Purificación de los Ácidos Nucléicos

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En este proceso los Ác.Nucl. están inmersos en un
extracto celular complejo junto proteínas , sales ,
componentes célulares solubles y reactivos.

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El proceso de purificación consiste en separar los
ácidos nucleicos de todos los componentes del
lisado.

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 Purificación con Solventes Orgánicos
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Se basa en la distinta solubilidad de los compuestos que integran el
lisado celular en solventes orgánicos.
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Se lleva acabo en 4 fases:
1. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos.
2. Precipitación del ADN
3. Lavado del ADN
4. Resuspención del ADN
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Es el protocolo más habitual de purificación de ADN genómico.
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Se utiliza una combinación de cloroformo , fenol y alcohol.

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 1. Eliminación de Compuestos solubles en
solventes orgánicos
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Mezclamos vol. iguales del lisado y del reactivo. (cloroformo/fenol/alcohol)
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Se agita con un vortex.
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Se produce una fase acuosa.
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El cloroformo disuelve los lípidos y porporciona una fase orgánica a la
muestra.
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El fenol desnaturaliza y disuelve las proteínas, y se integra a la fase
órganica.
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Se centriguga , la mezcla se separa en 2 fases la acuosa arriba con el ADN ,
las sales y componentes hidrosolubles.
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Y la orgánica abajo con proteínas y lípidos.

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 2. Precipitación del ADN
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La fase acuosa es transferida a un tubo límpio.
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Añadimos Acetato Sódico e Isopropanol o Etanol al
100% frio para que el ADN precipite. (*)
●
Centrifugamos
●
El ADN precipitado sedimenta en el fondo del tubo
●
En el sobrenadante quedan todos los contaminantes
hidrosolubles que había en el lisado.

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 (*)
●
El ADN es una molécula polianiónica , tiene carga negativa por los grupos
fosfato que se situan en el exterior de la doble hélice.
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En un medio acuoso esto hace que las moleculas de ADN se repelan y se
rodeen de una capa hidratante de moleculas de agua que las estabilizan ,
por esta manera el ADN es soluble en agua.
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Al añadir un alcohol , (agente deshidratante) se elimina la capa hidratante
que rodea al las móleculas de ADN.
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La presencia de cationes de sódio que aporta el Acetato sódico neutraliza
la carga negativa del ADN ( que le proporcionan sus grupos fosfato)
●
Por esta razón ya no se repelen entre sí y se unen unas a otras formando la
maraña visible de hebras blanquecinas que vemos.

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 3. Lavado del ADN
●
Eliminamos el sobrenadante , el pellet de ADN se lava
con Etanol al 70-95% y se vuelve a centrifugar.
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El ADN es insoluble en etanol permaneciendo en
sedimento ,pero los restos de sales y otros
contaminantes que hayan semiprecipitado con el ADN
son solubles por lo que se eliminan con el
sobrenadante.

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 4. Resuspension del ADN
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El Etanol , interfiere en casi toda técnica de B.M , por lo que
debemos eliminarlo.
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Podemos hacerlo invirtiendo el tubo sobre un material
absorbente y dejar secar el pellet de ADN a Tº ambiente con el
tubo abierto.
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Una vez seco se resuspende en cantidad adecuada el ADN en
agua destilada o en un tampón de baja fuerza iónica y pH
neutro o ligeramente alcalino como Tampón Tris- Edta.
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La rehidratación es un proceso lento.

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 Purificación con Precipitación con Sales
(Salting-Out)
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Se basa en la precipitación de proteínas en presencia de altas
concentraciones salinas , estas generan medios con elevada fuerza iónica.
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Las elevadas concentraciones salinas generan medios con elevada fuerza
iónica que determina un aumento de interaciones hidrofóbicas entre
proteínas disminuyendo su solubilidad en el medio acuoso y provocando
su precipitación.
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Este metodo consta de 3 fases
1. Precipitación de Proteínas
2. Precipitación del ADN
3. Lavado y Resuspensión del ADN

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 1. Precipitación de Proteínas
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Se añade mismo volumen de lisado y concentración
salina concentrada que actua como precipitante de
proteínas y se agita con un vortex .
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Se centifuga la mezcla , las proteínas sedimentan en
el fondo como pellet de color pardo y el sobrenadante
quedan los Ac.Núc,sales y componentes hidrosolubles
del lisado.

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 2. Precipitación del ADN
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El sobrenadante lo transferimos a un tubo límpio.
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Se añade vol. igual de isopropanol.
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Se mezclan por inmersión suave del tubo varias
veces.
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El ADN precipita en forma de maraña de hebras
blanquecinas que sedimentan mediante centrifugación.

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 3. Lavado y Resuspension
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Se elimina el sobrenadante
●
El ADN lo lavamos con etanol al 70-95%
●
Se resuspende con agua destilada o tampón TE.

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 Purificación mediante Cromatografía de
Intercambio Iónico
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Se basa en la unión electroestática reversible de iónes en la solución a grupos
funcionales cargados, que están unidos covalentemente a una fase estacionaria.
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Los grupos funcionales que tienen carga positiva se llaman intercambiadores
aniónicos, y se van a unir reversiblemente los iónes negativos (aniónes) que hay en
la solución.
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Cuando tienen carga negativa se llaman intercambiadores catiónicos , y se van a
unir los iónes positivos (catiónes) de la solución.
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Para la purificacion de ADN la Fase estacionaria se usan matrices de sílice o
celulosa empaquetadas en columnas de polipropileno.
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A la matriz se le une covalentemente un intercambiador aniónico , ya que los ácidos
nucléicos son poliániones lineales con carga negativa (debido a los grupos fosfato).
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Los grupos funcionales más utilizados con el MAE y el DEAE. (anionicos)

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 Procecimiento de la Cromatografía de
intercambio iónico
1. Paso
●
La columna se carga con una dilución del lisado en un
tampón de baja salinidad y Ph neutro , estas
condiciones hacen que los A.N tengan carga negativa y
se unan a los grupos funcionales del intercambiador
que tienen carga positiva.
●
La proteinas , polisacaridos y otros contaminantes del
lisado con carga positiva no se unen al intercambiador
y por lo cual eluyen de la columna (se van , caen).

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 Procecimiento de la Cromatografía de
intercambio iónico
Paso 2.
La columna se lava con tampónes de salinidad creciente ,por lo que se
van eliminando contaminantes con debil carga negativa.
Proteínas > ARNt > ARNr55 > ARN16S y 23S > ARNm > ADN 150 pb >
ADN plasmido > ADN genomico.
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Este método es útil para purificar de manera individual distintos tipo
de Ácidos. Núcle.
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En virtud de la carga neta de cada tipo de mólecula , jugando con la
concentracióin salina de los tampones de lavado se puede conseguir
que eluyan el ARNm y los ARN ribosomicos de alto peso mólecular ,
mientras el ADN sigue en la columna.

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 Procecimiento de la Cromatografía de
intercambio iónico
Paso 3
●
El ADN se eluye de la columna con un tampón de
máxima salinidad y alto Ph.
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Para finalizar , los ácidos núcleicos se precipitan con
isopropanol o etanol para eliminar las sales del
tampón.
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Se lavan con etanol y se resuspenden en agua
destilada o en un tampónTE.

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 Purificación mediante Cromatografía de
Adsorción
●
Se basa en la capacidad de adsorcion de las
Ac.Nucleicos al vidrio y al sílice en presencia de
sales caotrópicas. (*)

16
 (*)
●
El vidrio esta formado por silicatos con una estructura mólecular tetaédrica
capaz de formar puentes de hidrógeno con las moléculas de agua.
●
En contacto con el agua , la superficie del vidrio se recubre de una capa
hidratante .
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La solución acuosa , los Ác. Nucléicos que también estan cubiertos por una
capa hidratante como hemos dicho de moléculas de agua unidas a los grupos
fosfato mediante puentes de hidrógeno , impiden la interación entre ambas
capas.
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Por esto al medio acuoso se le añade una sal caotrópica que atrae las
moléculas de agua y retira la capa hidratante de ambas estructuras ,
creando un entorno hidrofóbico que permite la interación entre el sílice y el
ácido nucléico.

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 Material de la Cromatografía de Adsorción
●
Para este procedimiento utilizamos lanas de vidrio o
perlas de sílice empaquetadas en columnas de
polipropileno que ajustan en los tubos colectores
eppendorf.

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Procedimiento de Cromatogradia de Adsorción
Paso 1
●
La columna se carga con el lisado diluido en un
tampón que contenga un agente caotrópico y se
centrigufa.
●
Los Ác.Núcl quedan unidos a la membrana de la
columna (adsorción) y el medio líquido con las
proteínas y componentes celulares contaminantes se
recogen en el tubo colector y se eliminan.

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Procedimiento de Cromatogradia de Adsorción
Paso 2
●
Los Ác.Núcl. unidos a la membrana , se lavan con
Etanol al 70% para eliminar restos contaminantes.
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Esto se hace cargando la columna con el Etanol y
centrifugando. Y eliminando el contenido del tubo colector.
●
Para evitar que queden restos de alcohol la columna
vacía se vuelve a centrifugar y el tubo colector de
desecha , con los posibles restos de Etanol.

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Procedimiento de Cromatogradia de Adsorción
Paso 3
●
La columna se ajusta a un eppendorf límpio y se añade sobre la membrana una
cantidad adecuada de agua destilada o tampón de TE.
●
De esta manera tanto la superficie de la membrana como las móleculas de los
ÁC.Núcleicos recuperan la capa hidratante de móleculas de agua y se
separan , (desorción)
●
Se deja incubar durante unos pocos minutos 3-5 para favorecer la resuspensión
del Ác.Núcl
●
Y se centriguga.
●
Se desecha la columna.
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En el tubo eppendorf se recolecta el Ác.Núcl purificado.

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 Purificacion mediante Esferas magneticas
●
Se basa en la unión de los ácidos núcleicos a
microesferas magnéticas que son retenidas
mediante un imán.
●
Normanlemte las microesferas están constituidas por
nanoparticulas de magnetita encapsuladas en una
matriz inerte.
●
La unión de los Ác.Núcl a estas paticulas magnéticas
puede hacerse por adsorción o afinidad.

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 Adsorción de los Ácidos Núcleicos a esferas
magnéticas
●
Las microesferas se recubren de sílice o grupos
funcionales con alta afinidad por los Ác.Núcleicos.

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Procedimiento de Purificacion mediante esferas
magneticas por Adsorcion de Ácidos Núcleicos
Paso 1
●
Las esferas se añaden al lisado junto un agente
caotrópico.
●
De esta manera los Ác.Nucl se unen a la superficie de
las esferas (Adsorción)

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Procedimiento de Purificacion mediante esferas
magneticas por Adsorcion de Acidos Nucleicos
Paso 2
●
El tubo que contiene la mezcla se coloca en un soporte
con un imán , llamado separador magnético.
●
De esta manera las esferas unidas a los AC. Núcleicos,
se atraen hacia el imán y se agrupan en la zona de la
pared del tubo.

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Procedimiento de Purificacion mediante esferas
magneticas por Adsorcion de Acidos Nucleicos
Paso 3
●
El resto del lisado con las proteínas y demas
componentes celulares contaminantes se elimina por
pipeteo o decantación.

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Procedimiento de Purificacion mediante esferas
magneticas por Adsorcion de Acidos Nucleicos
Paso 4
●
Para lavar los Ác.Núcleicos se retira el tubo del
separador magnétic y se añade etanol al 70%
●
Se agita
●
Se vuelve a colocar el tubo en el separador magnético.
●
Y la solución del lavado con los restos contaminantes se
elimina por pipeteo o decantación.

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Procedimiento de Purificacion mediante esferas
magneticas por Adsorcion de Acidos Nucleicos
Paso 5
●
Para resuspender los Ac.Núcl se retira el tubo del
separador magnético.
●
Se añade agua destilada o tampon TE.
●
Se incuba el tiempo para que los Ac.Nú se separen de
las esferas (desorción) y se resuspendan al medio.
●
Se puede favorecer la desorción agitando o elevando
la temperatura.

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Procedimiento de Purificacion mediante esferas
magneticas por Adsorcion de Acidos Nucleicos
Paso 6
●
Se coloca el tubo en el separador magnético.
●
Las esferas sin los ácidos nucléicos se reagrupan en la
pared del tubo.
●
Los Ác.Núcl en la solución se pipetean y se transfieren a
un tubo límpio.

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 Purificación por Ultrafiltración
●
Se basa en la retención mediante el tamaño de las
moléculas de los Ác.Núc mediante membranas con un
tamaño de poro determinado.
●
Estas membranas se situan en la base de las
columnas en tubos colectores.
●
Este método se suele utilizar para purificar
productos de PCR con un tamaño superior a 150 pb

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 Procecimiento de Purificación por
Ultrafiltración
Paso 1
●
La muestra (mezcla de reación de PCR) se carga
directamente en la columna y se centrifuga.
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Sobre el filtro quedan retenidos los productos
amplificados de la PCR y al tubo pasan los
contaminantes (primers , nucleotidos , sales).

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 Procecimiento de Purificación por
Ultrafiltración
Paso 2
●
El filtro se lava con Etanol para eliminar los restos de
contaminanes.

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 Procecimiento de Purificación por
Ultrafiltración
Paso 3
●
Para resuspenden los productos de PCR se añade a la
columna agua destilada o un tampón TE.
●
Se incuba unos minutos a Tº ambiente.
●
Se transfiere a un tubo limbio mediante pipeteo.

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