica. Este procedimiento es el que se
aplica mayoritariamente en análisis instrumental. Los equipos de análisis están compuestos
por una serie de componentes con funciones específicas, que sería necesario calibrar
individualmente lo cual resultaría lento y costoso, por lo que se recurre a calibrar el equipo
en su conjunto. En muchos casos, la calibración del equipo es una parte del procedimiento de
análisis. En otros, los aparatos están equipados con sistemas de autocalibrado, introduciendo
una muestra patrón cada x muestras.

Las operaciones de calibrado deben de establecerse de acuerdo a un procedimiento y

registrarse para garantizar la trazabilidad de los resultados analíticos.

MÉTODOS ELECTROANALÍTICOS

Se trata de métodos que se basan en las propiedades eléctricas que presenta una disolución
del analito cuando forma parte de una celda electroquímica, por lo que también se
denominan electroquímicos de análisis. Al tratarse de procesos de oxidación - reducción.
Una celda electroquímica consiste en 2 electrodos, cada uno sumergido en una solución
electrolítica y unidos externamente mediante un conductor. Según la teoría de los procesos
redox, cuando ponemos en contacto dos electrolitos con potencial redox diferente, uno
actuará como oxidante y otro como reductor, generándose una transferencia de electrones,
cedidos por el reductor y aceptados por el oxidante. Si cerramos el circuito mediante un
puente salino, obtenemos una diferencia de potencial entre los electrodos, que es
proporcional a las concentraciones de los electrolitos (ecuación de Nerst).

Los aparatos de electroanálisis, amplifican la señal eléctrica generada, para relacionarla con
la concentración de un electrolito en disolución.

Los métodos electroanalíticos con más aplicación en enología, son los métodos
potenciométricos, ya que pueden ser usados tanto para poner de relieve el punto final de una
volumetría, como para una medida directa del pH o el potencial redox. Los equipos utilizados
se denominanpotenciómetros.

Para poder medir el potencial eléctrico de una disolución, necesitamos un sistema formado
por una celda electroquímica de potencial constante, de manera que al introducirlo en una
solución electrolítica, será cuando su potencial se modifique de forma proporcional a la
concentración de dicha solución.

Esta celda está formada por un electrodo indicador, sensible a un determinado tipo de iones
y un electrodo de referencia, de potencial fijo, unidos por un conductor e inmersos en
sendas soluciones electrolíticas. Mediante conductores metálicos se completa el circuito de
amplificación de la señal y salida a la pantalla informativa.

- Electrodos indicadores: El más común es el electrodo de vidrio, sensible a la concentración

de H+, por lo que es utilizado para mediciones de pH. También se utilizan, aunque menos, los
electrodos de platino para medidas de potenciales redox o para seguimiento de volumetrías
de oxidación - reducción. También se pueden adquirir, electrodos selectivos de iones,
específicos para diversos iones como Cl-, F-, NO2-, NH4+, etc.

- Electrodos de referencia: Los más comunes son los de plata - cloruro de plata y el de
calomelanos.

DETERMINACIÓN DE PH
El concepto de pH es un término habitual en la vida cotidiana (pH de los productos higiénicos,
de los cosméticos, de los alimentos, del agua, etc). Para su determinación en una disolución,
vino, mosto o cualquier otro producto derivado, se utiliza un método potenciométrico,
denominándose pH-metro (también peachímetro) al equipo de medida del mismo.

La el cálculo es pH = -log[H+] y por otra banda, el potencial de semicelda, según la ecuación

de Nerst para la semireacción 2H+ + 2e- → H2 es:

Sustituyendo los valores de R, n y F, a 25ºC (298 K) y combinando con la definición de pH, nos
queda como E = -0,059 pH

Por lo tanto, para saber el valor del pH de una disolución, podemos recurrir a un
potenciómetro, pues existe una relación directa entre el potencial y el pH. Es importante
reseñar, que esta relación numérica depende de la temperatura, por lo que es necesario
indicarla para que el equipo realice la corrección correspondiente.

Un pH-metro es un potenciómetro, capaz de medir el potencial dependiente de la

concentración de Hidrogeniones (H+), en una disolución problema y cuya escala está
graduada en unidades de pH.

Para la determinación del pH, necesitamos un electrodo indicador, sensible a la variación de

la concentración de H+ y un electrodo de referencia. Ambos electrodos deben tener unas
características constructivas que no se alteren al contacto con la disolución del analito.

Como indicador para medidas de pH se utiliza el electrodo de vidrio y para el de referencia se

suele usar el electrodo de plata-cloruro de plata. Para facilitar el uso de este tipo de
electrodos, se construyen electrodos combinados, que incluyen en una misma carcasa el
electrodo de vidrio y el de referencia. Cuando veamos o trabajemos con un medidor de pH,
observaremos que aunque parezca que sólo lleva un electrodo, en realidad se trata de un
electrodo combinado.

Debido a que el electrodo sufre una degradación paulatina, es necesario calibrarlo antes de su
uso. Para ello, se deben seguir las instrucciones de uso o la instrucción técnica
correspondiente, pues cada equipo lleva una secuencia de teclas o acciones diferentes. En
todo caso, deberemos de seleccionar la calibración con soluciones tampón de pH lo más
próximo posible al pH de la muestra.

Las soluciones tampón deben de ser trazables frente a SRM de NIST (Standard Reference
Materials del National Institute of Standards and Tecnology), con precisión ± 0.02,
encontrándose en el mercado en monodosis, cápsulas de soluciones concentradas o listas para
usar. Deberás controlar su fecha de caducidad y el certificado de análisis.
EL ELECTRODO DE VIDRIO Y REFERENCIA

El electrodo de vidrio es en la actualidad, el sistema más extendido para la determinación del

pH por métodos electroanalíticos.

Pero para poder actuar como electrodo indicador, necesita de un electrodo de referencia,
siendo en este caso el electrodo de calomelano el más usado.

Actualmente se continúa investigando sobre la optimización de estos electrodos y sus posibles

sustitutos, pero de momento, no existe otro sistema para la medición electroanalítica que
tenga la misma versatilidad y precisión.

El electrodo de vidrio, como electrodo indicador de pH, fue identificado por M. Cremer en
1906 y posteriormente por F. Haber (1909) y otros investigadores, que se dedicaron a
investigar sobre la composición del vidrio, intentando mejorar la sensibilidad a la variación de
pH modificando la composición del mismo. Pero su utilización como electrodo es posterior,
cuando se incorporó el tubo de vacío que permite la medida de las variaciones de potencial
generadas.
Los electrodos empleados en la actualidad tienen como base un vidrio altamente sensible.

El electrodo de vidrio está constituido por las siguientes partes:

- Un tubo soporte del electrodo, de vidrio común (o plástico), no conductor de cargas
eléctricas.
- Un bulbo sensible en el extremo inferior, que es el elemento sensible del electrodo,
fabricado con vidrio polarizable, sensible a la variación de la concentración de hidrogeniones.
El vidrio polarizable es un conductor de cargas eléctricas, porque en su composición tiene
óxido de litio, además de óxido de silicio, de calcio y algunos otros óxidos.
- Un electrodo metálico de plata y cloruro de plata, que servirá de conductor al potencial
generado hasta el sistema de amplificación.

En el interior del bulbo hay una disolución ácido clorhídrico diluido, saturado de cloruro de
plata, lo que constituye una disolución tampón de pH invariable.

En la estructura del vidrio existen iones de litio y sodio, que se pueden mover entre los
intersticios de la red tridimensional formada por grupos SiO46-. Estos iones monovalentes, son
los responsables de la conducción eléctrica en el seno del vidrio.

Este tipo de vidrio es higroscópico, por lo que debe de estar hidratado para que funcione
como sensor de pH. Al hidratarse se produce una reacción de intercambio entre los iones
monovalentes del vidrio y los cationes del agua.

Donde Vd- representa el grupo aniónico del vidrio.

Con el vidrio hidratado, al sumergirlo en una disolución se establecen dos interfases en la

cara interna y externa del vidrio. En el interior seco del vidrio, los portadores de la carga son
los cationes sodio.

En la interfase interna el equilibrio se establece según el proceso:

siendo Hi+ los hidrogeniones de la solución interna del electrodo.

En la interfase externa el equilibrio establecido será:

siendo He+ los hidrogeniones de la solución externa en la que está inmerso el electrodo.

Por lo tanto las posiciones de estos dos equilibrios están determinadas por las actividades
(concentraciones) de los hidrogeniones en las disoluciones interna y externa del electrodo, de
tal manera que la interfase en la que tiene lugar más disociación, se transforma en negativa
respecto a la otra superficie. De esta manera, se establece una diferencia de potencial entre
la interfase interna y externa, denominado potencial límite (El), que es el parámetro que
usamos para medir el pH con un electrodo de vidrio.

El papel del electrodo de plata / coluro de plata del electrodo de vidrio y el electrodo de
referencia externo al electrodo de vidrio, es el de servir de contactos eléctricos para poder
medir el potencial.

El potencial del electrodo de vidrio, será pues el resultante de los dos potenciales de las
interfases, el potencial del electrodo de plata/cloruro de plata interno y el
llamado potencial de asimetría.

El potencial de la interfase externa viene dado por la ecuación de Nerst para el sistema:

De igual manera, el potencial de la interfase interna será:

En las que k1 y k2 son constantes, a'1 y a'2 son las actividades del H+ en las interfases
externa e interna y a1 y a2 son las actividades del H+ en las soluciones externa e interna.

Para una membrana de vidrio polarizable homogénea, k1 y k2 son idénticas al igual que a'1 y
a'2. Teniendo en cuenta estos valores, el potencial del electrodo vendrá dado por la
expresión:

Como en un electrodo de vidrio, la actividad del H+ interno a2 se mantiene constante, se

simplifica la expresión anterior:

o lo que es lo mismo

y donde

El potencial del electrodo de plata/cloruro de plata interno es estable, al ser un electrodo de

referencia.

Existe un tercer potencial denominado de asimetría, que se encuentra en la mayoría de los

electrodos de membrana, cuya causa no está del todo clara y que cambia lentamente con el
tiempo.

Teniendo en cuenta estos dos potenciales, el potencial del electrodo de vidrio será:

donde
Evidentemente, para poder medir el potencial del electrodo de vidrio se necesita compararlo
con un electrodo de referencia, generalmente de calomelano, cuyo potencial es fijo e
independiente del pH. En los electrodos combinados, este electrodo se incluye en una misma
carcasa de vidrio o plástico, que incluso puede incluir también un sensor de temperatura.
Para usos industriales se usan electrodos separados.

Los electrodos de vidrio y el de referencia externo, se conectan a un circuito de amplificación

y medida del potencial.

Como es difícil valorar la variación de los valores de L, necesitamos calibrar los equipos de
medida frente a patrones de valor de pH conocido antes de usarlos.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PH

Para medir el pH de un vino o un mosto, debemos de proceder con sutileza, pues a pesar de
ser una determinación sencilla, la exactitud de su resultado es de gran importancia para otros
aspectos enológicos. El procedimiento es el siguiente:

Material y reactivos:
- pH-metro que permita lecturas con aproximación de 0,01 unidades.
- Electrodo combinado para medida de pH.
- Sonda de temperatura.
- Soluciones tampón (estándar o buffer) de pH 4 y 7 con aproximación de 0.01 unidades.
- Agitador magnético.

Preparación del equipo de medida:

1. Enciende el equipo y comprueba que las señales son correctas.
2. Acopla el electrodo combinado y la sonda de temperatura, conectando los cables en las
clavijas correspondientes, procurando sujetarlos por los conectores y sin tirar nunca del
cable. Lo más habitual es que cada equipo disponga de un soporte específico para colocar el
electrodo y la sonda, siendo importante asegurarse de que la sujeción es firme, para evitar el
deterioro del mismo.
3. Saca el tapón protector lateral del orificio de rellenado del electrodo.
4. Retira el capuchón protector del electrodo y comprueba su estado y limpieza. Si lleva
tiempo sin usarse o estuvo almacenado en seco, será necesario hidratarlo, sumergiéndolo en
agua destilada o mejor en una solución tampón, según las instrucciones del fabricante.
5. Lava con agua destilada y comprueba que la sonda de temperatura funciona.
6. Calibra el equipo con las soluciones tampón de pH 4 y 7.

Procedimiento de análisis:
1. Con vino y mosto opera directamente sobre el líquido. Si se trata de mosto concentrado,
diluye con agua destilada hasta 25 ± 0,5 ºBrix (25 % m/m en azúcares totales). En todo caso
debes de homogeneizar la muestra.
2. Llena un vaso de precipitado o el vaso específico del equipo con un volumen suficiente
para que cubra el orificio del puente salino del electrodo combinado. En caso de utilizar
agitador magnético, evita que el imán tropiece con el electrodo.
3. Pulsa el botón de lectura, esperando a que la lectura sea estable y anota la misma con dos
decimales.
4. Realiza la determinación por duplicado.
5. Lava el electrodo y la sonda, colocando después el tapón y el capuchón protector con
líquido de conservación, según indicaciones del fabricante.

Cálculos:
El resultado será la media aritmética de las dos lecturas, expresada con dos decimales.

ACIDEZ POR POTENCIOMETRÍA

El procedimiento para determinar la acidez total, se basa en una volumetría de neutralización

con una solución valorada de hidróxido de sodio.

Para comprobar el punto final de esta valoración, podemos utilizar un indicador como el azul
de bromotimol, pero la percepción del viraje del indicador no siempre es fácil de distinguir.
Piensa en que para que el ojo humano perciba un cambio de color, debe de existir una
proporción mínima de 1 a 10 del nuevo color sobre el inicial. Esta circunstancia implica que
en vinos tintos o vinos blancos y rosados con mucha intensidad colorante, el cambio de color
no se perciba con nitidez. Todo ello implica que el error de valoración aumenta.

Por ello, podemos recurrir a la utilización de un potenciómetro (pH-metro, en este caso), ya

que a medida que añadimos hidróxido de sodio vamos modificando la concentración de H+ o,
lo que es lo mismo, el pH.

El método oficial para la determinación de la acidez, nos dice que "la Acidez Total es la suma
de los ácidos valorables cuando se lleva el pH a 7, añadiendo una solución alcalina valorada".
Por lo tanto podemos proceder como sigue:

Material y reactivos:
- pH-metro que permita lecturas con aproximación de 0,01 unidades como mínimo.
- Electrodo combinado para medida de pH.
- Sonda de temperatura. (No es necesaria si el electrodo lleva incorporada la sonda).
- Soluciones tampón (estándar o buffer) de pH 4 y 7.
- Agitador magnético.
- Bureta de 25 ml, clase A (si es posible con banda azul), con soporte y pinza de sujeción.
- Vaso de precipitados de 50 mililitros.
- Disolución valorada de hidróxido de sodio 0,1 Normal.

Preparación del equipo de medida:

- La preparación del equipo se lleva a cabo tal y como se especifica en el procedimiento
anterior para la determinación del pH en un vino o mosto.

Procedimiento de análisis:
1. Elimina el dióxido de carbono de la muestra, echando 50 ml de vino o mosto en un
kitasato. Agita a la vez que haces el vacío con un trompa de agua, durante unos minutos. Si se
trata de mosto concentrado, es suficiente con diluirlo a 25 ºBrix.
2. Monta la bureta y enrásala con la solución de valorada de NaOH 0,1 N.
3. Toma 10 ml de muestra y pásalas al vaso de valoración, añadiendo otros 10 ml de agua
destilada.
4. Coloca el vaso de precipitados sobre el agitador magnético e introduce un imán teflonado.
Acopla el electrodo y la sonda de temperatura, de manera que no toquen las paredes ni
tropiecen con el imán. Si el volumen no es suficiente para cubrir el orificio del puente salino,
añade más agua destilada. La bureta debe de verter en el vaso sin tocar al electrodo ni la
sonda.
5. Pulsa el botón de lectura continua del pH-metro y añade lentamente hasta pH 7.0.
6. Anota el volumen de NaOH 0,1 N consumido.
7. Realiza la determinación por duplicado, añadiendo más lentamente cuando se aproxime a
pH 7.0.
8. Retira y lava el electrodo y la sonda, colocando después el tapón y el capuchón protector
con líquido de conservación, según indicaciones del fabricante.

Cálculos:

si se utiliza factor

donde:
AT: Acidez total expresada en gramos de ácido tartárico por litro.
v: Media aritmética del volumen, en ml, de solución de hidróxido de sodio consumida.
N: Concentración Normal (equivalentes/litro) del hidróxido de sodio.
f: Factor de corrección para la concentración.
75: Peso equivalente del ácido tartárico (o 49 en el caso del ácido sulfúrico, en caso de
expresarla en este ácido).

CURVA DE VALORACIÓN Y DERIVADA

Cuando se pretende determinar exactamente el punto de equivalencia, se recurre a la curva

de calibrado, pues cuando se hace la derivada 1ª de la curva, nos aparecerá un pico en el
volumen correspondiente a dicho punto.
SULFUROSO POR POTENCIOMETRÍA

Se puede hacer la determinación de sulfuroso libre y total mediante la aplicación de la

potenciometría aunque con matizaciones.

En primer lugar, ya no se trata de una volumetría de neutralización, ya que se trata de una

volumetría de oxidación reducción o Redox, en la que el reactivo valorante es una disolución
de yodo, que actúa como oxidante del dióxido de azufre. Por lo tanto ya no es válido un pH-
metro, sino que necesitamos un potenciómetro graduado en milivoltios y un electrodo
sensible a la variación del potencial.

Este electrodo es denominado, por lógica, electrodo Redox, y es un electrodo de platino o de

oro. Como electrodo de referencia se puede utilizar el de plata-cloruro de plata, aunque lo
más normal es usar un electrodo combinado, generalmente con un electrodo Redox de platino
y un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata en una sola carcasa.

Otra diferencia con respecto al uso del pH-metro, es que los métodos de análisis no se basan
en valoraciones a un valor final de potencial, sino que es necesario calcular el punto de
equivalencia dentro del intervalo. El procedimiento para el sulfuroso libre y total es el
siguiente:

Material y reactivos:
- Potenciómetro con lecturas en milivoltios y electrodo combinado para medida de potencial.
- Agitador magnético e imán teflonado.
- Bureta de 25 ml, clase A (si es posible con banda azul), con soporte y pinza de sujeción.
- Vaso de precipitado de 50 mililitros.
- Solución Patrón de 220 milivoltios tamponada a pH 7,0.
- Ácido sulfúrico 1/3 (670 ml de agua destilada + 330 ml de ácido sulfúrico concentrado).
- Solución valorada de yodo 0,02 N.
- NaOH 1 N. (40 gramos de NaOH por litro de agua destilada).

Preparación del equipo de medida:

1. Tras encender el equipo y comprobar que las señales son correctas, acopla el electrodo
combinado y la sonda de temperatura y comprueba su funcionamiento.
2. Retira el capuchón protector del electrodo y lava con agua destilada.
3. Calibra el equipo con la solución patrón de 220 mV.

Procedimiento de análisis:
4. Monta la bureta y enrásala con la solución valorada de yodo 0,02 N.
5. Toma 10 ml de muestra y pásalas al vaso de valoración, añadiendo 5 ml de ácido sulfúrico
1/3.
6. Coloca sobre el agitador magnético e introduce un imán. Acopla el electrodo de manera
que no toque las paredes ni tropiece con el imán. Si el volumen no es suficiente para cubrir el
orificio del puente salino, añade agua destilada. La bureta debe verter en el vaso sin que
alcance al electrodo.
7. Pulsa el botón de lectura continua del potenciómetro y añade lentamente la solución
valorada de yodo 0,02 N hasta que se produzca un incremento brusco del potencial.
8. Anota el volumen de yodo 0,02 N y continúa añadiendo un par de mililitros más, por si no
se trataba del punto de equivalencia. Sea V' el volumen de yodo consumido.
9. Toma otros 10 ml de vino y mézclalos con 10 ml de NaOH 1N. Espera 15 minutos. Vierte, de
golpe, 5 ml de ácido sulfúrico 1/3 y procede de igual forma que el anterior. Sea V' el volumen
de yodo consumido.
10. Realiza la determinación por duplicado, añadiendo la solución de yodo más lentamente,
cuando se aproxime al salto de potencial de la valoración anterior. Sería interesante que
comprobaras el resultado, con la aplicación de hoja de cálculo.
11. Retira y lava el electrodo y la sonda, colocando después el capuchón protector con líquido
de conservación, según indicaciones del fabricante.

Cálculos:
SO2 libre (mg/L)=V x 64 o SO2 Total(mg/L)=V' x 64 donde V y V' son los volúmenes de Yodo
N/50 consumidos.
AUTOMATIZACIÓN DE LOS MÉTODOS POTENCIOMÉTRICOS

El uso de las técnicas de electroanálisis, facilita ciertos procedimientos de análisis a la vez

que incrementa la exactitud y precisión de los resultados obtenidos.

Pero eso no es todo, pues el hecho de que sea un equipo el que detecte el punto final de la
volumetría, permite abordar la idea de automatizar el proceso en mayor o menor medida.

Así, por una parte se han diseñado dosificadores automáticos de gran precisión y exactitud,
mediante bombas peristálticas u otros mecanismos, que sustituyen con éxito a las buretas, y
por otra evitan la manipulación de los reactivos valorantes.

Al intervenir menos los operarios de laboratorio, se eliminan los posibles errores que se
puedan cometer en la manipulación. Piensa en el cierre y apertura de las llaves de la bureta,
en la realización del enrase de la misma, en la lectura del volumen consumido, etc.

Otro aspecto que se automatiza es la detección del punto final, de tal manera que es el
propio equipo quien detiene el proceso, sin la duda que pueda generar la interpretación del
mismo.

El siguiente paso es la automatización de los cálculos, operación ésta muy superada en la

actualidad, con numerosas aplicaciones de software y hardware.

Con todo ello se logran componer equipos conocidos como valoradores automáticos o
también titradores, aunque esta denominación proviene de una adaptación de la lengua
inglesa y a pesar de que su uso está extendido, es un término que no figura en el diccionario
de la RAE.

Con este tipo de equipos, la realización de los procedimientos es más fácil y rápida, lo que
supone una reducción del coste por análisis, siempre que se supere un número de muestras
determinada y variable para cada equipo.

Aún así, el operario u operaria de laboratorio, deberá hacer un correcto mantenimiento,

puesta a punto y calibrado de los equipos, con la frecuencia necesaria, para garantizar la
trazabilidad de los resultados analíticos.
MÉTODOS ÓPTICOS: TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS

El fundamento de los métodos ópticos es la interacción de la radiación electromagnética con

la materia.

La radiación electromagnética es una combinación de campos eléctricos y magnéticos

oscilantes, que se propagan a través del espacio, transportando energía de un lugar a otro, a
una velocidad constante en cada medio.

Las formas más conocidas de esta energía, son la luz y el calor radiante. Otras, son los rayos X
o la radiación ultravioleta, tantas veces mencionada en relación a la capa de ozono o a los
problemas cutáneos que provoca, por no hablar de las microondas ya establecidas en nuestra
vida cotidiana.

Pero una radiación electromagnética, puede comportarse simultáneamente como una onda y
como un haz o paquete de partículas, llamadas fotones. Esta dualidad onda corpúsculo fue
causa de numerosos estudios que, a la postre, concluyeron en las ecuaciones que las
caracterizan. Así, podemos decir que la energía transportada por un fotón, es proporcional a
la frecuencia de la onda asociada, a través de la constante de Max Planck.

E = h · ν en la que h es la constante de Planck, cuyo valor es 6,626 x 10-34 julios x segundo y

v es la frecuencia en hercios (Hz) (1 Hz equivale a 1 partido por segundo (s.-1))

Considerando la radiación como una onda, podemos decir que su frecuencia está relacionada
con la longitud de onda a través de una constante, que es la velocidad de la luz en el medio,
según la expresión:

v = c/λ lo que implica que E = h x c/λ

Por esta expresión llegariamos a la conclusión de que cuanto menor es la longitud de onda de
una radiación electromagnética, mayor será su frecuencia y por lo tanto será mayor la
energía asociada.

Pues bien, la luz solar se compone de un elevado número de radiaciones electromagnéticas,

atendiendo a los parámetros anteriores, se clasifica en diferentes agrupaciones o regiones en
función de su longitud de onda, o lo que es lo mismo de la energía que transporta. Si ordenas
distintas regiones del espectro electromagnético de la radiación solar, de mayor a menor
energía, tendrás la secuencia siguiente:

Rayos γ → Rayos X → Ultravioleta → Visible → Infrarrojo → Microondas → Ondas de radio

Desde el punto de vista analítico, existen diversos criterios de clasificación de los métodos
basados en el uso de la radiación electromagnética. Teniendo en cuenta las técnicas
utilizadas en la actualidad en enología, te proponemos la siguiente clasificación:

- Técnicas espectroscópicas: Cuando se basan en los efectos que provoca la radiación sobre
los analitos y que dependerá de la naturaleza y características de la radiación y del analito.

- Técnicas no espectroscópicas: Se basan en los cambios que provocan las características de

los analitos sobre la radiación electromagnética.

TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS. FUNDAMENTO TEÓRICO

Las técnicas espectroscópicas más comunes en laboratorios enológicos, se basan en la

interacción de la materia con radiaciones de las regionesultravioleta, visible e infrarrojo. Se
trata de radiaciones cuyas longitudes de onda oscilan entre 180 y 780 nanómetros para el
ultravioleta visible y entre 0,78 y 5 micrómetros para el Infrarrojo cercano y medio.

La interacción entre la materia y la radiación de estas regiones del espectro, con más o
menos restricciones, está regulada por la ley de Beer.

Supongamos un haz de radiación paralela, que atraviesa una solución absorbente de

concentración c, a lo largo de una distancia d. A causa de la interacción entre los fotones y
las partículas absorbentes, la potencia incidente P0 sufre una atenuación con respecto a la
potencia P de la radiación saliente.

Definimos el parámetro Transmitancia como

que también se puede expresar como porcentaje

A su vez definimos también el parámetro Absorbancia.

Según la ley de Beer, la Absorbancia viene dada por la expresión A = d · c · a , donde d es la

longitud de la trayectoria a través de la solución, c es la concentración de la solución y a es
una constante conocida como absortividad. La magnitud de a depende de las unidades en que
se exprese b y c, siendo litro dividido por gramo y centímetro ( L g-1 cm-1) cuando se expresa
la concentración en gramos por litro y d en centímetros.

Cuando la concentración se expresa en moles por litro, esta constante se

denomina absortividad molar y se representa por e. En ambos casos, se trata de una
constante que depende de la longitud de onda y de la naturaleza de la disolución, por lo que
para una misma sustancia, a una longitud de onda determinada y utilizando un portamuestras
de las mismas dimensiones, podemos decir que entre la Absorbancia y la concentración hay
una relación lineal. Este es el fundamento de las determinaciones basadas en la absorción de
radiación visible y ultravioleta, así como algunas de infrarrojo.

Por supuesto que existen desviaciones de este comportamiento, pero la puesta a punto de los
métodos analíticos, suele ser suficiente para evitar su incidencia.

El procedimiento general de trabajo para los métodos espectroscópicos se basa en aplicar la

ley de Beer, construyendo una curva de calibrado con patrones de la misma composición que
el analito. Si se cumple dicha ley, obtendremos la ecuación de una recta, obtenida mediante
una regresión lineal:

A = b[C] + a en la que A mayúscula es el valor de la lectura de Absorbancia de la muestra,

a minúscula la ordenada en el origen, [C] será su concentración y b minúscula es la
pendiente de la recta.

A pesar de que los equipos actuales llevan incorporado un procesador que realiza los cálculos
y nos da el resultado directamente en una pantalla, en las unidades que se prefiera, es
interesante que construyas la curva de calibrado con las lecturas de patrones y compruebes la
linealidad de la misma, mediante el coeficiente de correlación.

CURVA DE CALIBRADO

1. En una hoja de Excel registramos los datos de la curva de calibrado, poniendo los valores
de la concentración de los patrones en una columna y los valores de la absorbancia de cada
lectura en otra columna diferente.

2. Una vez introducidos los datos, buscamos la representación gráfica de los mismos, para lo
cual vamos a la barra de herramientas superior y hacemos clic en Insertar, seleccionando
insertar Gráfico.

3. Se abrirá el asistente para gráficos, donde deberemos seleccionar el tipo de gráfico, que
para este caso será XY (Dispersión). En el subtipo de gráfico, seleccionaremos "Dispersión.
Compara pares de valores".

4. Nos aparecerá el cuadro de diálogo siguiente:

Tendremos que introducir el Rango de datos, tal y como se muestra en el ejemplo, señalando
en qué columnas y líneas están los datos. También se puede hacer arrastrando el cursor con
el ratón.

5. Haciendo clic en Serie, podemos observar y cambiar cuales son los datos que aparecerán
en el eje X y en el eje Y, así como dar nombre a la serie.

6. Haciendo clic en Siguiente, aparecerá un cuadro de diálogo como el expuesto a

continuación:

En las casillas correspondientes, podemos añadir los nombres del Gráfico, del eje X y del eje
Y. También podemos modificar el aspecto y las divisiones de los ejes y del área de trazado.

7. El siguiente paso nos lleva a decidir la ubicación del gráfico, en una nueva hoja o en la
misma en la que se encuentran los datos.
8. Una vez que tenemos el gráfico, podemos modificar su aspecto, pinchando con el botón
derecho del ratón sobre las distintas partes del gráfico (ejes, área de gráfico, rótulos, etc),
buscando el aspecto que más nos guste.

9. Si hacemos clic con el botón derecho sobre los puntos de la serie de datos, nos aparecerá
un cuadro de diálogo como el siguiente:

10. Haciendo clic sobre Agregar línea de tendencia, nos aparecerá otro cuadro de diálogo en
el que seleccionaremos Tipo Lineal.
11. En la pestaña de Opciones, marcamos la casilla que nos permite Presentar la ecuación y
el valor de R cuadrado en el gráfico. Además nos permite fijar los valores de extrapolación
hacia delante y hacia atrás.

12. De esta manera obtendremos la ecuación de la recta de calibrado, que nos permitirá
realizar los cálculos con los valores de la absorbancia de las diferentes muestras analizadas.

Para que la ecuación se aproxime a la de una recta y por lo tanto se cumpla la ley de Beer, el
coeficiente R cuadrado tiene que tener un valor próximo a 1.
Ejemplo:
- Lectura de absorbancia de la muestra A: 0,387
- La ecuación de la recta de calibrado es: y = 0,001x - 0,0007 y R cuadrado es 0,999.
- Sustituyendo en la ecuación: 0,387 = 0,001x - 0,0007, por lo que el valor de la concentración
de la muestra A será de x = (0,387 + 0,0007) / 0,001 = 387,7 ppm de Fe.

ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

Se denomina región visible del espectro, porque es la región, que es capaz de percibir el ojo
humano, desde las radiaciones de 700 nm de longitud de onda, correspondientes al color rojo
hasta los 380 - 400 nm del violeta y azul. Por debajo empieza el ultravioleta, no visible para
los humanos, pero sí para los insectos.

Cuando una radiación de la región visible interacciona con la materia, es capaz de provocar,
en algunos casos, excitación electrónica y tránsitos de los electrones a orbitales de mayor
energía. Pero dado que los distintos estados energéticos están cuantificados, la energía
aportada ha de ser justamente la adecuada. Para lograr una cantidad de energía
determinada, seleccionaremos cual es la longitud de onda de radiación que la aporta.

Las técnicas de análisis de espectroscopia Ultravioleta - Visible, se basan en convertir al

analito en una especie absorbente en esta región.

En algunos casos, el propio analito es una especie absorbente y no necesita transformación

alguna, pero en un elevado número de casos, necesita de una transformación química para
convertirse en especie absorbente. La formación de compuestos complejos con enzimas, es
una buena fuente de obtención de especies absorbentes.

Por lo tanto, la puesta a punto de los procedimientos analíticos, empiezan por buscar la
especie absorbente y la longitud de onda a la cual presentan una buena absorción y que será
específica para cada especie.

Prepararemos una solución de la concentración adecuada del analito y a realizar la lectura de

Absorbancia o Transmitancia a esa longitud de onda.

Una vez solventada esta fase, se debe encontrar una relación numérica entre la lectura y la
concentración del analito (ley de Beer), realizando una curva de calibrado con una serie de
disoluciones patrón de diferentes concentraciones, pero todas ellas próximas a la del analito.

El siguiente esquema representa un equipo básico de espectroscopia ultravioleta visible:

Las cubetas portamuestras han de ser estar perfectamente limpias y sin rayazos, pues
originarían una lectura errónea. Además, el material de construcción será resistente a las
condiciones de uso y no presentar absorción a las longitudes de onda de trabajo.

Para el utravioleta necesitamos cubetas de cuarzo, mientras que para el visible el vidrio es
suficiente (también puede utilizarse cuarzo en el visible). En la actualidad existen materiales
plásticos válidos para ambas regiones (las de plástico normal sólo se pueden usar para el
visible).

Lo ideal es que las lecturas de las soluciones patrón y la solución del analito se hagan con la
misma cubeta, eliminando así una posible causa de error, aunque también puedes usar
cubetas plásticas desechables contrastadas.

Son muchos los procedimientos espectroscópicos diseñados para enología, incluso varios para
un mismo parámetro, por lo que, a continuación, veremos solamente algunos de ellos, a modo
de ejemplo.

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO L(-) MÁLICO

El ácido málico está presente en los mostos y es transformado, en parte o en su totalidad, en

ácido láctico mediante la fermentación maloláctica. Por ello es una determinación habitual
en enología.

Fundamento teórico:

El método analítico se fundamenta en la oxidación del ácido L(-) málico (en forma de L-
malato) a oxalacetato, catalizado por la enzima L-malato deshidrogenasa (L-MDH) en
presencia de NAD.

L- malato + NAD+ + L-MDH ↔ oxalacetato +NADH + H+

Oxalacetato + L-glutamato + GOT ↔ L-aspartato + α- cetoglutarato

Para desplazar el equilibrio hacia la derecha, se necesita de la presencia de L-glutamato y la

enzima GOT (Glutamato oxalacetato transaminasa).

Según esta reacción, la cantidad de NADH formado es equivalente a la cantidad de L-malato

que es oxidado.

El NADH presenta un máximo de absorción a 340 nm, por lo que puede ser cuantificado por
espectrofotometría de absorción ultravioleta - visible, a esta longitud de onda.

Material y reactivos:
- Espectrofotómetro ultravioleta visible para lectura a 340 nm.
- Cubetas contrastadas de 1 cm.
- Pipetas automáticas reguladas a 10 µl, 200 µl, 900 µl y 1000 µl.
- Material general de laboratorio y preparación de muestra.
- Kit de reactivos para determinación enzimática de ácido L-málico.
- Agua bidestilada.
- Solución patrón de ácido L(-)málico de 0,2 gramos por litro.

Procedimiento de análisis:
1. Al ser un método enzimático los tiempos y secuencias deben de ser muy rigurosos, según
instrucciones del kit.
2. Enciende el equipo con suficiente antelación para que la señal sea estable (normalmente
30 minutos).
3. Selecciona una longitud de onda de 340 nanómetros.
4. Prepara 4 patrones por dilución, entre 0,03 y 0,3 gramos de ácido L(-)málico por litro.
5. Centrifuga el vino o mosto a 3.000 rpm durante 3 minutos.
6. Diluye la muestra (hasta que contenga menos de 2 gramos de ácido L(-)málico por litro).
7. Prepara 1 cubeta contrastada para el blanco, cuatro para los patrones y dos para la
muestra (duplicado).
8. Añade los reactivos del kit en el orden y la secuencia de tiempos indicado en las
instrucciones.
9. Ajusta el equipo a cero de Absorbancia con la cubeta del blanco. Realiza las lecturas de los
patrones y las muestras para analizar. La Absorbancia de las muestras debe ser intermedia a
la de los patrones.
10. Limpia todo el material, cuidando que no queden restos en el equipo de medida.

Cálculos:

a. Si tu equipo tiene autocalibrado, aplica la expresión que figura en las instrucciones del kit:
C = 0,473 · ΔA ·f, donde ΔA es la diferencia de Absorbancia antes y después de añadir L-
MDH, C mayúscula es la concentración en gramos de ácido L(-) málico por litro y f es el factor
de dilución de la muestra.

b. Sin autocalibrado, representa la curva de calibrado en papel milimetrado o en una

aplicación informática, tipo hoja de cálculo, poniendo en el eje de abscisas la concentración
de los patrones y en el de ordenadas la lectura de Absorbancia.

Traza la recta promedio o realiza el ajuste por mínimos cuadrados. Con la lectura de la
Absorbancia de la muestra, busca en la gráfica el valor correspondiente a la concentración de
la misma. Compara el resultado con el obtenido mediante la fórmula. Puedes recurrir de
nuevo al para saber más del apartado.
DETERMINACIÓN DE LAS CARACTARÍSTICAS CROMÁTICAS

El color de los vinos es una característica importante en la fase visual de la cata, debido a
que puede llevar asociado muchas connotaciones sobre el estado del vino. Pero desde el
punto de vista cuantitativo, es conveniente que seber que no hay un criterio demasiado
uniforme al respecto. El método de referencia busca una definición del color, basado en el
diagrama tricromático de la Comisión Internacional del Alumbrado (CIE), mientras que el
método usual aplicable a vinos tintos y rosados, se basa en la definición de intensidad
colorante y la tonalidad.

Fundamento teórico:
- Se trata de un método espectrofotométrico, en el que la intensidad colorante se define
como las suma de las Absorbancias obtenidas, en cubetas de 1 cm, a las longitudes de onda
de 420, 520 y 620 nm, mientras que la Tonalidad se expresa como la relación entre la
Absorbancia a 420 nm y la Absorbancia a 520 nm.

Material y Reactivos:
- Espectrofotómetro ultravioleta - visible para lectura desde 300 a 700 nm.
- Cubetas contrastadas de 0.1, 0.2, 0.5 y 1 cm.
- Centrífuga que permita 3000 rpm.
- Matraz kitasato y trompa de agua para generar vacío.
- Agua destilada

Procedimiento de análisis:
1. Clarifica el vino por centrifugación a 3000 rpm, 3 minutos o fíltralo por membrana.
2. Elimina el dióxido de carbono, si lo hubiese, agitando mientras se hace vacío.
3. Elige la cubeta en función del vino (el camino óptico de la cubeta, es decir su espesor,
entre 0,1 y 1cm), de manera que permita una lectura de Absorbancia entre 0,3 y 0,7.
4. Para cada longitud de onda, ajustar a 0 de Absorbancia con agua destilada.
5. Realiza la lectura de Absorbancia de las muestras, después de ajustar a 0, a las longitudes
de onda de 420, 520 y 620 nm.
6. Lava el equipo y limpia los posibles vertidos o salpicaduras.

Cálculos:
- Si utilizas cubetas que no sean de 1 cm, deberás dividir las lecturas entre el camino óptico
utilizado (en cm).

La Intensidad Colorante (I) viene dada por la expresión:

expresada con 3 decimales.

La Tonalidad (N) viene dada por la expresión:

expresada con 3 decimales.

ÍNDICE DE POLIFENOLES TOTALES

Fundamento teórico:
Se trata de un método espectrofotométrico, en el que el Índice de Polifenoles Totales (IPT) se
obtiene de la lectura de la Absorbancia a 280 nm de una dilución 1/50 o 1/100 del vino
limpio. A 280 nm es la longitud de onda en la que absorben los anillos bencénicos,
componentes de los compuestos fenólicos.

Material y Reactivos:
- Espectrofotómetro ultravioleta - visible para lectura desde 220 a 700 nm.
- Cubetas contrastadas de 1 cm.
- Centrífuga que permita 3000 rpm.
- Matraz kitasato y trompa de agua para generar vacío.
- Agua destilada

Procedimiento de análisis:
- Clarifica el vino por centrifugación a 3000 rpm, 3 minutos o fíltralo por membrana.
- Elimina el dióxido de carbono, si lo hubiese, agitando mientras se hace vacío.
- Prepara una dilución con agua destilada, 1/100 para vinos tintos y 1/10 para vinos blancos.
- Selecciona una longitud de onda de 280 nm, ajusta a cero con agua destilada y lee la
Absorbancia de la dilución 1/10 o la 1/100.
- Lava el material y limpia el espectrofotómetro de posibles derrames o salpicaduras.

Cálculos:
El Índice de Polifenoles Totales (IPT) viene dado por la expresión:
siendo f el factor de dilución.
También podríamos determinar antocianos y otros parámetros, pero los procedimientos de
trabajo con el espectrofotómetro son todos muy semejantes.
ESPECTROSCOPIA INFRARROJA

La región del infrarrojo comprende las radiaciones con una longitud de onda entre 0,78 y 1000
µm y que se divide en 3 subregiones que son el Infrarrojo cercano, medio y lejano. En
procedimientos analíticos, se suele trabajar entre 2,5 y 25 µm, aunque ya se están utilizando
longitudes de onda mayores.

Cuando una sustancia absorbe en el infrarrojo, provoca un cambio neto en el momento

bipolar, al modificarse los estados de vibración y rotación. Las moléculas orgánicas tienen, en
su estructura, numerosos enlaces entre átomos de diferente densidad electrónica, por lo que
son moléculas con enlaces polares. Cuando estas moléculas interaccionan con la radiación
infrarroja, se producen cambios en la forma o intensidad de la vibración y/o rotación. Dado
que estos estados vibracionales son característicos de cada tipo de enlace y están
cuantificados, podemos utilizar esta característica para lograr una aplicación analítica.

Así existen numerosas técnicas cualitativas y cuantitativas basadas en la espectroscopia con

radiación infrarroja. Estas técnicas, presentan la ventaja de ser muy selectivas, lo que
permite determinar analitos presentes en mezclas sin necesidad de aislar el analito.

Así, si realizamos la medida de la Absorbancia o Transmitancia de una sustancia, en las

diferentes longitudes de onda de la región Infrarroja, obtendremos lo que se conoce como
un espectro de absorción, donde representados gráficamente, figuran una serie de picos,
cada uno de los cuales se asocia a una función o tipo de enlace determinado. Es como si
tienes una huella de cada compuesto químico (siempre que absorba en esta región del
espectro). Este espectro es característico para cada compuesto y solo los isómeros presentan
espectros muy semejantes. Esta circunstancia ofrece una enorme gama de posibilidades
dentro del análisis cualitativo y cuantitativo.

La incorporación de una aplicación matemática conocida como Transformada de Fourier,

permite optimizar los parámetros espectroscópicos, al simplificar los componentes de los
equipos. Además los equipos con esta aplicación son más exactos y precisos, al permitir una
óptima selección de longitud de onda. Presentan, además, la ventaja de ser mucho más
rápidos que los equipos que no la llevan.

A estas ventajas, debemos añadir que las actuales técnicas analíticas en infrarrojo, no suelen
necesitar muchos reactivos, ni un proceso de preparación de la muestra (acaso alguna
dilución), lo cual disminuye el coste y el tiempo por análisis.

Es común que encuentres equipos de espectroscopia infrarroja asociados a otras técnicas

instrumentales, como detectores para cromatografía o técnicas de inyección en flujo, que no
son objeto de esta unidad de trabajo.

En la actualidad ya existen equipos analíticos basados en espectroscopia infrarroja con

Transformada de Fourier (FTIR) a un coste asequible, que permiten
determinaciones multiparamétricas, incluso a partir de una sola gota de vino o mosto.
MÉTODOS ÓPTICOS. TÉCNICAS NO ESPECTROSCÓPICAS

Existen otra serie de técnicas analíticas, cuyo fundamento está también relacionado con la
luz, como son las técnicas refractométricas y turbidimétricas.

Teniendo en cuenta las aplicaciones en el ámbito de la enología, vamos a exponer las técnicas
basadas en:

Refracción de la luz:

Por ejemplo observado un objeto semisumergido en el agua, como los remos de una
embarcación y la sensación que percibes es que parece que se deforma. Pues ese efecto
óptico se debe a la refracción.

Refracción es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un

medio transparente a otro diferente, pero también transparente.

Este cambio de dirección también ocurre en un mismo medio al cambiar la temperatura, pues
una variación de la misma implica un cambio de la densidad, lo que provoca que la luz se
transmita a una velocidad distinta en función de la densidad de cada medio.

Se denomina Índice de Refracción (n) de un medio transparente, al cociente entre la

velocidad de la luz en el vacío (c) y la velocidad que tiene en ese medio (v). n = c/v

Su valor es adimensional y siempre superior a 1.

La refracción se caracteriza por dos leyes que son:

Primera ley: El rayo de luz incidente, el refractado y la normal están en el mismo plano.

Segunda ley: Si i es el ángulo del rayo incidente y r el ángulo del rayo refractado con
respecto a la normal, n1 el Índice de Refracción del medio 1 (aire en el dibujo) y n2 el Índice
de Refracción del medio 2 (agua en el dibujo), se cumple que

n1·sen i = n2· sen r Esta ley se conoce como Ley de Snell.

Dispersión o esparcimiento de la luz:

Cuando un rayo de luz atraviesa una solución coloidal, con partículas en suspensión, una parte
de la radiación es transmitida, mientras que otra fracción es esparcida en todas las
direcciones debido al choque con las mismas. Este fenómeno se conoce como efecto Tyndall.
Este efecto, es el que nos permite ser capaces de percibir un haz luminoso a través de una
solución con partículas en suspensión, o simplemente a través del aire con polvo en
suspensión, como un rayo de sol cuando entra en una habitación oscura.

Si en lugar de una suspensión, se tratase de una solución verdadera, no podrías percibir dicha
trayectoria.

Podemos decir que la denominada luz de Tyndall o luz difusa, se debe a un fenómeno físico,
prácticamente independiente de cual sea la composición química de las partículas en
suspensión.

REFRACTOMETRÍA

La refractometría es una técnica habitual en el ámbito del análisis enológico.

Por ejemplo un refractómetro de mano es un pequeño instrumento en el que se exprime una

uva y se pone delante de un ojo, sirve para comprobar el grado de maduración en época de
vendimia.

El Índice de Refracción del agua en relación con el aire a 20ºC, es 1,333. Si en el agua
disolvemos, por ejemplo sacarosa, el índice de refracción de la disolución será mayor que el
del agua pura y aumentará a medida que aumenta la cantidad disuelta. Así, es posible
relacionar el contenido en azúcares de una disolución con el Índice de Refracción.

Basándose en esta relación, se fabrican equipos con distintas escalas adaptadas al tipo de
muestra. Para enología están graduados en Grados Baume, Grados Brix o en Grado alcohólico
probable, que nos permiten hacer una lectura directa a partir de una pequeña fracción de
mosto, siendo común su uso para control de maduración. Con los nuevos refractómetros
digitales, eres tú quien selecciona la escala de lectura. Existen diferentes tablas que
relacionan unas unidades con otras, pero las relaciones aproximadas entre estas escalas
podemos calcularlas con las fórmulas siguientes:

ºBrix = ºBe x 1,8 ºBrix = (600,90502 x n) – 799,58215 ºAlcohólico probable = ºBrix x

0,59

El valor del Índice de Refracción varía con la temperatura, por lo que tienes dos alternativas:
hacer la lectura cuando la muestra a 20 ºC o utilizar un refractómetro equipado con un
sistema de compensación de temperatura, que en la actualidad son la mayoría.

El procedimiento de uso de un refractómetro es el siguiente:

- Deja que el aparato alcance la temperatura ambiente, para que el sistema de compensación
de temperatura sea lo suficientemente rápido.
- Limpia los prismas o el portamuestras con una toallita de papel y agua destilada.
- Comprueba el ajuste del aparato, poniendo como muestra agua destilada, debiendo dar una
lectura de 1,333 para el Índice de Refracción o 0 en la escala de ºBrix. De no ser así, consulta
el manual de instrucciones y realiza el ajuste correspondiente.
- Pon una gota de mosto entre los prismas o en el dispositivo portamuestras y haz la lectura,
anotando el resultado de la escala elegida.
- Limpia con agua el refractómetro y sécalo con la toallita de papel.
TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA

La visión del trayecto de un rayo de sol entre las nubes o las bonitas fotografías de un bosque
con niebla: Estas impresionantes imágenes, se deben a un fenómeno de dispersión o
esparcimiento de la luz.

Así basados en este efecto, se desarrollaron las técnicas analíticas

de Turbidimetría y Nefelometría.

El fenómeno de esparcimiento de la luz por parte de las partículas en suspensión, es conocido

como efecto Tyndall. Este efecto es más intenso cuanto menor sea la longitud de onda de la
radiación incidente. Por ello, el azul y el violeta se corresponden con la radiación de menor
longitud de onda (400 nm) dentro de la región visible y es por esta causa que el cielo y el
mar, los vemos siempre con un tono azulado.

La diferencia entre Turbidimetría y Nefelometría, sólo se debe a sistemas de equipamiento

instrumental a la hora de detectar la radiación, pues mientras la Turbidimetría mide la luz
transmitida en la misma dirección de la luz incidente, la Nefelometría mide la radiación
esparcida a 90 grados con respeto a la radiación incidente. Hoy se habla genéricamente
de turbidímetros, para designar a los equipos de medida, sea cual fuere su sistema de
detección, aunque también se utiliza el término de nefelómetro.

En disoluciones verdaderas, podemos aplicar técnicas espectroscópicas, mientras que si

existen partículas en suspensión emplearemos técnicas no espectroscópicas.

Estas técnicas son utilizadas en análisis enológico para la determinación de la turbidez de las
suspensiones. Son de gran interés en los procesos de clarificación, en los procesos que tienen
presencia de lías, etc.

Los métodos turbidimétricos nos permiten determinar turbiedades midiendo la luz esparcida,
por comparación con patrones de referencia, que son soluciones coloidales muy estables. Uno
de los más utilizados es el compuesto por una suspensión de formacina.

La turbidez se mide en Unidades Nefelométricas de Turbidez (NTU). Un NTU equivale a la

turbidez que presenta una suspensión con una concentración de 7,5 ppm de sílice (SiO2) o una
suspensión con una concentración de 1 ppm de formacina estándar.

DETERMINACIÓN DE LA TURBIDEZ

En la actualidad el mercado exige vinos limpios y sin sólidos en suspensión, sea cual sea su
naturaleza, lo cual obliga a que las técnicas de clarificación tengan una especial importancia
en los procesos de elaboración.

También en el proceso de fermentación, la medida de la turbidez ayuda al control del

proceso, al igual que durante las crianzas sobre lías.
Para determinar la turbidez, se suelen utilizar equipos de laboratorio o portátiles, existiendo
una amplia oferta en el mercado con detección nefelométrica.

El procedimiento genérico para una determinación de turbidez en vinos o mostos, es el

siguiente:

1. Enciende el equipo con antelación suficiente, para conseguir la estabilidad de la señal

luminosa.
2. Realiza el calibrado del aparato utilizando los patrones adecuados, siguiendo el manual de
uso o la instrucción técnica correspondiente. Lo más habitual es utilizar 3 ó 4 patrones de
diferente grado de turbidez. Para ello, debes de tener en cuenta que los patrones han de
aproximarse al rango de medida que vas a necesitar, pues no es lo mismo determinar la
turbidez de un producto acabado, con patrones de 0 a 10 NTU, que la de un producto en
elaboración, donde hablamos de turbiedades entre 100 y 1000 NTU.
3. Normalmente, los patrones se suministran directamente en la cubeta de medida, por lo
que se debe evitar su manipulación. Lo que sí es imprescindible, es comprobar su fecha de
caducidad, ya que al tratarse de soluciones coloidales, su estabilidad puede variar con el paso
del tiempo.
4. Comprueba que las cubetas o viales están limpias y secas.
5. Llena la cubeta hasta el aforo y tápala. Homogeneiza la muestra, invirtiendo varias veces
la cubeta o vial. Es importante lograr una suspensión homogénea.
6. Limpia el exterior del vial y pon un poco de aceite de silicona en el exterior del vial,
distribuyéndolo con un paño suave. El objeto del aceite es evitar daños en la superficie del
vial o cubeta.
7. Introduce el vial en el equipo, asegurándote de posicionarlo según las marcas y cierra la
tapa.
8. Selecciona lectura estable o continua en función del tipo de determinación.
9. Efectúa la lectura de la muestra, expresando su resultado en NTU.

Es importante que te asegures de que las cubetas o viales están contrastadas, pero de todas
formas es conveniente que realices periódicamente la comprobación.

Para ello, llena la cubeta con una muestra, elige la función de medida continua y vete
girando la cubeta o vial durante una vuelta completa, prestando atención a la lectura de la
pantalla. La posición que coincida con la lectura más baja, es la que debes de usar para la
lectura, por lo que debes de marcarla en la cubeta y en el equipo (si no tiene marca).

MÉTODOS DE SEPARACIÓN

Dentro de la química analítica, los métodos para análisis pueden conseguir una mayor o
menor selectividad, pero es muy difícil, por no decir imposible, encontrar un método
específico para un analito determinado.

Así, en la mayoría de las situaciones, antes de realizar el análisis nos vemos obligados a
separar el analito de otros componentes, para evitar las posibles interferencias.

Como métodos de separación, consideramos los métodos de cromatografía y electroforesis,

en ambos casos con todas sus variantes, de los cuales nos centraremos en la cromatografía.

Sin duda, el modo más común para realizar separaciones analíticas es la cromatografía, que
agrupa un gran número de métodos y que permite separar componentes estrechamente
relacionados en mezclas complejas.

La cromatografía se caracteriza por una fase móvil, una fase estacionaria y un sistema de
detección.

Estos métodos tienen en común, que la muestra se disuelve en una fase móvil, que puede ser
un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase
estacionaria inmiscible, que se mantiene fija en una columna o sobre una superficie sólida.
Ambas fases son elegidas con el objeto de conseguir que los distintos componentes de la
muestra atraviesen a distinta velocidad la fase estacionaria. Al final de la columna o placa se
consigue que los componentes lleguen separados.

Los métodos cromatográficos se clasifican según el tipo de fase móvil, estacionaria y el tipo
de equilibrios que se establecen entre ambas.

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICA EN ENOLOGÍA

Las técnicas cromatográficas "sencillas" cada vez se usan menos, mientras que los equipos
modernos es poco probable, a no ser una bodega de dimensiones importantes, pues a pesar
de sus interesantes aplicaciones, el coste y el mantenimiento son elevados.

Si consideramos también el sector de las industrias derivadas, sobre todo el de los destilados
y licores, las técnicas cromatográficas cobran especial relevancia, aunque es necesario
matizar de nuevo, que sólo los laboratorios especializados o las grandes destilerías son
capaces de rentabilizar la elevada inversión.

Las técnicas cromatográficas más utilizadas en el sector enológico son la cromatografía de

gases y la de líquidos, esta última más conocida como HPLC o Cromatografía Líquida de Alta
Resolución. También se utilizan, aunque cada vez menos, las técnicas de cromatografía en
papel y capa fina.

La cromatografía es una técnica de separación y que para que se convierta en una técnica
analítica completa, necesita que un sistema de detección identifique y cuantifique los
distintos componentes de la muestra después de la separación.

El detector elegido será aquél que mejor se adapte a las características físico-químicas del
analito y, a nivel general, los sistemas de detección usados en cromatografía son técnicas
analíticas en sí.
Los equipos que se basan en técnicas cromatográficas de separación y que llevan asociado un
sistema de detección se denominan cromatógrafos.

Si al final de la fase estacionaria colocamos un detector que sea sensible a la presencia de los
componentes del analito y representamos su señal en función del tiempo, se obtiene un
gráfico con una serie de picos, cada uno de los cuales corresponde a un componente. Este
grafico se denomina cromatograma y en su interpretación se obtienen los resultados
analíticos, tanto cualitativos como cuantitativos.

La utilización de la cromatografía como técnica cualitativa, se basa en una magnitud

denominada tiempo de retención, que es el tiempo que tarda un analito en recorrer toda la
fase estacionaria. Simplificando mucho, podemos decir que el tiempo de retención es
característico para cada sustancia, siempre que lo consideremos en un sistema
cromatográfico y en unas condiciones determinadas.

La valoración cuantitativa se basa en calcular el área de cada pico del cromatograma.

Evidentemente, los sistemas informáticos actuales permiten simplificar este proceso.

Como comprenderás, el proceso de obtención de resultados tiene muchas matizaciones,

causas de error y desviaciones, por lo que es necesario disponer de un procedimiento de
calibración con patrones, cuya composición se asemeje a la del analito.

Una de estas causas de errores, se debe a que se trabaja con volúmenes muy pequeños, del
orden de los µL, por lo que un pequeño error en la dosificación, implica un error importante
en el resultado. Para minimizar este error se pueden usar dos métodos:
- Método del estándar o patrón interno: Se introduce en cada muestra y en cada patrón de
calibrado una cantidad exactamente medida de una sustancia patrón interno, de manera que
el detector compare el pico de las muestras y patrones de calibración con el patrón interno.
- Método de la normalización de áreas: Se basa en esperar a que todos los componentes
atraviesen la fase estacionaria. El detector determine cada analito por la relación del área
del pico correspondiente con respecto al área total.

A continuación, se expone brevemente las características de la cromatografía de gases, HPLC

y sus aplicaciones en enología.

CROMATOGRAFÍA DE GASES EN ENOLOGÍA

Con un cromatógrafo de gases, podemos disponer de los datos del contenido de residuos de
productos fitosanitarios, en el momento de la recepción de uvas en la bodega, pudiendo
discriminar la materia prima por este parámetro. Esto puede contribuir a un uso más racional
de estos productos.

A continuación se describe, aunque sea de forma muy resumida, las características de los
cromatógrafos de gases y sus aplicaciones en enología.

El esquema básico de un cromatógrafo de gases es el que tienes en la figura adjunta, en él

observamos que consta de:
- Una Fase móvil gaseosa, que con sus sistemas de regulación, transportará la muestra hasta
el final del recorrido. Se emplean gases inertes como helio, argón, nitrógeno, dióxido de
carbono o hidrógeno.
- Un sistema de inyección de la muestra o los patrones, con sistema de vaporización
instantánea.
- Una columna de diámetro y longitud variable, rellena con la fase estacionaria. Esta columna
está en el interior de un horno, ya que la temperatura permite modificar las condiciones de
desarrollo de la separación.
- Un sistema de detección.
- Sistema de registro o impresión de datos.

Los detectores más usados en cromatografía de gases son el de ionización de llama, como el
representado en el esquema y el de conductividad térmica, aunque ya se utilizan otros más
modernos como el detector de captura de electrones o el de emisión atómica. El
acoplamiento de la cromatografía de gases con la espectroscopia Infrarroja con Transformada
de Fourier, o con la espectrometría de masas, ofrece un amplio campo de posibilidades
analíticas, eso sí, a un elevado coste.
El procedimiento de trabajo para cromatografía de gases, se limita a:
1. Sigue el protocolo de preparación de la muestra, eliminando aquellas interferencias o
diluyendo hasta los rangos permitidos.
2. Prepara el cromatógrafo, controlando la presión y flujo de los gases, así como la
temperatura del horno y espera a que la señal del detector sea constante. Atención al uso de
los gases, pues sin ser alarmistas, su manejo obliga a ser muy rigurosos con los protocolos de
seguridad y buenas prácticas.
3. Añade una cantidad exacta de patrón interno a los patrones y muestras y las inyectas
secuencialmente en el cromatógrafo, esperando el tiempo necesario para permitir
la elución total de la muestra anterior. Deberás inyectar cantidades del orden de 1 µL.
4. Anota o registra los resultados y seguir el protocolo de limpieza y apagado del equipo.

La OIV admite diversos métodos analíticos basados en técnicas de cromatografía de gases, a

la vez que se trabaja en la puesta apunto de nuevos procedimientos. Podemos citar algunas
aplicaciones como: determinación de glicerol, etanol, metanol, alcoholes amílicos y otros
alcoholes superiores, restos de plaguicidas, etc.

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN ENOLOGÍA

Cuando leemos algún artículo técnico en revistas especializadas o en Internet, podemos

comprobar que el acrónimo HPLC es tan usual y está tan extendido, que da la sensación de
que dan por supuesto, que todos los lectores estamos obligados a conocer su significado.

La Cromatografía de líquidos es una técnica de separación, que asociada a los detectores

adecuados, está cobrando mucha importancia en el análisis enológico, ya que son bastantes
los proyectos de investigación que trabajan con esta técnica para lograr la tipificación de los
vinos elaborados con una determinada variedad o mezcla de ellas. En algunos casos, se está
intentando emular a la nariz humana, como rastreadora de aromas, tanto positivos como
negativos, en vinos y productos derivados. Quizás sea la técnica instrumental más vendida en
los últimos tiempos, debido a su sensibilidad, su fácil adaptación a diferentes analitos y la
posibilidad de determinar, con gran exactitud, compuestos no volátiles o termolábiles, que
no podrían ser analizados en fase gaseosa.

El esquema fundamental de un cromatógrafo de líquidos, representado en la figura adjunta,

consta básicamente de los siguientes elementos:
- Fase móvil líquida: Formada por uno o varios disolventes, que se mezclan y pueden usarse
con concentración uniforme o mediante un gradiente de concentración, para optimizar la
separación de los analitos.
- Sistemas de bombeo: Formado por bombas recíprocas o neumáticas, reguladores y otros
dispositivos que deben de garantizar un flujo continuo y libre de pulsaciones, trabajando a
presiones elevadas y fabricados con material resistente a los disolventes.
- Sistema de inyección: Debe permitir la inyección sin despresurizar el sistema y una buena
precisión en la medida, ya que se trabaja con volúmenes muy pequeños, aunque normalmente
superiores a los de cromatografía gaseosa.
- Pre-columna: Sistema de prevención que evita el deterioro de la columna, reteniendo
contaminantes de los disolventes y estabilizando la presión.
- Columna: con diferentes tipos de relleno, según el analito, generalmente fabricadas en
acero y más cortas que las de gases.
- Detector: En HPLC se usan dos tipos de detectores. Los que se basan en medir la variación
de una propiedad de la disolución como puede ser el Índice de refracción, la densidad o
la constante dieléctrica que se modifica por la presencia de los analitos y los que se
fundamentan en medir una propiedad de los analitos, como la espectroscopia ultravioleta, la
espectrometría de masas o los métodos electroquímicos.

El procedimiento de trabajo para HPLC, semejante al de gases, se limita a:

1. Seguir el protocolo de preparación de la muestra, eliminando aquellas interferencias o
diluyendo hasta los rangos permitidos.
2. Preparar el cromatógrafo, programando el caudal y la composición de la fase móvil,
ajustando la presión de trabajo y esperando a que la señal del detector sea constante.
3. Calibra el equipo, si es necesario, con patrones externos o internos.
4. Inyecta un volumen de muestra (del orden de los µL) con la mayor exactitud y precisión
posible.
5. Anota o registra los resultados y seguir el protocolo de limpieza y apagado del equipo.

Las aplicaciones de la HPLC en enología, van desde la determinación de los precursores

aromáticos, ocratoxina, azúcares, antocianos, lisozima, pesticidas o aminas biógenas, etc.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Y CAPA FINA

La comatografía en papel y capa fina, denominadas cromatografías planas, son técnicas
cromatográficas no instrumentales, pero que por relación las veremos aquí. Su fundamento es
el mismo que una cromatografía de columna. En ella la fase móvil es un líquido, el eluyente,
que arrastra a la muestra y la fase estacionaria está extendida sobre la superficie plana de un
material inerte. Puede ser una cromatografía de reparto, si el sólido está impregnado de una
sustancia líquida, o de adsorción, si la fase estacionaria está seca.

El flujo de la fase móvil se debe al fenómeno de capilaridad.

En este tipo de técnicas, la disolución diluida de la muestra, se sitúa sobre el plano que
contiene la fase estacionaria en forma de mancha o banda, a corta distancia de uno de los
extremos del plano.

Una vez seca la mancha se introduce en el eluyente, manteniendo todo el sistema en una
cámara cerrada.

La separación se produce por migración diferencial de los analitos en la dirección en la que se

mueve la fase móvil.

Existen dos tipos de cromatografía plana:

- Cromatografía de papel: La fase estacionaria es un papel de grano homogéneo (Watman

nº1).
- Cromatografía de Capa Fina (TLC): La fase estacionaria es un sólido extendido en forma de
una capa uniforme y muy fina, sobre un soporte de vidrio o aluminio.

La Cromatografía de papel es una cromatografía de reparto, ya que la fase estacionaria es el

agua retenida entre las moléculas de celulosa.

En la Cromatografía de Capa Fina, se utiliza sílice o celulosa y resulta más rápida, eficaz y
versátil. Se dispone en el mercado de placas preparadas en diferentes dimensiones y con
diversas fases estacionarias.

El equipamiento básico para una cromatografía plana es:

- Una cubeta de desarrollo, generalmente de vidrio grueso, para mantener estables las
condiciones y con tapa.
- Pliego de papel Watman nº 1 o placa cromatográfica de sílice.
- Capilares para aplicación de muestras.
- Un secador de pelo.
- Fase móvil adecuada.

Para revelar los distintos componentes sobre el papel o la capa fina, se recurre a procesos de
tinción nebulizados o incorporados en la fase estacionaria. Es común incorporar fluoresceína y
una vez finalizada la cromatografía, se localizan las manchas bajo una luz utravioleta.
ÁCIDOS MÁLICO Y LÁCTICO POR CROMATOGRAFÍA PLANA

La cromatografía en un laboratorio enológico es una técnica que es aplicada para seguir la

fermentación maloláctica, pues es muy fácil y económica además de no necesitar ningún
equipo de análisis instrumental.

Mediante esta técnica podemos detectar la presencia de los ácidos málico y láctico, además
del tartárico. La determinación semicuantitativa o aproximada es posible, pero exige muy
buena mano.

El procedimiento es como sigue:

Material y productos:
- Equipo para cromatografía plana (cubeta, capilares, secador, etc).
- Papel Watman nº 1.
- Ácido acético al 50%
- n-butanol.
- Azul de bromofenol.

Procedimiento:
1. Prepara el eluyente de la fase móvil, mezclando 100 ml de una disolución de azul de
bromofenol de 1g/L en n-butanol con 40 ml de una disolución de acético en agua al 50%.
2. Llena la cubeta con el eluyente hasta una altura de 2 centímetros, tápala y déjala durante
una hora, para lograr saturar la atmósfera con los vapores del eluyente.
3. Prepara una tira de papel Watman nº1 de altura en función del tipo de cubeta que
dispongas (20 cm).
4. Con un lápiz, traza una línea horizontal a unos 3-4 cm del borde inferior de la hoja. Marca
tantos puntos como muestras más patrones tengas.
5. Prepara un patrón de cada ácido, tartárico, málico y láctico (un gramo por litro).
6. Aplica las muestras y los patrones usando un capilar diferente para cada uno de ellos. Seca
después de la aplicación y repite la aplicación sobre el mismo punto, 5 ó 6 veces, secando
cada vez. De esta manera se concentra la mancha.
7. Introduce la tira de papel con las manchas, de manera que éste se sumerja en el eluyente,
pero sin que se mojen las manchas. Procura que quede vertical, usando pinzas o apoyando
sobre la pared.
8. Tapas la cubeta y esperas a que el eluyente ascienda hasta 3/4 de la altura total. (4-5
horas).
9. Saca el papel con cuidado, marca el frente del eluyente y déjalo secar al aire, mejor
colgado.
10. Una vez seco, observarás diversas manchas, que interpretarás como sigue:

Interpretación:
- Tomando como base el punto en el que aplicaste el vino, en la vertical te aparece una
primera mancha que corresponde al ácido tartárico. Esa mancha se debe de corresponder en
altura con el patrón del mismo ácido.
- Un poco más arriba, te aparece una mancha amarilla correspondiente al ácido málico, si
está presente. Esta mancha se corresponderá con la del patrón correspondiente.

Por encima, puede aparecer otra mancha debida a los ácidos láctico + succínico, que se
corresponderá con su patrón.
en 9:25

1 comentario:

1.

Sergio Batista2 de marzo de 2016, 3:00

Muy muy interesante. Gracias :)

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