CROMATOGRAFÍA PLANAR

CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

 CROMATOGRAFÍA PLANAR
ANÁLISIS POR DESARROLLO

Aplicación en papel o Corrida del papel o la Revelado

placa de la muestra placa
CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

CP CCD

• Mayor capacidad de carga.

• Más rápido.
• Evita las difusiones laterales de las manchas.
• Alta sensibilidad.
• Mayor diversidad de reveladores.
• Sencillez.
• Emplea medios no costosos.
• Análisis de múltiples muestras simultáneamente.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

NATURALEZA DEL PROCESO CROMATOGRÁFICO

• CCD de adsorción
• CCD fase invertida
• CCD de partición
• CCD de intercambio iónico
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

Adsorbentes utilizados en CCD

Gel de sílice
• Gel de sílice G: tiene yeso como aglutinante entre un 5-15 %.
• Gel de sílice GF: Contiene un aditivo fluorescente, (254 ó 366).
• Gel de sílice H: Carece de aglutinante.
• Gel de sílice S: Contiene almidón como aglutinante, también (SF).
Oxido de aluminio (alúmina)
Puede comercializarse con tres valores de pH diferentes:
Alúmina neutra o H (pH ≈ 7,5)
Alúmina básica o HF (pH ≈ 9,5)
Alúmina ácida o G (pH ≈ 4,5)
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

Adsorbentes utilizados en CCD

Polvo de celulosa
Se utiliza en cromatografía de reparto y sirve de soporte adecuado a la fase
estacionaria acuosa. Este material no requiere aglutinantes.
Kieselguhr
Se obtiene a partir de organismos unicelulares fósiles (diatomeas). Se ha
utilizado con éxito como soporte de la fase estacionaria no polar. Puede
presentarse con y sin aglutinantes.
Resinas y materiales intercambiadores
Se han usado resinas intercambiadoras aniónicas y catiónicas, conteniendo
yeso como aglutinante.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

Materiales empleados como soporte

Vidrio: inerte químicamente, facilidad de lavado y posibilidad de

obtener placas planas.

Láminas de aluminio: industrialmente se obtienen aluminios

tratados de muy buena calidad superficial.

Acero inoxidable, si bien son buenas, han encontrado poca

aplicación debido a la difusión del uso del aluminio.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

FASE MÓVIL (FM)

• La elección dependerá de la naturaleza de la mezcla a separar y del material

utilizado como adsorbente.
• Cuando se utilizan mezclas de disolventes se debe analizar la estabilidad de
la FM.
• En la selección debe considerarse la facilidad de manipulación, precio, baja
toxicidad, baja inflamabilidad, riesgo de explosión y riesgos de
contaminación ambiental.
• Se prefieren las FM constituidas por un solo disolvente.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)
FASE MÓVIL (FM) Orden Disolvente
1 Eter de petróleo
SERIE ELUOTRÓPICA 2 n-hexano
3 Heptano
4 Ciclohexano
Aumenta el poder de elución

5 Tolueno
6 Cloroformo
7 Diclorometano
9 Eter etílico
10 Acetato de etilo y ésteres homólogos
11 Acetona
12 Butanol
13 n-propanol
14 Etanol
15 Metanol
16 Acido acético
17 Acetonitrilo
18 Acido fórmico
19 Agua
 Extracto metanólico de Chaya

Hexano:acetato de etilo (7:3)

Butanol:ácido acético:agua
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS

Dispositivos

• Micropipetas: Hay micropipetas comerciales desde 10 hasta

1000 µl.
• Microjeringuillas: Su capacidad generalmente no sobrepasa
los 50 μL.
• Microcapilares: Entregan volúmenes exactos y conocidos.
Se fabrican de 1, 2, 3, 5 y 10 μL y son muy prácticos y
económicos. Los de 5 y 10 μL son reusables.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS

Dispositivos

Micropipetas Microjeringuillas Microcapilares

 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS

• Disolver la muestra y los patrones en un disolvente,

preferiblemente, muy volátiles.
• Finalidad que se persigue (analítico o preparativo).
• Concentración del componente de interés en la muestra.
• El diámetro de la gota no debe ser mayor de 5mm.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS

 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

DESARROLLO CROMATOGRÁFICO

• Desarrollo ascendente
• Desarrollo descendente
• Desarrollo horizontal
• Desarrollo ascendente por etapas
• Desarrollo ascendente múltiple
• Desarrollo continuo
• Desarrollo bidimensional
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

DESARROLLO CROMATOGRÁFICO

Desarrollo ascendente

• FM con una profundidad máxima de 1 cm.

• La posición de la placa puede ser vertical o inclinada.

• La no saturación de la cubeta o cámara pudiera provocar

demora en la corrida y aumento de los Rf.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

REVELADO O DETECCIÓN

• Físicos: luz ultravioleta (UV) y el agua

• Reveladores químicos:
Vainillina en medio ácido (H2SO4)
H2SO4 en alcohol.
Sulfato cérico [Ce(SO4)2]/(H2SO4)
• Reveladores químico-físicos:
Sulfato cérico [Ce(SO4)2]/(H2SO4) y calor
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

REVELADO O DETECCIÓN

Cromatograma de las muestras Cromatograma de las muestras

de propóleos pardos cubanos de propóleos rojos cubanos

Luz UV (254 nm) Vainillina/H2SO4/calor UV 254 nm Vainillina/H2SO4

 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

REVELADO O DETECCIÓN

• Bioensayo en CCD
A B

Cromatograma correspondiente a los tres tipos de propóleos

A: revelado con vainillina/H2SO4 y B: tratamiento con DPPH.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

REVELADO O DETECCIÓN

• Reveladores biológicos
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

ANALISIS CUALITATIVO

El Rf absoluto

dM
R fm =
dS

El Rf relativo

R fm dM
R fr= =
R fp dP

Donde:
dM: distancia desde el origen hasta la muestra
dP: distancia desde el origen hasta el patrón
dS: distancia desde el origen hasta el frente del disolvente
 Cromatogramas del estudio de saturación de la
cámara cromatográfica

A (15 min) B (30 min) C (45 min)

N I III 1 2 3 4 5 6 II II N I III II 1 2 3 4 5 6 II N I III II 1 2 3 4 5 6 II

N-nemorosona; I-propóleos pardo; II-propóleos rojo; III-propóleos amarillo.

1- liquiritigenina; 2-medicarpina; 3-vestitol; 4.isosativan; 5-isoliquiritigenina; 6-formononetina.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

ANALISIS CUANTITATIVO

• Por comparación visual

• Método de elución

• Densitometría

• Medición de fluorescencia

• Cuantificación mediante reflectancia

 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)
ANALISIS CUANTITATIVO

Densitometría
• Se hace pasar un haz de luz de intensidad conocida a través de la
placa, midiendo la absorción de esta después de que el haz la
atravesó.
• La absorción luminosa de la mancha se registra en el equipo en
forma de pico, cuya área es proporcional a la cantidad del
compuesto presente en ella.
• Este método pudiera estar afectado por la falta de homogeneidad
y de espesor en la placa, aplicación homogénea del agente
cromogénico, etc.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

ANALISIS CUANTITATIVO

Medición de Fluorescencia

• Solo se utiliza en compuestos que fluorescen cuando se exponen

a la luz de la λ determinada.
• La luz emitida es proporcional a la cantidad de compuesto
presente en la mancha.
• Para medir la radiación fluorescente, se necesitan equipos
especiales.
• Es un método sensible (orden de nanogramos) pero se precisa
conocer la λ óptima de la radiación de excitación.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

ANALISIS CUANTITATIVO
Cuantificación mediante reflectancia

• Es una variante del método densitométrico, solo que en

lugar de medir la luz absorbida por la mancha, lo que se
mide es la reflejada.
• De manera similar se barre la zona donde se presenta la
mancha, obteniéndose un área cuyo cuadrado es
proporcional a la cantidad del compuesto en la zona
barrida.
• Es un método también costoso por el equipamiento
requerido.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

DATOS QUE DEBEN INFORMARSE EN CCD

Cámara: tipo y dimensiones internas, situación de la cámara, local

(ubicación dentro del laboratorio), sello de la tapa, papel para saturación
de la cámara, tiempo de saturación, temperatura y humedad relativa del
laboratorio.
Tipo de adsorbente: fabricante, tipo de placa, dimensiones, material de la
placa soporte, espesor de la placa, presencia de algún aditivo o
modificación del adsorbente, aglutinante especial, etc. Modo de
activación.
Aplicación de la muestra: medio utilizado en la aplicación y modo (puntual
o banda), disolvente usado para disolver la muestra, modo de secado de la
muestra (espontaneo o forzado), cantidad y volumen del patrón.
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CCD)

DATOS QUE DEBEN INFORMARSE EN CCD

Corrida o desarrollo: composición de la FM y en caso de que tenga dos fases

en equilibrio con cuál se trabaja, método de corrida (ascendente, descendente
u otro), distancia de corrida, método de secado de la placa después de la
corrida (natural o forzado), número de veces que se utiliza la cámara antes de
correr la FM.
Revelado e identificación: tipo de revelado (físico, químico o mixto), en caso
de revelado químico especificar la forma de llevarlo a cabo (aspersión u otra),
especificar la composición y forma de preparación si está compuesto por más
de un componente, informar el color, forma y estabilidad de la mancha,
informar el Rf o Rfr
Cuantificación: señalar método seguido, aportar datos de exactitud
(recuperación) y de variabilidad del método (CV) si se dispone de estos.
 HPTLC

HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography)

• Se basa en los mismos principios que la CCD.

• Utiliza dispositivos automatizados para la aplicación de las
muestras.
• Las placas están cubiertas con finas partículas, un tamaño de
poro mucho más pequeño, así como menor grosor.
• Se realizan corridas de 3 a 5 cm.
• El tiempo de corrida se reduce hasta un 40% del tiempo
empleado con las placas convencionales.
 HPTLC
Aplicadores
• Cubren un rango de volúmenes de aplicación entre los 10 nL
y los 50 L, en placas de hasta 20x20 cm.
• La aplicación en forma de puntos o en forma de bandas
 HPTLC

Aplicadores
 HPTLC
Desarrollo o corrida
30 muestras en una placa de
10x10 cm

Twin Through Chamber Cámaras horizontales

 HPTLC

Secado de las muestras

 HPTLC

Revelado

Sistema de fotodocumentación
 HPTLC

Densitómetro
 HPTLC

Diferencias fundamentales entre la CCD y HPTLC

Parámetro CCD o TLC HPTLC

Tamaño medio de partícula 10 - 15 µm 5 - 7 µm

Distancia de migración 10 - 15 cm 3 - 5 cm
Tiempo de migración 30 - 200 min 3 - 20 min
Espesor de la capa 250 µm 50, 100, 200 µm
Diámetro del punto de aplicación 3 - 6 mm 1 - 1,5 mm
Diámetro de la mancha después del 6 - 15 mm 2 - 5 mm
desarrollo
Eficiencia Menor Alta debido a los
pequeños tamaños de
partículas