Metodología actividad antioxidante

PREPARACION DE EXTRACTO:

Equipos Reactivos Ingredientes

Preparación de extracto
Congelador Agua destilada Para pasta cocida:
Liofilizador Etanol 15 g de pasta
Molino HCl 300 ml de agua
Agitador orbital hirviendo
Centrifugadora 5 g sal
Balanza analítica
Fenoles totales
Reactivo folin-
ciocalteu
Carbonato de sodio
Ácido ferúlico
DPPH
Radical DPPH
Metanol
trolox
Procedimiento preparación de extracto (por triplicado):

 Mezclar 1 g de muestra (pasta molida) con 10 ml de solución etanol: agua (80:20 v/v) acidificada con 1% HCl.
 Poner la mezcla en un agitador orbital, en la oscuridad a temperatura ambiente por 1.5 horas.
 Centrifugar la mezcla a 7826 x g a 4ºC por 15 minutos.
 Recuperar el sobrenadante y almacenar en ámbar a 4 ºC en la oscuridad hasta el momento de su análisis.

DETERMINACION DE FENOLES TOTALES:

 200 μl de extracto mezclar con 1,5 ml de reactivo de folin-ciocalteu (diluido 10 veces en agua destilada).
 Permitir que la muestra alcance el equilibrio por 5 minutos a temperatura ambiente.
 Adicionar 1,5 ml de solución de carbonato de sodio (60 g / l).
 Permitir que la muestra alcance el equilibrio por 2 horas a temperatura ambiente.
 Medir la absorbancia de la solución a 725 nm contra un blanco del solvente usado para la extracción
(etanol:agua (80:20 v/v) acidificada con 1% HCl), usar como estándar ácido ferúlico, expresar los resultados
como μg de equivalentes de ácido ferúlico/g de muestra. Realizar por triplicado.

DPPH:

 Preparar la solución de radical DPPH disolviendo 0,0015 g del radical en 20,5 ml de metanol y aforando con
agua destilada a 25 ml.
 Medir en espectrofotómetro llevar a cabo la reacción en microplacas transparentes de 96 pozos para lo cual se
adicionan 20 μl del extracto y 200 μl de solución de DPPH.
 Preparar la curva de calibración de trolox en rangos de concentración de 50 – 800 μM.
 Monitorear la disminución de absorbancia durante 90 minutos a 520 nm
 Analizar las muestras por triplicado, expresar los resultados en μmol equivalente de trolox por gramo de
muestra.