Avaliação Ação Faramcologica Fitoterapico Varias

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação da composição química, atividade antioxidante, antibacteriana,

antinoceptiva, antiinflamatória e toxicidade do extrato metanólico e
frações de folhas de Spondias sp. (Anacardiaceae)
GABRIEL ARAUJO DA SILVA
ORIENTADORA: PROFª. DRª. MARIA DAS GRAÇAS ALMEIDA

CO-ORIENTADOR: PROFº DRº JORGE ALBERTO LÓPEZ RODRÍGUEZ
NATAL – RN
2012
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LABORATÓRIO MULTIDISCIPLINAR DE PESQUISA

Dissertação submetida ao programa de Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas como
requisito para a obtenção do grau de Mestre
em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADORA: PROFª. DRª. MARIA DAS GRAÇAS ALMEIDA

CO-ORIENTADOR: PROFº DRº JORGE ALBERTO RODRÍGUEZ LÓPEZ
NATAL – RN
2012
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COMISSÃO JULGADORA
DISSERTAÇÃO
___________________________________________________
Profª. Drª. Maria das Graças Almeida
Presidente-UFRN
___________________________________________________
Profª Drª Maria Aparecida Medeiros Maciel
Examinador Interno-UFRN
____________________________________________________
Profº Drº Ullysses Paulino Alburquerque
Examinador Externo-UFRPE
NATAL – RN
2012
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que ajudaram para o êxito da realização deste trabalho, e

especialmente:
À Deus, por possibilitar a existência e sempre nos dar a força para superar
desafios.
À Mainha, Elenilda S. A. da Silva [Bebel], e a Painho, Wanderley P. da Silva,

pelo apoio e dedicação, e pelo espírito de sempre que se dedicar a algo, ter a
perfeição como meta, mesmo se às vezes, utópica.
Ao meu irmão, Filipe A. da Silva, pelos muitos momentos de conversa

descontraída acerca das mil e uma invenções na realização deste trabalho, o
qual não entendendo de química, farmácia ou produtos naturais, se manteve
atento e com a curiosidade herdada de nosso pai me arguia sobre os
resultados.
À Profª. Drª. Maria das Graças Almeida, pela orientação e confiança

incondicional em aceitar-me como aluno, mesmo com a convivência de apenas
quatro dias. E, pelo exemplo de postura, profissional e pessoal, sempre com
seriedade e hombridade nos seus atos e feitos.
Ao Prof. Dr. Jorge A. López pela orientação, incentivo e visão ampla, além da
amizade e ajuda durante todo o árduo trabalho para a elaboração desta
dissertação. Sempre com a idéia de que “nenhum mestre sabe o suficiente,
que nunca poderá ser aluno novamente.”
À coordenação do curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,

professores, Prof. Dr. Arnóbio Antonio da Silva Júnior e Profa. Dra.
Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas.
Ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas na pessoa da Prof. Dr.

Telma Maria Moura de Araújo Lemos pelo apoio e ajuda na medida de suas
possibilidades.
Aos colegas do Laboratório Multidisciplinar dos Programas de Pós Graduação

em Ciências Farmacêuticas e Ciências da Saúde, UFRN, pelo apoio na
realização dos experimentos, com a ajuda direta de Naira Josele N. de Brito,
Maria Aparecida do Nascimento, José Benilson Martins M. Macedo,
Elizabeth Cristina Gomes dos Santos, Leandro Vinicius e Rita Nycássia.
A turma do Fogo Violeta, desde baianos, gaúchos, potiguares, cearenses à

piauienses, pelos encontros descontraídos, sempre regados de boas conversas
e boa comida.
-5-
As minhas amigas Suzane Guimarães Cairo e Monaliza L. Maia, por muitas

idas e vindas por essa cidade, e por me apresentarem o que há de melhor em
Natal, meu muito obrigado, vocês me fizeram discutir sobre literatura, música,
cinema, bobagens, evitando a “inevitável” mania de só falar sobre farmácia.
Aos meus amigos e funcionários do Biotério Central do CCS, Ana Auxiliadora

Fernandes de Vieira e Washington Fernandes da Rocha, pela amizade
desenvolvida e, pelo exemplar cuidado com os animais, os meus sinceros
agradecimentos.
Às Profª Drª. Alessandra Silva Guedes e Profa. Drª. Sibele Oliveira Tozetto,
pela oportunidade de realizar minha primeira iniciação cientifica, mostrando-me
que experimentar e descobrir são possíveis.
A todos do Laboratório de Fitoquímica da UFPR, em especial ao Prof. Obdúlio

Gomes Miguel, Milena Kallegari, Ranieri Oliveira Campos e Vanessa
Canteli, que possibilitaram o uso do RMN e os processos de fitoquímica
realizados neste trabalho.
Ao Prof. Adair Roberto Santos, e todos do Laboratório de Neurobiologia da

dor e inflamação, do Centro de Ciências Biológicas, UFSC, que permitiram as
avaliações antinociceptiva e antiinflamatória, e aos encontros descontraídos no
Iega. Meu muito obrigado à Fernanda, Deiselene, Morgana, Gaucho, Leide,
Franscinete, Eimael, Franscinelson, Daniel, Wladimir, Marinete, Serginho.
A CAPES pelo apoio financeiro, disponibilizando bolsa de mestrado desde o

início deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (MCT/CNPq), que por meio do fomento

possibilitou a realização dos experimentos da parte experimental deste
trabalho. Nossos sinceros agradecimentos por confiarem no nosso êxito.
A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para este trabalho, meus
sinceros agradecimentos.
“Pipas sobem mais alto contra o vento, não com ele.”
Winston Churchill
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RESUMO
Spondias sp. (Anacardiaceae), popularmente conhecida como cajá-umbu, é
uma planta endêmica do Nordeste do Brasil, onde as suas folhas são
largamente usadas na medicina popular no tratamento de processos
inflamatórios, enquanto os seus frutos possuem grande potencial agro-
industrial. O objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades hepatoprotetora,
antioxidante, antibacteriana, antinociceptiva, antiinflamatória, além da
toxicidade aguda e 28 doses repetidas, usando um extrato metanólico (EMS),
uma fração rica em flavonóides (FRF) e um precipitado obtidos de folhas de de
Spondias sp. A atividade antioxidante dos mesmos foi avaliada para determinar
a capacidade de sequestro do radical livre DPPH, enquanto que MES e e FRF
foram utilizados para avaliar a capacidade hepatoprotetora em lesões induzidas
por tetracloreto de carbono (CCl4). Sete grupos (n=5) de ratas Wistar foram
usados como se segue: grupo de controle, grupo intoxicado com CCl4- tratado
com EMS (500 mg/kg) durante 7 dias, três grupo intoxicado com CCl4 tratados
com o FRF (25, 50 e 75 mg/kg) durante 7 dias e o grupo intoxicado com CCl4
tratado com Legalon® (silimarina, fitoterápico de referência). EMS e FRF
apresentaram ação protetora contra o dano hepático induzido por CCl4, ao ser
observada a redução significativa da atividade enzimática de marcadores
séricos (alanina transaminase e aspartato transaminase). Além disto, a redução
da peroxidação lipídica, o aumento do conteúdo de glutationa e da atividade
enzimática do sistema de defesa de antioxidante (SOD, CAT, GPx),
comparáveis aos valores normais, indicaram a capacidade de MES e FRF de
restaurar o desequilíbrio oxidativo induzido por CCl4. A análise histological
confirmou a hepatoproteção, em comparação às modificações degenerativas
no grupo tratado com CCl4. Este efeito hepatoprotetor foi análogo ao mostrado
pelo Legalon®. A alta capacidade de antioxidante in vitro do extrato (93.16
±1.00 %) foi similar à obtida com Carduus marianus e BHT (padrões de
referência), fato este que explica os resultados obtidos in vivo. Nenhuma
atividade antibacteriana foi detectada, porém, EMS e FRF promoveram o efeito
antinociceptivo induzido na segunda fase da injeção intraplantar de formalina,
evidenciando a ação antiinflamatória; confirmado pelo modelo de peritonite
induzida por carragenina. A avaliação da alodinia mecânica (CFA a 80%)
demonstrou o envolvimento da composição química de Spondias sp. na
atividade anti-inflamatória em relação aos processos agudos. A exposição
aguda e dose repetida durante 28 dias não produziram mudanças significativas
nos parâmetros que avaliaram a toxicidade. Os resultados experimentais,
revelaram que extratos de folhas de Spondias sp. possuem um potencial
promissor na área farmacêutica e face à sua atoxicidade apresentam eficiência
e segurança.
Palavras-chave: Spondias sp., fitoquímica, atividade farmacológica, toxicidade,
ratos e camundongos.
-7-
ABSTRACT
Spondias sp. (Anacardiaceae), popularly known as cajá-umbu, is an endemic

plant from Northeastern Brazil, where their leaves are widely used in folk
medicine to treat inflammatory processes, while their fruits have a great agro
industrial potential. This study was designed to evaluate hepatoprotective,
antinociceptive, antioxidant, antimicrobial and anti-inflammatory properties, as
well as the acute toxicity and repeated dose 28, using a methanolic extract
(MES), a fraction rich in flavonoids (FRF) and a precipitate from Spondias
sp.leaves. The antioxidant activity of them was valued to evaluate their free
radical scavenger capacity by DPPH test, whereas MES and FRF were used to
evaluate while the preventive action on carbon tetrachloride (CCl4)-induced
hepatotoxicity. Seven groups (n=5) of female Wistar rats were used as follows:
control group, CCl4-intoxicated group treated with EMS (500 mg/kg) for 7 days,
three CCl4-intoxicated groups treated with FRF (25, 50 and 75 mg/kg) for 7
days and the CCl4-intoxicated group treated with Legalon ® (silimarina;
(phytotherapeutic reference) (50 mg/kg; 7 days). MES and FRF showed a
protective action against liver injury induced by CCl4, being observed a
significant reduction of serum enzyme activity marker of liver damage (alanine
transaminase and aspartate transaminase). On the other hand, the lipid
peroxidation (SRAT) decrease, as well as the increase of glutathione content
and enzyme activity of antioxidant defense system (SOD, CAT, GPx) toward
near normal values indicated the ability of EMS to restore the oxidative
imbalance induced by CCl4. The histological analysis confirmed the
hepatoprotection, compared to degenerative changes in CCl4-treated group.
This hepatoprotetor effect was similar to that shown by Legalon®. The in vitro
high antioxidant capacity of extract (93.16 ± 1.00%) showed analogous results
to those obtained by Carduus marianus BHT (reference standard). This fact
explains the obtained results in vivo. Although no antimicrobial activity was
detected, EMS and FRF promoted the antinociceptive effect induced in the
second phase by the intraplantar formalin test, evidencing the anti-inflammatory
action; confirmed by the carrageenan-induced peritonitis model. The evaluation
of the mechanical allodynia (CFA a 80%) demonstrated the involvement of the
Spondias sp. chemical composition in the anti-inflammatory activity toward the
acute processes. The acute exposure and repeated dose during 28 days did not
produce significant changes in the parameters that evaluate toxicity. Together
the experimental results reveal, that Spondias sp. leaf extracts have a
promising potential in pharmaceutical area, and due to its non-toxic condition
present efficiency and security.
Keywords: Spondias sp., pharmacology activities, toxicity, rats and mice.

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LISTA DE ABREVIATURAS
1O2 Oxigênio singlet
ALP Fosfatase Alcalina
ALT Alanina transaminase
AST Aspartato transaminase
BHT Butil Hidroxitolueno
BT Bilirrubina Total
CAT Catalase
CCl3- Tricloreto de Carbono
CCl4 Tetracloreto de carbono
CFA Adjuvante completo de Freud
DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil
DTNB 5,5‟ditiobis, 2-nitrobenzóico
ERN Espécies Reativas do Nitrogênio
ERO Espécies Reativas do Oxigênio
FRF Fração Rica em Flavonóide (Flavonoid rich-fraction)
H2O2 Peróxido de hidrogênio
GPx Glutationa peroxidase
GR Glutationa Redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
LH Ácidos Graxos Poliinsaturado
L• Radical lipídico
LOO• Radical Peroxil
LOOH Radical hidroperóxido
LO• Radical Alcooxil
MDA Malondialdeído
O2 Oxigênio Molecular
O2•¯ Radical Anion Superóxido
•OH Radical hidroxil
RSC Radical Scavenging Capacity
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SME Spondias sp. Methanolic Extract

SOD Superóxido Dismutase
SRAT Substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico
SRL Sequestro de Radical Livre
TBA Ácido Tiobarbitúrico
TBAR Thiobarbituric acid Reactive Products
TCA Ácido Tricloroacético
TNB Ánion tiolato
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LISTA DE FIGURAS
Figura pág.
01 Detalhes da exsicata de Spondias sp. depositada no 21
Herbário da Faculdade de Tecnologia e Ciências –
Departamento de Biologia – Campus Salvador.
02 Cajá-umbu (Spondias sp.) Linn. (EMBRAPA) A. detalhes 22
dos frutos maduros, e B. galhos de cajá-umbuzeiro.
03 Peroxidação Lipídica (Adaptado LOUREIRO et al., 2002). 26
04 Detoxificação enzimática realizada pela CAT e GPx 28
05 Estrutura do -tocoferol (BRITO, 2009) 30
06 Estrutura base dos flavonóides (TIWARI, 2001). 34
07 Mecanismo de sequestro das ERO (R•) por flavonóides, 35

com formação de estrutura estável (Adaptado de HEIM,
2002).
08 Esquema do processo de partição do extrato metanólico 42
(EMS) de Spondias sp. para obtenção das frações semi-
purificadas. (adaptado de CAJUEIRO et. al, 2008)
09 Teor extrativo total obtido por maceração durate intervalos 60
de tempo de 1 à 7 dias de um grama de massa seca vegetal
em etanol (EtOH) ou metanol (MetOH) na proporção 1:5.
10 Gráfico de calorimetria exploratória diferencial (DSC) do 61
padrão de rutina e do composto isolado.
11 Espectros de UV, varredura de 200 – 500 nm, do composto 62

isolado (A), composto isolado + AlCl3 (B), composto isolado
+ AlCl3 + HCl (C), rutina padrão (D), rutina padrão + AlCl3
(E) e rutina padrão + AlCl3 + HCl (F).
12 Estrutura química da rutina 66
13 Varredura espectral em 2D e 1D dos marcadores 67
14 Análise cromatográfica exploratória dos nove padrões, 68

eluição de 5-50% de fase B, fluxo de 1 mL/min, volume de
injeção de 10 uL e detecção a 254 nm. Fase A:água
acidificada, pH 3,0, acido formico e Fase B: Acetonitrila.
15 Análise cromatográfica dos nove padrões e extrato bruto de 69

Spondias sp. , eluição por gradiente, fluxo de 1,3 mL/min,
volume de injeção de 9 uL e detecção a 280 nm. Fase
A:água acidificada, pH 3,0, acido formico, e Fase B:
Acetonitrila.
- 11 -
16 Análise de pureza de pico dos nove compostos. Área verde: 70

pura; área amarela: parcialmente pura e vermelha: impura.
17 Histopatologia de fígado murino (Hematoxilina e Eosina). 80
Dos diferentes grupos testados.
18 Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre as 81
concentrações de SRAT em homogenato de fígado de
animais intoxicados com CCl4.
19 Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre o conteúdo de 82
GSH em homogenato de fígado de animais intoxicados com
CCl4.
20 Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre a atividade 85
catalásica em homogenato de fígado de animais intoxicados
com CCl4
21 Efeito do EMS e FRF sobre a nocicepção induzida por 89
formalina 3,5% em camundongos.
22 Efeito do EMS e FRF sobre a atividade locomotora 90
espontânea em camundongos.
23 Efeito do EMS e FRF sobre a migração de leucócitos totais 92
(painel A), e neutrofilos (painel B) induzida pela carragenina
(750 ug/cavidade) por 4 h.
24 Efeito do tratamento com FRF sobre o conteúdo de GSH 93
em exudato peritonial de camundongos pré tratados com
carragenina
25 Efeito da FRF sobre a nocicepção induzida por capsaicina 94
(5,2 nmol/pata) em camundongos.
26 Efeito da FRF sobre a nocicepção induzida por 94
cinamaldeído (10nmol/pata) em camundongos.
27 Efeito do tratamento com EMS (300 mg/kg) e FRF 96
(30mg/kg) sobre a alodinia mecânica induzida pela injeção
intraplantar de CFA em camundongos.
28 Efeito do tratamento com FRF (30mg/kg) sobre a 97
sensibilidade na placa quente (56ºC) em camundongos com
dois dias de inflamação crônica induzida por CFA.
29 Efeito do tratamento com FRF (30mg/kg) sobre a 97
sensibilidade ao frio (0,2 ml/pata de acetona) em
camundongos com três dias de inflamação crônica induzida
por CFA.
30 Grafico de acompanhamento do consumo de água, ração e 98
peso corporeo dos animais controle e tratados com dose
única de SEM 2000 mg/kg, no periodo de 14 dias.
31 Gráfico de acompanhamento do consumo de água, ração e 99
peso corporêo dos animais controle e tratados com doses
de EMS 500 mg/kg, no período de 28 dias.
- 12 -
LISTA DE TABELAS
Tabela pág.
01 Espécies do gênero Spondias distribuídas no Brasil 20
02 Bioatividade atribuídas a espécies da família anacardiácea 22
03 Esquema do gradiente de eluição estabelecido para 45
separação dos compostos fenólicos.
04 Deslocamentos Quimicos (ppm) de RMN-13C e RMN-1H do 65
composto isolado, padrão rutina e lituratura.
05 Ensaios de validação segundo a RE nº 899 72
06 Capacidade sequestradora de 50% dos radicais livres, em 75
µg/mL, dos padrões e dos extratos aquoso, etanolico e
EMS, e frações.
07 Parâmetros bioquímicos de avaliação de lesão e função 78
hepática nos animais dos diferentes grupos experimentais
08 Atividade das enzimas SOD e GPx em homogenato de 86
fígado dos animais dos diferentes grupos experimentais.
09 Determinação da atividade antibacteriana do extrato bruto e 87
das frações contra as cepas testadas.
10 Parâmetros hematológicos e bioquímicos dos animais 100
controle e tratados com dose única de EMS 2000 mg/kg e
28 doses de 500 mg/kg de EMS.
- 13 -
SUMÁRIO
Pág.
1. Introdução 17
2. Revisão de literatura 20
2.1 Levantamento botânico 20
2.2 Atividades Farmacológicas 22
2.3 Estresse oxidativo 23
2.3.1 Espécies reativas de oxigênio 23
2.3.2 Peroxidação Lípidica 25
2.3.3 Sistema de defesa antioxidante 26
2.3.4 Antioxidantes Naturais 29
2.4 Atividade antibacteriana 31
2.5 Inflamação 32
2.6 Dor 33
2.7 Composição Química 34
2.7.1 Flavonóides 34
2.8 Avaliação toxicológica 36
3. Objetivo 38
3.1 Objetivo Geral 38
3.2 Objetivos Específicos 38
4 Metodologia 41
4.1 Material Vegetal 41
4.2 Otimização do processo extrativo 42
4.3 Obtenção do Extrato Metanólico, das frações e isolado de 42
folhas Spondias sp.
4.4 Caracterização da Composição Química dos Extratos e 44
isolado
4.4.1 Determinação de polifenólicos 44
4.4.2 Espectrofotometria UV 44
4.4.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) 44
4.4.4 Ressonância Magnética Nuclear 13C e 1H 45
4.4.5 Desenvolvimento e validação de método analítico por 45
CLAE-DAD
- 14 -
4.5 Determinação da capacidade antioxidante in vitro 47

4.5.1 Capacidade de SRL pelo Teste do DPPH 47
4.6 Determinação da capacidade antioxidante in vivo 47
4.6.1 Animais 47
4.6.2 Desenho experimental 48
4.6.3 Avaliação Bioquímica 48
4.6.4 Coleta e Processamento das amostras 49
4.6.5 Preparo do homogenato de Fígado 49
4.6.5.1 Determinação de SRAT 49
4.6.5.2 Determinação da glutationa 50
4.6.5.3 Determinação da atividade da CAT 50
4.6.6 Análise histopatológica 50
4.7 Ensaios Antimicrobianos 51
4.7.1 Difusão em Agar 51
4.7.1.1 Preparo das amostras 51
4.7.1.2 Preparo dos discos 51
4.7.1.3 Meio de cultura 52
4.7.1.4 Preparo do inoculo 52
4.7.1.5 Teste da atividade antibacteriana 52
4.8 Avaliação da atividade antinociceptiva e antiinflamatória 53
4.8.1 Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de Formalina 53
em camundongos
4.8.2 Avaliação da atividade locomotora espontânea 53
4.8.3 Peritonite induzida por carragenina 54
4.8.3.1 Contagem de leucócitos peritoneais 54
4.8.3.2 Avaliação do estresse oxidativo (GSH) 54
4.8.4 Alodínia mecânica induzida pelo CFA 54
4.8.4.1 Nocicepção induzida pelo estímulo térmico 55
4.9 Ensaios toxicológicos 56
4.10 Análise estatística 57
5 Resultados e discussão 59
5.1 Otimização do Processo Extrativo 59
5.2 Caracterização da composição química 60
5.2.1 Concentração de polifenólicos 61
5.2.2 Isolamento e identificação do composto majoritário 61
- 15 -
5.3 Desenvolvimento de método analítico por CLAE-DAD 66

5.3.1 Espectros de varredura para os padrões 66
5.3.2 Análise dos padrões durante o gradiente exploratório 68
5.4 Validação de método analítico por CLAE-DAD 70
5.4.1 Parâmetros analíticos de validação 70
5.5 Aplicação do método por CLAE no EMS 72
5.6 Capacidade antioxidante in vitro 73
5.6.1 Capacidade de SRL pelo Teste do DPPH 73
5.7 Determinação da capacidade antioxidante in vivo 76
5.7.1 Avaliação Bioquímica 76
5.7.2 Análise histopatológica 79
5.7.3 Marcador de Peroxidação Lipídica - SRAT 81
5.7.4 Biomarcadores Antioxidates 82
5.7.4.1 Glutationa Reduzida em homogenato de fígado 82
5.7.4.2 Atividade catalásica em homogenato de fígado 85
5.7.4.3 Determinação da atividade das enzimas SOD e GPx em 86
homogenato de fígado
5.8 Ensaios Antimicrobianos 87
5.9 Avaliação da atividade antinociceptiva e antiinflamatória 88
5.9.1 Nocicepção induzida por injação intraplantar de formalina 88
em camundongos
5.9.2 Efeito do EMS e FRF sobre a atividade locomotora 90
espôntanea em camundongos
5.9.3 Efeito do EMS e FRF sobre a peritonite induzida por 91
carragenina
5.9.4 Efeito da FRF sobre a nocicepção induzida pela injeção 93
intraplantar de capsaicina ou cinameldeido em
camundongos
5.9.5 Efeito do EMS e FRF sobre a alodínia mecânica induzida 95
pelo Adjuvante completo de Freud (CFA)
5.10 Ensaios toxicológicos 98
6 Conclusão 102
Referências 104
Anexo 01 116
Anexo 02 120
Anexo 03 129
Anexo 04 130
- 16 -
INTRODUÇÃO
- 17 -
1 INTRODUÇÃO
O Brasil possui a maior biodiversidade do planeta que, associada a uma rica
diversidade étnica e cultural detém um valioso conhecimento tradicional quanto
ao uso de plantas medicinais, e, consequentemente, o potencial necessário
para o desenvolvimento de pesquisas que resultem em tecnologias e
terapêuticas apropriadas (BRASIL, 2005).
Esse imenso patrimônio genético, já escasso nos denominados países

desenvolvidos, tem na atualidade um inestimável valor econômico-estratégico
no campo do desenvolvimento de novos medicamentos. Neste ponto, é
importante ressaltar que aproximadamente 40% dos medicamentos utilizados
na terapêutica derivam direta ou indiretamente de produtos naturais, e um
quarto do faturamento anual da indústria farmacêutica são oriundos desses
medicamentos (CALIXTO, 2003).
No intuito de estabelecer diretrizes para a atuação do governo e de grupos de

pesquisa na área de plantas medicinais e fitoterápicos, foi elaborada a Política
Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, a qual é, em parte, essencial
para o uso sustentável da biodiversidade brasileira, a geração de emprego e
renda, o desenvolvimento industrial e tecnológico e a perspectiva de inclusão
social e regional. Entre os fatores previamente admitidos, ressalta-se a
necessidade de minimizar a dependência tecnológica e estabelecer uma
posição de destaque do Brasil no cenário internacional (BRASIL, 2005).
Os países desenvolvidos detêm as maiores indústrias farmacêuticas e geram

boa parte da pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos, em virtude
da alta tecnologia, dos elevados custos e dos riscos inerentes para o
desenvolvimento de um novo medicamento sintético1 (CALIXTO, 2003). Ainda
neste contexto, se encontram os fitoterápicos, preparações de extratos
padronizados de uma ou mais plantas, cujos constituintes bioativos são poucos
conhecidos e a sua ação farmacológica envolve a interação de inúmeras
moléculas presentes no extrato (BRASIL, 2005). Estes merecem atenção, pois
1
Medicamento Sintético: produto farmacêutico, tecnicamente obtido ou elaborado por síntese
artificial, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnósticos. É uma forma
farmacêutica terminada que contém o fármaco, geralmente, em associação com adjuvantes
farmacotécnicos (BRASIL, 2004).
- 18 -
a pesquisa e desenvolvimento desses medicamentos são caracterizados por

menores custos, e riscos atenuados, uma vez que o estudo etnofarmacológico,
o conhecimento tradicional é a ferramenta de escolha do espécime de plantas
medicinais a ser estudado (GURIB-FAKIM, 2006).
Dessa forma, os estudos sobre a medicina popular vêm despertando cada vez
mais a atenção científica na identificação e na caracterização química de novos
princípios ativos, visando elucidar a ação farmacológica e efeitos tóxicos
dessas substâncias (GURIB-FAKIM, 2006).
Assim, no presente trabalho as atividades farmacológicas dos extratos, frações

e composto isolado de folhas de Spondias sp. foram avaliadas em ensaios in
vitro e in vivo, somadas a avaliação da toxicidade para garantir a eficácia e a
segurança do uso desta espécie como um propenso fitoterápico.
- 19 -
REVISÃO DA LITERATURA
- 20 -
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Levantamento botânico
A família Anacardiaceae compreende 77 gêneros e cerca de 600 espécies,

conhecidas por apresentarem frutos comestíveis, em sua maioria, na forma de
drupas. O gênero Spondias, pertencente a esta família, apresenta 18 espécies
de plantas distribuídas nas regiões tropicais do planeta (MIN TIANLU &
BARFOR, 1980).
No Brasil, este gênero é representado por várias espécies, como mostrado na

tabela 1, distribuídas nas regiões norte e nordeste, onde são utilizadas
popularmente no preparo de sucos, doces, picolés e sorvetes a partir do fruto,
por apresentarem odor agradável e sabor agridoce (LIRA JUNIOR, 2005).
Tabela 1. Espécies do gênero Spondias distribuídas no Brasil
Nome científico Nome popular

S. mombin L. Cajazeira
S. purpurea L. Sirigueleira
S. cytherea Sonn. Cajaraneira
S. tuberosa Arr. Cam Umbuzeiro
Spondias sp. Cajá-umbuzeiro ou umbugueleira
O cajá-umbu (Spondias sp.) é uma planta frutífera nativa do Nordeste

Brasileiro, originada de possíveis cruzamentos naturais entre o cajá (S.
mombim L.) e o umbu (S. tuberosa Arr. Cam.), que está ainda em fase de
domesticação, apresentando uma acentuada variabilidade quanto à morfologia
de suas folhas e frutos (Figura 1) (LIRA JUNIOR, 2005). Atualmente, ela é
descrita como uma nova espécie, denominada S. caatinguae, uma vez que
análises filogenéticas determinaram a presença de genes únicos da nova
espécie (CARVALHO & VAN DEN BERG, 2008).
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O fruto do cajá-umbuzeiro é caracterizado como uma drupa arredondada, de

cor amarela, casca fina e lisa, com endocarpo, denominado “caroço”, grande,
branco, suberoso e enrugado localizado na parte central do fruto, em cujo
interior se encontram os lóculos, podendo ou não conter uma semente (Figura
2). Diversos fatores influenciam as características físicas e físico-químicas de
frutos, destacando-se a constituição genética, condições edafoclimáticas, tratos
culturais e tratamento pós-colheita.
Figura 1. Detalhes da exsicata de Spondias sp.(voucher nº

2897/12.09) depositada no Herbário da Faculdade de Tecnologia e
Ciências, Departamento de Biologia, Campus Salvador, Salvador, BA.
Os caracteres físicos dos frutos referentes à aparência externa, ao tamanho, à

forma e à cor da casca, assim como as características físico-químicas (sabor,
odor, textura e valor nutritivo), constituem atributos relacionados à qualidade
para sua comercialização e utilização da polpa na elaboração de produtos
industrializados (LIRA JUNIOR, 2005).
Quanto às folhas do cajá-umbuzeiro, as mesmas foram descritas

macroscopicamente como imparipinadas constituídas de 7 a 9 folíolos, de
4,8±1,2 cm de comprimento por 3,0±0,6 cm de largura, inteiros e peninérveos,
com pecíolos de 3,0±0,5 cm, reto e de inserção lateral, com limbo papiráceo,
ovulado levemente acuminado. Microscopicamente, os folíolos apresentam
epiderme simples com cutícula espessa, mesófilo heterogêneo assimétrico,
composto por quatro camadas de parênquima lacunoso e bordas de
parênquima paliçádico de células curtas. A nervura central com três canais
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secretores e dois feixes vasculares, e idioblasto com inclusão de oxalato de

cálcio. Apresenta pecíolo de forma poligonal (ROCHA et al., 2008).
Figura 2. Cajá-umbu (Spondias sp.) Linn. (EMBRAPA)

A:Detalhes dos frutos maduros, e B: Galhos de cajá-umbuzeiro.
2.2 Atividade farmacológica
A família Anacardiaceae apresenta espécies e variedades com usos populares,

além de comprovações científicas quanto à bioatividade (Tabela 2).
Tabela 2. Bioatividade atribuídas a espécies da família anacardiácea

Nome Nome Usos populares Avaliações Científicas
científico popular
S. mombin L. Cajazeira Conjutivite Atividade antibacteriana
(ALBUQUERQUE et (ABO, 1999); Atividade
al., 2009); antiviral (COURTHOUT et
al., 1989; PENA et al.,
1999; VILLEGAS et al.,
1997), Atividade
antiedematogênica
(PENA, 2000);
Anacardium Cajú Anemias, Vitamina C
ocidentale L. esgotamento (FERNANDES et al.,
nervoso, anti- 1989).
inflamatório diurético
e gengivite
(FERNANDES et al.,
1989)
Astronium Aroeira de Bronquite, Efeitos cicatrizante e anti-
fraxinifolium miolo Tuberculose e inflamatório, ações
Schott. diabetes antihistamínica e
(FERNANDES et al., antibracinina
1989) (FERNANDES, et al.,
1989).
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Quimicamente, o gênero Spondias é caracterizado pela presença de

terpenóides do grupo dos sesquiterpenos e monoterpenos, como também de
flavonóides, taninos, alcalóides e lipídios (MENDES & ELISALDO, 2007;
TALHOUK et al., 2007).
O fruto do cajá-umbu apresenta teores elevados de vitamina C e glicídios.

Investigações fitoquímicas realizadas com a polpa do fruto indicaram o cajá-
umbuzeiro como fonte natural de antioxidante, sendo isolados a partir do
extrato acetato, furfural e alfa/beta-D-glicose. O furfural apresentou atividade
antioxidante moderada (ALMEIDA, 2000).
Rhus, outro gênero da família anacardiácea, possui múltiplas atividades

farmacológicas devido a taninos, portanto, com um potencial promissor devido
às diversas bioatividades: antifibrinogênica, antifúngica, antiinflamatória,
antimalárica, antimicrobiana, antitumoral, antiviral, citotóxica, hipoglicemiante e
leucopênica, assim como atividade antioxidante (RAYNE & MAZZA, 2007).
2.3 Estresse oxidativo
2.3.1. ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
Os organismos aeróbios necessitam de oxigênio molecular (O2) para produção

de energia. Normalmente, a maior parte deste oxigênio é reduzida na
mitocôndria a água pela ação da enzima citocromo oxidase com a transferência
de quatro elétrons para o oxigênio sem liberação de intermediários reativos.
Entretanto, cerca de 5% do O2 presente nos organismos é reduzido
enzimaticamente, gerando as Espécies Reativas de Oxigênio (ERO),
intermediários altamente reativos, que constituem os denominados radicais
livres (DROGE, 2002; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).
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O termo radical livre utilizado para designar qualquer átomo ou molécula cuja
estrutura atômica apresenta um ou mais elétrons desemparelhados no seu
orbital mais externo, sendo por isso instável e com grande capacidade de
reatividade. Outras espécies químicas podem-se formar a partir dos radicais
livres, que embora, não tenham elétrons desemparelhados, possuem similar
instabilidade estrutural dos radicais livres. (RIBEIRO et al., 2008).
Assim as espécies reativas incluem radicais do oxigênio (ERO) e do nitrogênio

(ERN), e certas espécies não radicalares, que podem ser convertidas
facilmente à radical (EHRENBRINK et al, 2006). O oxigênio pode gerar ERO
ora por absorção de energia ou por transferência de elétrons (BARREIROS et
al., 2006). Assim, ao absorver energia (luz ou radiação) no seu estado
fundamental formam-se as espécies excitadas conhecidas como oxigênio
singlet (1O2) que embora não constituindo radicais livres, apresentam alto
poder oxidante, reagindo rapidamente com biomoléculas (BARREIROS et al.,
2006; KARIHTALA & SOINI, 2007). Outro mecanismo de geração de ERO
consiste na redução do O2 à água com a formação de radical ânion superóxido
(O2•¯), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (•OH). Estes produtos,
uma vez formados, podem reagir com biomoléculas danificando ou inativando
estruturas celulares (KARIHTALA & SOINI, 2007).
O ânion superóxido (O2•¯), primeiro produto da redução monoeletrônica do O2,

é gerado através de sistemas enzimáticos, como os das enzimas xantina
oxidase, NADPH oxidase e peroxidades (GENESTRA, 2007). A reação de
dismutação de O2•¯, catalisada pela enzima superóxido dismutase (SOD),
forma H2O2, um intermediário reativo (VASCONCELOS et al., 2007). Enzimas
oxidases, como a xantina oxidase e aminoácido oxidase, também formam
H2O2, que embora sendo uma espécie não radicalar, pode reagir com metais
redox-ativos (e.g. ferro e cobre), gerando o radical •OH (VALKO, 2004;
YOSHIDA & CAMPOS, 2005).
O radical •OH é a forma radicalar mais reativa no sistema biológico, cuja

remoção in vivo é difícil, em face da não existência de enzimas que catalisem
esta espécie. Este radical pode ser gerado por radiação ionizante e em reações
com metais de transição, a partir da Reação de Fenton. Além disso, a reação
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do radical O2•¯ com H2O2, via reação de Haber-Weiss, forma o radical •OH
(HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; VASCONCELOS, 2007).
O2•¯ + Fe3+  O2 + Fe2+

Fe2+ + H2O2  Fe 3+ OH• + OH¯ (Reação de Fenton)
O2•¯ + H2O2  O2 + OH• + OH¯ (Reação de Haber-Weiss)
O excesso na formação e/ou a incapacidade na remoção de moléculas

altamente reativas caracteriza o quadro de estresse oxidativo (VALKO et al,
2007); um excesso de agentes oxidantes e/ou deficiência do sistema protetor,
que causa o desequilíbrio entre o consumo de glutationa reduzida (GSH) e a
produção de glutationa oxidada (GSSG). O aumento de GSSG favorece a
formação de pontes dissulfeto (-S-S-) nas proteínas portadoras de grupamento
tiol (-SH). Assim, a oxidação deste grupo prejudica as funções das
biomoléculas (RAHMAN & MacNEE, 2000). A redução das pontes de dissulfeto
pode ocorrer devido à ação de compostos antioxidantes, como a GSH e pelo
sistema tioredoxina (NORDBERG & ARNER, 2001).
Assim, o estresse oxidativo não pode ser definido apenas pelo desequilíbrio
entre parâmetros pró-oxidantes e antioxidantes. Atualmente, conceituado como
uma perturbação da sinalização e do controle redox, levando-se em
consideração o sistema redox GSSG/GSH, tioredoxina e cisteina/cistina
(JONES, 2006).
2.3.2 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
A peroxidação lipídica, a primeira consequências do estresse oxidativo, ocorre

em ácidos graxos poliinsaturados (LH) e se inicia com o radical •OH que ao
capturar um átomo de hidrogênio de um carbono metileno da cadeia polialquil
do ácido graxo, forma um radical (L•). O fato do O2 ser mais solúvel em meio
não polar que em meio polar, permite que as membranas biológicas tenham
uma elevada concentração de O2 na região hidrofóbica medial, onde seu
potencial gera efeitos deletérios nos ácidos graxos poliinsaturados da
membrana (JONES, 2006). Assim, um ácido graxo com um elétron
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desemparelhado reage com O2 gerando um radical peroxil (LOO•), capaz de

retirar um hidrogênio de um ácido graxo poliinsaturado adjacente da
membrana, aumentando a reação de propagação da cadeia de peroxidação
lipídica, com formação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) (GATÉ et al., 1999).
Os hidroperóxidos lipídicos são instáveis na presença de metais de transição
(e.g. ferro ou cobre), levando à formação de radicais alcooxil (LO•) e peroxil
(LOO•). (LOUREIRO et al., 2002). A figura 3 representa o processo de
peroxidação lipídica.
Figura 3. Peroxidação Lipídica (Adaptado LOUREIRO et al., 2002).
Um dos produtos da peroxidação lipídica é o malondialdeído (MDA), um

dialdeído, altamente reativo, que eventualmente reage com os grupos amino de
proteínas, com fosfolipídios ou com ácidos nucléicos, induzindo modificações
estruturais nas moléculas biológicas (FREI, 1997; YOUNG, 2001; DROGE,
2002). Esse aldeído é o mais abundante e sua avaliação é feita
espectrofotometricamente ao se medir um complexo colorido, produto da
reação com o ácido tiobarbitúrico (THÉROND et al, 2000).
2.3.3 SISTEMA DE DEFESA ANTIOXIDANTE
O sistema de defesa antioxidante é formado por antioxidantes enzimáticos e

não-enzimáticos, protegendo o organismo dos danos causados por ERO e
ERN, e, portanto, aumentam a defesa imunológica, atenuando o risco de
doenças degenerativas (WILLCOX et al, 2004; VALKO, 2007; CHATTERJEE et
al., 2007).
Superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), a glutationa peroxidase (GPx)

e a glutationa redutase (GR) constituem o sistema enzimático de defesa
(GRISSA, 2007), enquanto a glutationa reduzida (GSH), o ácido úrico,
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proteínas de transporte de metais de transição (transferrina, ceruloplasmina),

etc., de origem endógena, são os antioxidantes não-enzimáticos (DROGE,
2002; WILLCOX et al, 2004). Os antioxidantes exógenos, provenientes da
dieta, incluem os tocoferóis, carotenóides, ascorbato, micronutrientes (zinco,
selênio, manganês), taninos e flavonóides. A presença desses antioxidantes no
sistema celular é conhecida por prevenir danos oxidativos (SCHNEIDER &
OLIVEIRA, 2004; WU et al., 2005).
A função da SOD é catalisar a reação de dismutação do ânion radical

superóxido (O2•¯), gerando compostos menos reativos, oxigênio molecular e
peróxido de hidrogênio (H2O2), que pode ser degradado pelas enzimas GPx e
CAT. A SOD é a principal isoenzima nos fluídos extracelulares, mas também
ocorre em tecidos (NIKI, 2004). Existem três formas de SOD em mamíferos: a
cobre-zinco (Cu-Zn-SOD), manganês (Mn-SOD), e a SOD extracelular (EC-
SOD). A Cu-Zn-SOD está presente no citosol de todas as células, envolvida na
remoção dos ânions superóxido do citoplasma e, possivelmente, também do
peroxissoma (GRALLA & KOSMAN, 1992; JAMIESON et al, 1994); enquanto a
Mn-SOD está localizada principalmente nas mitocôndias, protegendo-a dos
superóxidos gerados durante a respiração (GUIDOT et al., 1993; JAMIESON et
al., 1994). Como indicado pelo nome, a EC-SOD é uma forma extracelular da
enzima e encontra-se em equilíbrio entre o plasmae a superfície das células
endoteliais, onde exerce sua ação protetora antioxidante (STROCKER e
KEANEY-JR, 2004)
Estas enzimas distribuem-se em diversos órgãos, na seguinte ordem de

atividade especifica: fígado, cérebro, testículos, rins, coração, estômago,
pulmão e pâncreas. A forma Cu/Zn-SOD apresenta-se mais resistente às
variações de temperatura e à desnaturação por substâncias como cloreto de
guanidina, duodecil sulfato de sódio, ou uréia (HALLIWELL & GUTTERIDGE,
2007). Outra isoforma, a Fe-SOD, uma ferro-enzima, foi identificada em
bactérias. Porém, as diferentes formas de SOD catalisam a mesma reação de
dismutação do radical O2•¯ (CHANCE et al., 1979; HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 2007).
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A catalase (CAT), uma hemeproteína, encontrada principalmente nos

peroxissomos celulares e em extensão no citosol, decompondo o H2O2 a H2O e
O2. Esta reação é vital, pois o H2O2 é nocivo à célula devido a sua capacidade
de atacar as cadeias de ácidos graxos insaturados presentes nas membranas,
além de outras macromoléculas (FRIDOVICH, 1998). Esta enzima está
presente em animais, plantas, bactérias e fungos, sendo encontrada no
sangue, na medula óssea, em mucosas, rins e fígado. Embora a CAT seja
capaz de catalisar H2O2, é praticamente inativa frente à hidroperóxidos
orgânicos, diferentemente da GPx que é altamente ativa na presença desses
compostos (URSINI et al., 1995; JACOB, 1995; STOCKER e KEANEY-JR,
2004).
A glutationa peroxidase (GPx), uma enzima dependente de selênio, coopera

com a CAT na remoção de hidroperóxidos (ROOH). A GPx reduz o H2O2, os
peróxidos alifáticos e aromáticos à água e seu correspondente álcool inerte,
mediante uma reação dependente de GSH e de NADPH como fonte de
equivalentes redutores (GRISSA, 2007).
A glutationa (GSH), o tripeptídeo D-L-glutamil-L-cisteinil-glicina, é o

antioxidante intracelular mais abundante, com importante função na
manutenção do estado redox celular (CHOIN et al., 1997). Ao atuar como
cofator da GPx na eliminação do H2O2, a GSH passa para GSSG, sendo
recuperada pela glutationa redutase (GR) na presença de NADPH (Figura 4).
Além do seu papel central na atividade da GPx, a GSH está envolvida em
várias outras vias antioxidantes, incluindo sequestro de radicais livres, no
metabolismo do ascorbato e na detoxificação de xenobióticos via glutationa
transferase (YOUNG, 2001; DROGE, 2002; YOSHIDA & CAMPOS, 2005;
STOCKER e KEANEY-JR, 2004).
Neste contexto, se destaca a glutationa redutase (GR), de importância

fisiológica na manutenção do equilíbrio redox, ao impedir a paralisação do ciclo
metabólico da GSH. Em situações intensas de estresse oxidativo, a GSH pode
permanecer sob a forma oxidada (ROVER et al., 2006).
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Figura 4. Detoxificação enzimática realizada pela CAT e GPx

(Adaptado de PROCTO & REYNOLDS, 1984).
2.3.4. ANTIOXIDANTES NATURAIS
A ação antioxidante protetora do sistema biológico é complementada através

do sistema antioxidante não-enzimático constituído por substâncias, tais como
vitamina E (tocoferóis), vitamina C (ácido ascórbico) e β-caroteno
(carotenóides) (GRISSA, 2007). Substâncias estas que em associação aos
flavonóides, são os antioxidantes mais estudados em animais e humanos por
atuarem na redução de espécies reativas, principalmente do radical peroxil, e
do oxigênio singlet (FILIPE et al, 2001).
A vitamina E, principal antioxidante lipossolúvel presente nas membranas
celulares, tem o α-tocoferol como seu componente mais importante (Figura 5) e
atua no bloqueio da etapa de propagação da peroxidação lipídica dos ácidos
graxos poliinsaturados das membranas e lipoproteínas, ao doar um átomo de
hidrogênio aos radicais peroxil e alcoxil. A capacidade do α-tocoferol é
conferida pela de regeneração do radical α-tocoferoxil por agentes redutores,
principalmente o ácido ascórbico, mantendo assim a sua atividade antioxidante
(HALLIWELL & GUTTERIDGE,
CH
2007). 3
HO CH3
H CH3 H CH3
CH3
CH3 O
CH3
CH3
Figura 05. Estrutura do -tocoferol (BRITO, 2009)

- 30 -
Outro antioxidante natural, a vitamina C, conhecida como ácido ascórbico, é

hidrossolúvel, agindo contra radicais livres e o oxigênio “singlet”. Plantas e
animais podem sintetizá-la, com exceção de humanos, primatas e cobaias,
sendo, então, obtida da dieta (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; LI &
SCHELLORN, 2007). Ela pode atuar em sistemas biológicos como
antioxidante, antiteratogênica, anticancerígena e imunomoduladora. Sua
principal propriedade química é a habilidade para agir como agente redutor
(doador de elétrons) na regeneração do α-tocoferoxil (NAIDU, 2003;
HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; LI & SCHELLORN, 2007).
Os carotenóides, principalmente o β-caroteno, são absorvidos a nível entérico e
funcionam como precursores da vitamina A, e como antioxidantes. Portanto,
estas substâncias têm um duplo papel ao diminuir a formação do oxigênio
“singlet” in vivo, e na remoção daqueles já formados (TEE, 1992). O β-
caroteno, um pigmento presente em todas as plantas, pode ser encontrado em
membranas celulares, inclusive nos lipossomos (WILLCOX et al., 2004). Sua
deficiência pode estar relacionada com alterações hepáticas (TRÉROND et al.,
2000).
Os antioxidantes naturais são essencialmente polifenóis, ocorrendo em todas
as partes das plantas. Estruturalmente, estas moléculas são constituídas por
um ou mais núcleos aromáticos, contendo hidroxilas e/ou seus derivados
funcionais, substituindo ao menos um hidrogênio (CARVALHO et al., 2001;
ZUANAZZI & MONTANHA, 2004). A atividade antioxidante destas estruturas é
atribuída a sua propriedade redox, tendo, assim, um papel importante na
absorção e neutralização de radicais livres ou na decomposição de peróxidos;
daí que parece que apresentam efeitos farmacológicos benéficos em
desordens neurológicas (NAHAR & SARKER, 2005).
2.4 Atividade antibacteriana
A avaliação antibacteriana de plantas e seus derivados teve início na década

de 1940. Em 1943, Osborn, ao pesquisar a atividade de 2.300 plantas
superiores contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli, verificou que
- 31 -
plantas pertencentes a 63 gêneros continham substâncias que inibiam o

crescimento de um ou ambos os microorganismos. (PEDERSON, 1944).
No Brasil, as pesquisas sobre substâncias antimicrobianas de origem vegetal
foram iniciadas por Cardoso e Santos (1948) ao avaliarem extratos de 100
diferentes plantas, indicadas na terapêutica como antiinflamatórias ou
cicatrizantes. Destes, apenas cinco extratos apresentaram comprovada
atividade inibitória contra S. aureus e E. coli.
Na década de 50, os primeiros compostos de espécies vegetais foram isolados.
Dentre eles, destacam-se o isolamento e a identificação de flavonóides tais
como, primina, miconidina, lapachol e derivados, luteolina e miricetina,
apresentando propriedades antibacterianas efetivas contra S. aureus (XU e
LEE, 2001; ZACCHINO et al., 2001).
O conhecimento sobre determinadas espécies vegetais com propriedades
antimicrobianas tem sido revisto e ampliado, devido aos crescentes problemas
associados ao uso de diversos antibióticos. Em amplo estudo sobre plantas
medicinais foi feita uma avaliação concreta sobre a atividade antimicrobiana de
extratos, óleos essenciais e de substâncias obtidas de espécies vegetais contra
bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e espécies fúngicas (LIMA, 2001).
As plantas produzem um vasto número de substâncias naturais com potencial
antimicrobiano e imunomodulador na tentativa de se adaptarem às agressões
do meio ambiente. Essas substâncias podem ser isoflavonóides, indóis,
fitoestérois, polissacarídeos, sesquiterpenos, alcalóides, glucanas, taninos,
vitaminas e minerais (WILLIAMS, 2001)
Atribui-se a flavónoides e taninos a capacidade de inibir o crescimento ou
provocar a morte de microorganismos. Os flavonóides podem inibir importantes
enzimas virais como transcriptase reversa e proteases, bem como destruir
alguns protozoários patogênicos, sendo essas atividade de baixa toxicidade em
células animais (HAVSTEEN, 2002).
Os taninos condensados são os componentes que possuem a maior toxicidade
em relação aos microorganismos e são diversos seus mecanismos de ação:
inibição de enzimas extracelulares, privação de substratos, comprometimento
do metabolismo – como ação sobre a membrana celular (SCALBERT, 1991).
Estudos com diversas espécies da família Anacadiaceae exemplificam e
comprovam o uso da medicina tradicional no combate a doenças causadas por
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microorganismos (ELOFF,2001; OZÇELIK, 2005; LOGUERCIO, 2005; ERAZO

et al, 2006). A espécie Anacardium occidentale, conhecida como caju
verdadeiro, é vastamente estudada e o potencial antimicrobiano da casca da
árvore é relatado em diversos trabalhos (HIMEJINA & KUBO, 1991; KUDI et al.,
1999; AKIPELU, 2001).
O extrato aquoso do caule e folhas de Schinus terebenthifolius Raddi,
conhecida popularmente por aroeira, mostrou-se positivo na inibição do
crescimento de microorganismos, como Staphylococcus aureus, S.
epidermidis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa (LIMA et al., 2004).
2.5 Inflamação
A resposta inflamatória é um mecanismo que provoca alterações do sistema
vascular, componentes líquidos e celulares, visando destruir, diluir ou isolar o
agente lesivo, sendo assim uma reação de defesa e de reparação do dano
tecidual (GILMAN, 1996; RANG; DALLE; RITTER, 1997).
A inflamação aguda é a primeira resposta a uma lesão celular ou tecidual, na

qual contempla uma série de alterações sequenciais do processo, que é
mediado por substâncias, como histamina, serotonina, bradicinina,
prostaglandinas e leucotrienos. Segundo Lieberman (2009), a histamina
desempenha papel fundamental ao aumentar a permeabilidade celular,
gerando a vasodilatação, desencadeada ao se ligar à receptores H1 da células
endoteliais.
Este processo aumenta o fluxo sanguíneo local, consequentemente o
extravasamento de grande quantidade de líquidos e de proteínas para os
espaços intersticiais.
Uma das etapas iniciais do processo inflamatório é a marginação ou
deslocamento dos leucócitos da porção periférica dos vasos sanguíneos, que,
na sequência migram sob o endotélio, aderindo-se fortemente e atingindo o
espaço intercelular do endotélio. Todas estas reações são desencadeadas por
mediadores químicos originados no local do processo inflamatório.
A inflamação pode ocorrer em três fases distintas, cada uma mediada por
diferentes mecanismos: a fase aguda que se caracteriza pela vasodilatação e o
- 33 -
aumento da permeabilidade vascular, a fase subaguda na qual ocorre a

infiltração de leucócitos e fagócitos e a fase crônica, caracterizada pela
degeneração de tecidos e a presença de fibrose (ROTELLI et al. 2003).
Portanto, a inflamação é um processo tipicamente caracterizado pelo aumento
da permeabilidade vascular do tecido endotelial e do influxo de células
leucocitárias até o sítio inflamatório.
O uso das plantas medicinais vem sendo aceito e utilizado por vários
profissionais por apresentarem propriedades químicas que ajudam no
tratamento das doenças inflamatórias (MARTINS et al., 2000).
Das várias aplicações terapêuticas dos vegetais, muitos apresentam atividade
antiinflamatória e analgésica, sendo largamente utilizados na medicina popular
e por isso, há necessidade de pesquisas e estudos para comprovar tanto essas
atividades, quanto um possível quadro tóxico, em ensaios biológicos (SILVA,
1978; SEDGWICK; WILLOUGHBY, 1985).
No Brasil, a utilização de plantas no tratamento de doenças inflamatórias
apresenta, fundamentalmente, influências da cultura indígena, africana e
européia. Essas influências deixaram marcas profundas nas diferentes áreas
da cultura brasileira, sob o aspecto material e espiritual e constituem a base da
medicina popular que há algum tempo vem sendo retomada pela medicina
natural. A medicina natural procura aproveitar suas práticas, dando caráter
científico e integrando-as em um conjunto de princípios que visam não apenas
curar algumas doenças, mas restituir o homem à vida natural (MARTINS et al.,
2000).
Segundo Góes et al. (2005), a aroeira-do-sertão, Myracrodruon urundeuva Fr.
AlI, planta da família Anacardiaceae, é uma planta de uso popular no nordeste
do Brasil, que apresenta eficácia terapêutica, com evidentes efeitos
antiinflamatório, cicatrizante, antiulcerogênico, anti-histamínico, antibradicinina
e analgésico. Assim, a planta pode ser utilizada no tratamento de várias
afecções, principalmente ginecológicas e ferimentos cutâneos.
Estudos realizados com Ageratum conyzoides em ratos mostraram que a
planta possui significativa atividade analgésica, antiinflamatória e antipirética,
devido aos seus princípios ativos (flavonas e flavonóides), não sendo
observada toxicidade gástrica (CASTRO, 1987).
- 34 -
Grande parte das atividades dos flavonóides descrita em artigos contempla sua
ação no sangue e em células endoteliais, o qual vem de encontro com as
principais áreas de pesquisa, concentradas na inflamação e no câncer. Embora
os flavonóides sejam estudados há mais de 50 anos, o mecanismo celular
envolvido em sua ação biológica não está completamente elucidado
(BENAVENTE-GARCÍA; CASTILLO, 2008).
2.6 Dor
A sensação de dor é um mecanismo de alerta do organismo, indicando a

presença de um estímulo lesivo que aciona respostas protetoras apropriadas
(WOOLF, SALTER, 2000; JULIUS, BASBAUM, 2001). Dessa maneira, o
adequado funcionamento do sistema nociceptivo é essencial para proteger o
organismo de danos teciduais. Entretanto, sob condições patológicas, este
sistema se torna sensibilizado e a dor transforma-se em uma doença
(ZEILHOFER, 2005).
A nocicepção é o processo pelo qual estímulos térmicos, mecânicos ou
químicos nocivos são detectados por uma subpopulação de fibras nervosas
periféricas, chamadas nociceptores (BASBAUM et al., 2009).
Na última década, muitas moléculas de transdução da nocicepção têm sido
identificadas, sendo o maior grupo de detectores de estímulos nocivos o da
família dos receptores de potencial transitório (TRP) (CHENG, JI, 2008;
PATAPOUTIAN, TATE, WOOLF, 2009). Esses canais participam na geração
de sensações dolorosas evocadas por estímulos químicos, térmicos e
mecânicos (LEVINE, ALESSANDRI-HABER, 2007). O receptor de potencial
transitório vanilóide 1 (TRPV1), originalmente denominado receptor vanilóide 1
(VR1) e comumente referido como receptor da capsaicina, foi o primeiro a ser
descrito como receptor polimodal ativado por três estímulos dolorosos;
compostos vanilóides (capsaicina, resiniferatoxina), calor nocivo (43°C) e pH
baixo (< 5,9) (CATERINA et al., 1997; TOMINAGA et al., 2007).
Similar ao receptor para o calor (TRPV1) há dois receptores que detectam o
frio. O receptor de potencial transitório anquirina 1 (TRPA1), chamado
anteriormente de ANKTM1, é um canal não-seletivo permeável ao cálcio
- 35 -
(STORY et al., 2003) e ativado por temperaturas menores que 17°C (CALIXTO
et al., 2005; PATAPOUTIAN, TATE, WOOLF, 2009). Esses receptores também
podem ser ativados por substâncias pungentes, tais como alicina, D9-
tetraidrocanabinol (THC), formalina, substâncias presentes nos óleos de
mostarda (isotiocianato de alila) e canela (cinamaldeído), e moléculas irritantes
presentes no meio ambiente (BANDELL et al., 2004; JORDT et al., 2004).
2.7 Composição química
2.7.1 FLAVONÓIDES
Dentre os polifenóis estudados, destacam-se os flavonóides, compostos

considerados não-essenciais, porém amplamente distribuídos entre plantas
vasculares, sendo encontrados em numerosos frutos, grãos e em outras partes
do vegetal (BORS et al, 1996). Estas substâncias estão presentes em produtos
consumidos diariamente na dieta humana (e.g. frutos, vegetais, especiarias,
cacau, chá verde, vinho tinto seco) (SCALBERT & WILLIAMSON, 2000).
Diversas funções biológicas e farmacológicas têm sido atribuídas aos
flavonóides (e.g. atividade antitumoral, antibacteriana, antiviral,
anticarcinogênica, antimutagênica, antiinflamatória, inibidor enzimático)
(PATHAK, 1991; AVIRAM & FUHRMAN, 2002; NESTEL, 2003).
A estrutura básica de um flavonóide, C6-C3-C6, contém um núcleo flavona (2-
fenilbenzo-γ-pirona) constituídos de anel benzeno –A e B– ligados através do
anel pirona C (Figura 6) (TIWARI, 2001).
- 36 -
5'
6' 4'
8 B
9 O 3'
7 2
A C 2'
6 3
10
5 4
O
Figura 6. Estrutura base dos flavonóides (TIWARI, 2001).
Ainda, a depender da substituição e do nível de oxidação, os flavonóides

podem ser divididos em subclasses: flavonóis (quercitina, kaempferol), flavonas
(rutina, apigenina), antocianidinas (cianidina), isoflavonóides (genisteína) e
flavononas (mirecetina, hesperidina), dentre outras (BRITO, 2009).
O efeito dos flavonóides sobre a peroxidação lipídica baseia-se na relação
estrutura-atividade. A característica principal para a inibição do processo é o
grupo catecol no anel B (BORS et al., 1996). Estudos sugerem que estas
moléculas bloqueiam a peroxidação lipídica ao doar átomos de hidrogênio aos
radicais hidroxil e peroxil, formando um radical semiquinona ou radical aroxil
que ao reagir com um segundo radical, adquire uma estrutura quinona estável,
terminando assim a cadeia de propagação da peroxidação lipídica como
mostrado na figura 7 (TIWARI, 2001).
Figura 7. Mecanismo de sequestro das ERO (R•) por flavonóides, com

formação de estrutura estável (Adaptado de HEIM, 2002).
Considerando a importância dos antioxidantes naturais na prevenção e/ou na

minimização de efeitos deletérios das ERO, o interesse pela comprovação
farmacológica e obtenção de novos agentes antioxidantes provenientes de
plantas vem aumentando nos últimos anos, especialmente após a introdução
- 37 -
do extrato padronizado de Ginkgo biloba na terapêutica como antioxidante

(PINCEMAIL & DEBY, 1986).
A silimarina, um biflavonóide extraído de Silybum marianum, cujos efeitos
medicinais são conhecidos desde a antiguidade no tratamento de problemas
biliares e hepáticos (LENG-PESCHLOW, 1996), devido a sua natureza
fenólica, é um antioxidante capaz de reagir com numerosos radicais livres,
como o radical hidroxila, formando compostos mais estáveis e menos reativos.
O extrato desta planta está incluído na farmacopéia de muitos países sob a
marca Legalon®, sendo utilizada no tratamento de distúrbios hepáticos, como é
o caso da neutralização da hepatotoxicidade, causada por agentes tóxicos, tais
como paracetamol, galactosamina, halotano e CCl4 (BRITO, 2009).
2.8 Avaliação toxicológica
A grande expansão da medicina tradicional por todo o mundo acontecida nos

últimos dez anos despertou a preocupação das autoridades regulatórias com
relação à utilização dos diferentes recursos oferecidos pela Medicina
Tradicional em cada país, principalmente no que se refere à segurança e
eficácia dos medicamentos fitoterápicos (OECD, 2001).
A principal fonte de guias para regulamentação em âmbito internacional é a
Organização Mundial de Saúde. Dado o caráter multilateral dessa organização,
suas Diretivas não têm força de lei em nenhum país, mas influenciam
fortemente na elaboração das respectivas legislações nacionais. Sendo assim,
a partir de 1991 a OMS elaborou diversas normas técnicas para avaliar os
medicamentos fitoterápicos e a eficácia e a segurança dos mesmos (OMS,
2000)
Apesar da OMS ter contribuído muito na padronização dos procedimentos
utilizados na medicina tradicional, notou-se a necessidade de elaborar uma
nova norma, que forneça informações mais completas a respeito da segurança
e da eficácia na prática da medicina tradicional, um guia para elaborar
metodologias e ensaios pré-clínicos de substâncias químicas.
- 38 -
Quanto à realização de ensaios toxicológicos pré-clínicos de substâncias

químicas, os critérios para realização destes testes estão bem especificados
em diferentes normas, como por exemplo, as normas da Organization for
Economic Cooperation and Development (OECD) – Organização para
Cooperação Econômica e Desenvolvimento, descritos em “Guidelines for
testing of chemicals” (EOCD, 1996). Em relação a fitoterápicos, ainda há
dúvidas a respeito das avaliações mais apropriadas.
Turolla e colaboradores (2006) compilaram os dados dos três principais
documentos de normatização dos ensaios toxicológicos no Brasil e no mundo,
como mostrado no anexo 01.
- 39 -
OBJETIVO
- 40 -
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a composição química, e as atividade antioxidante, antibacteriana,

antiinflamatória e antinociceptiora, além da toxicidade de extratos e frações de
folhas de Spondias sp.
3.2 Objetivos Específicos
1. Determinar a composição química dos extratos vegetais mediante a

caracterização por espectrofotometria em UV, calorimetria exploratória
diferencial (DSC), e por ressonância magnética nuclear do composto
majoritário;
2. Desenvolver e validar método analítico por CLAE-DAD para a identificação
e a quantificação dos compostos fenólicos, segundo a RE nº 899,
possibilitando a padronização dos extratos e frações;
3. Avaliar a atividade antibacteriana do EMS e frações contra cepas de
Enterococcus faecalis ATCC 29212, Klebsiella pneumoniae (amostra
clínica) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC
25922, Salmonella Typhimurium ATCC 14028), Bacillus cereus (amostra
clínica), Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228.
4. Avaliar a capacidade antioxidante in vitro dos extratos vegetais, pelo o
sequestro do radical DPPH;
5. Avaliar a peroxidação lipídica in vivo através da determinação do
Malonildialdéido (SRAT) em homogenato de fígado;
6. Determinar in vivo o conteúdo de glutationa reduzida (GSH) em
homogenato de fígado;
7. Determinar a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD),
glutationa peroxidase (GPx) e catalase (CAT) em homogenato de fígado.
8. Verificar o efeito antinociceptivo do extrato e fração rica em flavonóides em
modelos de nocicepção química e térmica.
- 41 -
9. Avaliar o possível efeito do extrato e fração rica em flavonóides sobre

alodínia mecânica no modelo de neuropatia induzida por CFA a 80% em
camundongos;
10. Investigar o efeito antinoceptivo do extrato e fração rica em flavonóides
frente aos receptores transitórios (TRPA1 e TRPV1);
11. Avaliar a atividade antiinflamatória do extrato e fração rica em flavonóides
no modelo de peritonite induzida pela carragenina;
12. Investigar se no efeito antiinflamatório há restabelecimento do equilíbrio
redox pela determinação de GSH em exudato peritoneal;
13. Investigar se no efeito antiinflamatório há inibição da migração celular em
exudato peritoneal;
14. Avaliar o possível efeito depressor do sistema nervoso central pelo método
de campo aberto (Open Field) em camundongos;
15. Avaliar a toxicidade oral aguda e 28 doses em ratos e ratas.
- 42 -
METODOLOGIA
- 43 -
4 METODOLOGIA
4.1 Material Vegetal
As folhas de Spondias sp. foram coletadas em março de 2010 no horto da

Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola (EBDA), no município de
Itaberaba, estado da Bahia, Brasil (log. 40º 18‟ 14‟‟ O lat. 12º 30‟ 56‟ S), sendo
transportadas, após coleta, para o Núcleo de Pesquisas, da Faculdade de
Tecnologia e Ciências, no município de Salvador, Bahia, Brasil.
Confeccionou-se uma exsicata, identificada pela Prof. Dr. Jomar Gomes

Jardim, e depositada no Herbário da UFRN (voucher nº 10433/03.11)
As folhas foram submetidas à secagem em estufa de circulação de ar (Fanem

modelo 315 SE,Brasil), com a temperatura regulada a 40 °C(± 2,5°C), por 48 h.
Após secagem, as folhas foram trituradas em moinho de Willys (Quimis modelo

MW1420, Brasil), o pó foi submetido à processos de otimização de extração.
4.2 Otimização do Processo Extrativo
As folhas de Spondias sp. foram submetidas a extração utilizando-se métodos

descritos na Farmacopéia Brasileira (2003), com algumas modificações.
Resumidamente, 1 g de massa seca foi macerada em metanol ou etanol (1:5
p/v), em intervalos de 1 – 7 dias, enquanto para a extração aquosa 10 g de
massa seca forma submetidos à decocção com água destilada por 5 min de
fervura (1:5 p/v).
Após extração, os extratos orgânicos foram secos em canhão de ar quente por

2 h sob temperatura controlada de 50 ± 2,5°C. O extrato aquoso foi congelado
- 44 -
a -80°C e, posteriormente, liofilizado. A massa do extrato foi utilizada para

comparação dos métodos extrativos.
4.3 Obtenção do Extrato Metanólico, das frações e

isolado de folhas Spondias sp.
O material pulverizado (700 g), após maceração em metanol (3,5L) durante

sete dias com agitação periódica, foi filtrado e rota-evaporado (ROTACOOL
Labora 3300®, Londres, RU), obtendo-se o extrato metanólico. Este foi
particionado com solventes de polaridade crescente (hexano, clorofórmio e
acetato de etila), e as frações foram secas com canhão de ar quente, conforme
descrito na figura 8.
Figura 8. Esquema do processo de partição do extrato metanólico (EMS) de

Spondias sp. para obtenção das frações semi-purificadas. (adaptado de
CAJUEIRO et. al, 2008)
- 45 -
O precipitado obtido após o processo, denominado fração rica em flavonóides

(FRF), foi submetido à cromatografia em coluna, usando-se Sephadex LH20
como fase estacionária, e metanol a 50% como fase móvel. Vinte frações foram
obtidas, correspondendo as frações 1-5 açucares, e de 7-13 isolado purificado
que foram submetidas à identificação por espectrometria UV, calorimetria
13
exploratória diferencial (DSC) e RMN C e H1. As frações 1-5 e as 7-13 foram
analisadas, respectivamente, no Laboratório de Desenvolvimento de
Medicamentos da UFRN (Natal, RN), e no Laboratório de Fitoquímica da UFPR
(Curitiba, PR).
4.4 Caracterização da Composição Química dos

extratos e isolado
4.4.1 DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓLICOS
O teor de fenóis totais foi determinado por interpolação da absorbância de

amostras contra uma curva de calibração construída com padrões de ácido
gálico (10- 350 μg/mL), utilizando-se o reagente de Folin-Ciocalteau, conforme
o procedimento descrito por GEORGÉ (2005). O resultado foi expresso em mg
de equivalentes de ácido gálico/ g de extrato.
4.4.2 ESPECTROFOTOMETRIA UV
A espectroscopia no UV foi realizada na faixa entre 200 a 450 nm

(Espectrofotômetro Shimadzu®, UV-1601, Tóquio, Japão), conforme a
metodologia de Mabry, Markham e Thomas (1970).
- 46 -
4.4.3 CALORIMETRIA EXPLORATÓRIA DIFERENCIAL (DSC)
As curvas de DSC forma obtidas em calorímetro exploratório diferencial

(Shimadzu®, modelo SD-60, Japão) na faixa de 25 a 400ºC sob atmosfera de
nitrogênio (N2), com fluxo de 50 mL/min e razão de aquecimento de 10ºC/min,
utilizando cadinho de alumínio fechado (sem perfuração) contendo 2,0 mg de
amostra. O calorímetro foi devidamente calibrado, utilizando padrão de índio
(Tfusão=156ºC e ∆H = 28,4 J/g). Este experimento foi realizado no Laboratório
de Desenvolvimento de Medicamentos (LDM), UFRN (Natal, RN).
13
4.4.4 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR C E 1H
Para a RMN de ¹³C e ¹H utilizou-se espectrofotômetro Brucker® modelo

(Alemanha) AC200 em 60 MHz e 300 MHz, respectivamente, realizada no
Laboratório de RMN do Departamento de Química da Universidade Federal do
Paraná.
4.4.5 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO POR

CLAE-DAD
Para o desenvolvimento do método analítico, 10µL de uma solução de 100

µg/mL de cada padrão de compostos fenólicos (ácido gálico, ácido clorogênico,
galato de -(-)epigalocatequina, catequina, rutina, hiperina, quercetina,
apgenina, canferol) foram injetados no cromatógrafo VARIAN mod. ProStar 440
(EUA), com bomba quaternária, detector de arranjo de diodo, e amostrador
automático, utilizando coluna KINETEX C18 (100x4.6 mm, 2.6 µm)
(Phenomenex, EUA).
As soluções utilizadas foram acidificadas para manter os compostos de
interesse na forma molecular. Para tanto, foi usada a fase móvel acidificada
com 0,1% de ácido fórmico e acetonitrila, utilizando-se gradiente de eluição
- 47 -
linear exploratório de 5-50% e 5-25% em 25 min. Após a obtenção dos

primeiros cromatogramas, alterações foram realizadas visando melhorar a
eluição dos padrões e dos compostos do EMS. O gradiente estabelecido é
descrito na tabela 3.
Tabela 03. Esquema do gradiente de eluição estabelecido para separação dos

compostos fenólicos.
Tempo (min) ACN (%) Observações
0-3 5 Isocrático
3-7 520 aumento linear
7-9 20 Isocrático
10-15 23 Isocrático
19-20 505 retorno as condições iniciais
O método cromatográfico selecionado foi validado, conforme a resolução 899,

de 2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
Por ser um método de quantificação de substâncias ativas, o método analítico

em questão pode ser classificado como pertencente à categoria 1 da RE 899
da ANVISA (2003), para a qual se exige a avaliação dos seguintes parâmetros:
especificidade e seletividade, linearidade, intervalo de confiança, precisão e
exatidão. No entanto, para realização de um estudo mais completo, os limites
de detecção e quantificação também foram determinados. Todas as avaliações
foram realizadas utilizando o método de adição de padrão, e foram levados em
consideração os limites preconizados pela ANVISA para métodos bioanalíticos.
Especificidade e seletividade: Com o auxílio do detector de arranjo de diodos

(DAD), foi analisada a solução padrão contendo os marcadores estudados e a
amostra de EMS. Os perfis espectrais dos picos das substâncias isoladas
foram comparados com aqueles observados nos picos relativos ao tempo de
retenção destes analitos nas amostras. A pureza foi avaliada a partir do
percentual de similaridade entre os perfis espectrais obtidos, processados pelo
software Galaxie®, e esquematizados em forma de gráfico, onde: o verde, para
similaridade acima de 98%, o amarelo, para similaridade entra 80-98%, e o
vermelho, para similaridade inferior à 80%.
- 48 -
Linearidade: a curva-padrão para os nove compostos fenólicos avaliados foi

obtida injetando seis pontos para cada composto em triplicata. A linearidade foi
avaliada pelos critérios de coeficiente de regressão, análise de ANOVA, limites
de confiança para os coeficientes angular e linear, erro sistemático constante e
analise de resíduos por Durbin-Watson.
Precisão e exatidão: 45 µg/mL dos padrões e 1 mg/mL de EMS em seis

repetições foram injetados, determinado a exatidão e precisão intra-corrida. Um
desvio padrão relativo (DPR) ≤ 5% e percentual de recuperação ≥ 98% forma
considerados aceitáveis.
LOD e LOQ: Os limites de detecção e de quantificação foram obtidos a partir

da análise de regressão da curva de calibração de soluções com
concentrações reduzidas dos compostos de interesse. Sendo assim, para
determinar o limite de detecção, tem-se: LOD=Desvio padrão do intercepto
com o Y x 3/inclinação da curva, já para limite de quantificação, tem-se:
LOQ=Desvio padrão do intercepto com o Y x 10/inclinação da curva.
4.5 Determinação da capacidade antioxidante in vitro
4.5.1 CAPACIDADE DE SEQUESTRO DE RADICAIS LIVRES PELO TESTE

DO DPPH
O sequestro de radicais livres (SRL) foi avaliado pelo método do DPPH,

baseado no descoramento de uma solução de DPPH (cor violeta) que ao ceder
um átomo de hidrogênio estabiliza o oxidante (CUENDET et al., 1997).
Resumidamente, 3,9 mL de DPPH 60µM em etanol foram misturados com 0,1
mL de amostras e padrões (em várias concentrações). A reação foi incubada
no escuro à temperatura ambiente durante 30 min e a absorbância medida a
515 nm (Shimadzu, modelo UV1650, Japão). Quercetina, C. marianus e
hidroxitolueno butilado (BHT) forma utilizados como controles positivos. As
análises foram realizadas em triplicata e os resultados expressos em %SRL,
conforme a equação: (AC ─ Aam)
% SRL = x 100
AC
onde AC = Abs do controle (DPPH sem substância-teste); Aam = Abs da solução
teste após 30 min.
- 49 -
4.6 DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE

in vivo
4.6.1 ANIMAIS
Ratas “Wistar” (160-200 g) foram utilizadas, mantendo-as sob condições

controladas de temperatura (22 + 3ºC) e fotoperíodo de 12h, com água e ração
ad libitum. A utilização dos animais foi aprovada pelo Comitê de Ética de
Pesquisas em Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal,
(protocolo nº029/2011 (CEUA/UFRN), e sua manipulação conduzida conforme
recomendações o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
4.6.2 DESENHO EXPERIMENTAL
Para o desenvolvimento do trabalho, foram utilizados 35 animais divididos em

sete grupos de cinco animais cada, conforme descrito a seguir:
• Grupo 1: grupo controle (1mL/kg i.p. de veículo).

• Grupo 2: toxicante CCl4 (2mL/kg i.p. dose única).
• Grupo 3: CCl4 + Legalon® 7 dias (50 mg/kg p.o.).
• Grupo 4: CCl4 + EMS 7 dias (500 mg/kg p.o.).
• Grupo 5: CCl4 + FRF 7 dias (25 mg/kg p.o.).
Com exceção do grupo 1, os animais dos outros grupos receberam uma dose
única de CCl4 (2mL/kg i.p), diluído em veículo (óleo de milho, 50%, v/v). Após
24 h de indução de dano hepático com CCl4, foi iniciada a administração oral
do extrato (EMS), fração rica em flavonóide (FRF) e do Legalon® (controle
antioxidante). Os animais foram sacrificados 24 h após o término da
administração do extrato (BRITO, 2009).
- 50 -
4.6.3 AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA
A determinação atividade enzimática de aspartato aminotransferase (AST),

alanina aminotransferase (ALT), e de bilirrubina total (BT) foi realizada
utilizando-se os Kits Labtest® pelo método Cinético de UV-IFCC (Analisador
PlennoMax - Plenno®, Brasil).
4.6.4 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
Os animais foram anestesiados com tiopental (40 mg/kg) e, em seguida, o

sangue (6 mL) foi coletado por punção cardíaca. Após a eutanásia por
deslocamento cervical, os fígados foram retirados para posteriores análises. O
soro foi utilizado para determinação dos parâmetros bioquímicos.
4.6.5 PREPARO DO HOMOGENATO DE FÍGADO
O fígado dos animais, retirado cirurgicamente, foi pesado e homogeneizado

(homogenizador tipo Potter-Elvehjem, Marconi, Brasil) em tampão fosfato de
potássio 0,05M pH 7,0, numa proporção de 1,0 g de tecido para 9,0 mL de
tampão.
O homogenato foi centrifugado a 827g/4ºC/4min (IEC Multi RF - Thermo

Electron Corporation®, USA). O sobrenadante obtido foi utilizado para avaliar a
peroxidação lipídica, além da determinação dos parâmetros antioxidante
(atividade das enzimas, CAT, SOD, GPx e conteúdo de GSH).
- 51 -
4.6.5.1Determinação de substâncias reativas com o ácido tiobarbitúrico (SRAT)
Alíquotas de 1mL de homogenato foram transferidas para tubos de centrífuga e

após a adição de 1 mL de TCA a 12%, foram centrifugadas a 827g/4ºC/4min
(IEC Multi RF, Thermo, EUA). Uma alíquota de 1 mL do sobrenadante foi
transferida para um tubo de ensaio, após adição de 1mL de TBA a 0,67%, os
tubos foram incubados, sucessivamente, em banho de água a 100ºC, em
banho de gelo e à temperatura ambiente, durante 20 min cada, antes da
determinação a 535 nm (YAGI, 1982).
4.6.5.2 Determinação do conteúdo de glutationa reduzida (GSH).
A determinação se fundamenta na redução do ácido 5,5‟ditiobis, 2-

nitrobenzóico (DTNB) com GSH, formando o ânion tiolato (TNB) de cor
amarela, estável por algumas horas sob refrigeração. Para isto, 400 µL do
sobrenadante se adicionaram a um tubo contendo 1,6 mL de tampão fosfato de
potássio 0,2 M pH 8,0, seguido da adição de 200 µL de DTNB 2,525 mM. Após
homogeneização, a leitura a 412 nm foi feita em um tempo máximo de 2 min
(BEUTLER et al., 1963).
4.6.5.3 Determinação da atividade da CAT
A atividade da CAT (E.C.1.11.1.6) foi determinada a 620 nm e expressa como

µmoles de H2O2/min/mg proteína, em uma reação constituída por 1 mL de
tampão fosfato 10 mM pH 7, 100 µL do sobrenadante (homogenato do tecido) e
400 µL de H2O2 2 mM. (BEUTLER et al. 1963).
4.6.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Fragmentos de fígado foram fixados em formol tamponado neutro a 10%,

embebidos em parafina e seccionados a 5-6 µm, e corados com hematoxilina e
eosina (H&E) para avaliar as alterações morfológicas hepáticas em animais
intoxicados com CCl4 e tratados com os extratos (BRITO, 2009).
- 52 -
4.7 Ensaios Antimicrobianos
4.7.1 DIFUSÃO EM ÁGAR
A atividade antibacteriana do extrato e das frações foi avaliada pelo método de

difusão em gel, adaptado de Romeiro (2001), utilizando-se os microorganismos
de Enterococcus faecalis ATCC 29212, Klebsiella pneumoniae (amostra
clínica), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922,
Salmonella Typhimurium ATCC 14028.
Resumidamente, discos impregnados com amostras em estudo foram
colocados em meio específico com um microorganismo inoculado para a
difusão da substância impregnada no disco para o meio de cultura teste. A
comprovação de atividade antibacteriana é detectada através da formação de
um halo de inibição ao redor do disco impregnado com a amostra em estudo.
4.7.1.1 Preparo das Amostras

As amostras utilizadas foram os extratos e as frações de Spondias sp. A
concentração da amostra testada foi de 1000μg, obtida de uma solução
estoque de 50mg/mL para cada amostra. O extrato bruto e as frações
clorofórmio, acetato de etila e FRF foram solubilizadas em metanol, enquanto a
hexânica em DMSO 2% (DIAS, 2005). Cada disco foi impregnado com 20 μL
da solução inicial, enquanto os discos controle foram impregnados apenas com
metanol e DMSO 2%. Após, este procedimento os discos foram submetidos a
secagem.
4.7.1.2 Meio de Cultura

O meio de cultura ágar Mueller-Hinton foi preparado conforme instruções do
fabricante (MERCK). Após esterilização, o meio foi distribuído em placas de
Petri estéreis. A escolha deste meio obedece ao fato de, embora não
enriquecido, ser o suficientemente nutritivo para permitir o desenvolvimento de
- 53 -
colônias bacterianas, além de ser largamente utilizado para testes com

bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas.
4.7.1.3 Preparo do Inóculo

Os microorganismos Enterococcus faecalis ATCC 29212, Klebsiella
pneumoniae (amostra clínica) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella Typhimurium ATCC 14028 foram
repicados em caldo tríptico de soja e incubadas à 35ºC por 24 h.
Resumidamente, culturas recentes de cada bactéria foram diluídas em 5mL de
salina estéril comparando-se com a turbidez do tubo número 0,5 da escala de
Mac Farland (0,5mL de cloreto de bário a 1% em 9,5mL de ácido sulfúrico a
1%) visando obter a concentração de 1.5 x 10 6bactérias/mL. A inoculação foi
realizada com auxílio de swab estéril em câmara de fluxo laminar.
4.7.1.4 Teste de atividade antibacteriana
Em cada placa inoculada foram distribuídos seis discos de papel impregnados,

dois discos de cada amostra (1000μg), além de um disco impregnado com o
solvente corresponde e um disco de controle positivo com cloranfenicol (30μg).
Após incubação em estufa a 35°C por 24 h, foi feito a medição dos hlaos de
inibição, quando presentes, com auxílio de régua.
- 54 -
4.8 Avaliação da atividade antinociceptiva e

antiinflamatória
4.8.1 NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA INJEÇÃO INTRAPLANTAR DE

FORMALINA EM CAMUNDONGOS
As avaliações da atividade antiinflamatória e antinociceptiva foram realizadas

em camundongos Balb-c, fornecidos pelo Biotério Central do TECPAR
(Curitiba, PR).
Para a avaliação por este modelo, os animais foram pré-tratados com veículo
(Controle: salina, 0,1 ml/10 g) ou EMS (30-1000 mg/kg) e FRF (3-100 mg/kg)
por via oral, e após 30 min foi intraplantarmente injetado um volume de 20 μL
de formalina a 2,5% na superfície ventral da pata direita do animal. A resposta
nociceptiva (lambida e/ou mordida da pata) foi observada em um período de
tempo de 0-5 min (fase neurogênica) e de 15-30 min (fase inflamatória) após a
injeção da formalina.
4.8.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LOCOMOTORA ESPONTÂNEA
Para excluir a possibilidade de prejuízo no desempenho motor dos animais

após o tratamento com a substância, se avaliou a atividade locomotora
espontânea no campo aberto. Este teste é realizado em uma caixa de madeira
(40 x 60 x 50 cm) cujo fundo é dividido em 12 quadrados (MEOTTI et al., 2006).
Para isto, 30 min antes de serem colocados individualmente nessa arena, os
camundongos foram tratados com o veículo (salina, 0,1 ml/10 g, i.p.) ou EMS
(300 e 1000 mg/kg, v.o.) e FRF (3 a 100 mg/kg, v.o.). O período de observação
na arena foi de 6 min, sendo contado o número de quadrados cruzados com
todas as patas.
- 55 -
4.8.3 Peritonite induzida por carragenina
A carragenina foi utilizada para produzir uma resposta inflamatória aguda na

cavidade peritoneal em camundongos após 4 h, com um grande número de
leucócitos no exudato e indução de estresse oxidativo. Os animais foram pré-
tratados por via oral com o veículo (Controle: salina, 0,1 ml/10 g), ou com EMS
(300mg/kg) ou com FRF (3, 10 e 30 mg/kg) 30 min antes da injeção de
carragenina (750 μg/cavidade) na cavidade peritoneal. O grupo controle
recebeu apenas a injeção de salina (0,1 ml/10 g) no peritônio. Após 4h da
indução da peritonite, os animais submetidos à eutanásia por inalação de CO2
e a cavidade peritoneal foi lavada com 1 mL de solução salina heparinizada (20
UI/mL), antes da coleta do líquido peritoneal a ser utilizado para posterior
análise (PAGANO et al., 2002).
4.8.3.1 Contagem dos leucócitos peritoneais
O fluído peritoneal foi diluído com líquido de Türk (1:20) e a contagem de

leucócitos totais realizada em câmara de Neubauer. Uma alíquota do exsudato
foi citocentrifugado (citocentrífuga Cytospin Tharmac, Alemanha) e corado com
May-Grünwald Giemsa para efetuar a contagem diferencial de leucócitos
(MONTANHER et al., 2007).
4.8.3.2 Avaliação do conteúdo de GSH em exudato peritoneal
A determinação foi feita conforme descrito por BEUTLER et al. (1963).

Resumidamente, a um tubo contendo 1,6 mL de tampão fosfato de potássio 0,2
M pH 8,0 se adicionaram 400 µL do liquido peritoneal, acrescentado-se 200 µL
de DTNB 2,525 mM. Após homogeneização, a leitura foi efetuada a 412 nm
(espectrofotômentro VARIAN, EUA), num tempo máximo de 2 min.
4.8.4 Alodínia mecânica induzida pelo Adjuvante Completo de Freud

(CFA)
O modelo de alodínia mecânica persistente causada pela injeção intraplantar

de 20 μl de solução do adjuvante completo de Freund (CFA) foi utilizado para
avaliar o possível efeito anti-alodínico do EMS e da FRF, evidenciando
- 56 -
atividade antiinflamatória em um dado período de tempo. Os camundongos

foram colocados em caixas de acrílico transparente sobre uma plataforma com
fundo de tela de arame durante 2 h para a aclimatização, sendo a reatividade
basal ou a alodínia mecânica avaliadas pelo contato da pata traseira com
filamentos de von Frey (Stoelting, Chicago, EUA), segundo o método de up and
down.
Este método foi padronizado para medir (em mg) o limiar da alodínia mecânica
de cada camundongo, conforme a metodologia descrita por Chaplan et al
(2000). Após a aclimatização dos animais, se utilizaram uma série de
filamentos de 0,008 a 6,0 g, aplicados em ordem crescente ou decrescente
para determinar 50% do limiar de retirada da pata (limiar 50%). O primeiro
filamento da série testado foi o de 0,4 g na pata posterior direita, sendo
realizadas 6 avaliações em intervalos de 10 s. A ausência de resposta indicava
a utilização de um filamento de maior massa e assim sucessivamente. Com a
retirada ou lambida da pata pelo animal, um filamento de menor massa foi
aplicado em intervalos de 2 min. O limiar de retirada da pata (50% do limiar) foi
calculado segundo a fórmula de Dixon. No dia anterior à aplicação de CFA, foi
avaliada aresposta basal de todos os animais. Após 24 h da injeção do CFA,
verificou-se o aparecimento da alodínia mecânica e os animais foram avaliados
0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 e 12 h após o tratamento com 300 mg/kg EMS, e 30 mg/kg
de FRF, além do veículo (decurso temporal). Nos dias subsequentes, a
avaliação foi realizada 2 h após o tratamento, sendo que no 2° e 3° dias, todos
os grupos foram avaliados quanto a reatividade ao calor e ao frio. Entre o 6º e
9º dias, não se efetuou nenhum tratamento, visando a reversão de um possível
efeito de tolerância.
4.8.4.1 Nocicepção induzida pelo estímulo térmico
Os animais foram submetidos a testes de placa quente para avaliar o possível

efeito antinociceptivo da FRF sobre as respostas nociceptivas induzidas pelo
calor nocivo (placa quente) e a sensibilidade ao frio (teste de acetona).
O teste de placa quente foi realizado como descrito por Woolfe e MacDonald
(1944) com algumas modificações, utilizando um aparato que compreende uma
superfície metálica a 50 ± 1°C, circundada por um cilindro transparente (24 cm
de diâmetro, Ugo Basile, modelo DS37). Cada animal foi colocado
- 57 -
individualmente dentro do cilindro, cronomentrando-se o tempo no qual o

animal sacudiu ou lambeu a pata ou pulou. Isto foi marcado como índice de
latência de resposta térmica.
Os animais controle e tratados intraplantarmente com CFA a 80% foram pré-
testados para se obter o valor de latência basal. Um tempo de corte de 30 s foi
utilizado para minimizar danos ao tecido. Após 30 min, os animais foram
tratados com o veículo (Controle: salina, 0,1 ml/10 g, v.o.), ou FRF (30 mg/kg,
v.o.). O teste foi realizado após 30 min. O tempo de permanência dos animais
foi convertido em percentuais, através da fórmula:
Onde: porcentagem máxima de efeito (PME%), corresponde a diferença entre

o tempo final (TF) e o tempo basal (TB), dividido pela diferença entre o TB e o
limite máximo de exposição (30 s), vezes 100.
4.9 Ensaios toxicológicos
A dose da toxicidade aguda foi de 2000 mg/kg, administrada por gavage a seis
ratos de ambos os sexos pela manhã; ocorrendo óbitos abaixo de 50% de até o
14º dia, outros seis animais seriam tratados com dose maior. Se o número de
óbitos fosse superior a 50%, doses sequenciais menores seriam utilizadas até
obter a DL50. A dose selecionada para avaliação da toxicidade 28 doses
repetidas foi 500 mg/kg. Sendo os animais observados por 28 dias (OECD,
1996; ANVISA, 2004) O peso, o consumo de água e de ração, além das
alterações comportamentais foram observados e registrados diariamente. Os
parâmetros hematológicos analisados foram hemoglobina, hematócrito,
contagem total e diferencial de leucócitos, plaquetas. Como marcadores da
função hepática foram avaliados as enzimas ALT, AST, γ-GT e a fosfatase
alcalina. A creatinina, uréia, proteínas totais, albumina foram determinadas
para a avaliação renal. Colesterol total, triglicérides, e a glicemia foram também
analisados. Os animais foram eutanasiados ao término do período
- 58 -
experimental. Fígado, rins e baço foram retirados para avaliações

macroscópicas e pesos relativos. Amostras desses órgãos e de pulmão,
coração, intestino, estômago, esôfago e cérebro foram retirados para exame
histopatológico.
4.10 Análise estatística
Todos os valores, expressos como média  SD, foram estatisticamente

calculados pela análise de variância (ANOVA) e post-hoc test de Tukey-
Kramer, utilizando o Graph Pad Software versão 5.0. p < 0,05 foi considerado
estatisticamente significativo.
- 59 -
RESULTADOS E DISCUSSÃO
- 60 -
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O bioma Caatinga é um complexo vegetacional com características peculiares
e variações fisionômicas dos seus componentes herbários (RATTER et al.,
1992), e apesar de sua elevada biodiversidade, pouco tem sido feito em termos
de valorizar sua conservação. A caatinga brasileira é considerada um dos 25
ecossistemas do planeta, e muitas destas plantas encontradas nesse
ecossistema são utilizados na medicina natural.
Entretanto, as preparações fitoterápicas carecem de um rígido controle de

qualidade. A tradição no emprego de plantas facilita a aquisição; fator que
contribui para o uso indiscriminado. Estudos científicos indicam que muitas
espécies podem apresentar substâncias tóxicas e/ou composição química
variável. Além disto, muitas espécies estão ameaçadas de extinção; sendo de
extrema importância a preservação do bioma nordestino, que apresenta
características únicas (RATTER et al., 1992).
5.1 Otimização do Processo Extrativo
Os métodos os quais as partes aéreas de Spondias sp. foram submetidas para

extração, com algumas modificações, estão descritos na Farmacopéia
Brasileira (2003),
Como mostrado na figura 9, os solventes orgânicos utilizados se saturam entre

48h (MetOH) a 72 h (EtOH), demonstrando a necessidade de extrações
consecutivas até exaustão do material vegetal, sendo o metanol (131,05±0,52
mg/g m.s.) o solvente mais extrativo frente ao etanol (82,68±0,52 mg/g m.s.),
devido a sua característica anfipática, portanto, o melhor solvente para
substâncias polares e apolares.
- 61 -
Figura 9 – Teor extrativo total obtido por maceração durate intervalos de

tempo de 1 à 7 dias de um grama de massa seca vegetal em etanol (EtOH,
linha inferior) ou metanol (MetOH, linha inferior) na proporção 1:5.
5.2 Caracterização da composição química
Spondias sp., objeto deste estudo, contém diversos grupos de substâncias

químicas. Taninos, lactonas, terpenóides (sesquiterpenos e monoterpenos),
flavonóides são algums desses grupos de substâncias já detectadas e isoladas
que ocorrem em outras espécies do gênero Spondias. (MENDES & ELISALDO,
2007; TALHOUK et al., 2007).
No caso específico do fruto do cajá-umbu, estudos fitoquímicos indicaram a

presença de altos teores de vitamina C e glicídios, sendo, de maneira geral,
uma fonte natural de antioxidante (ALMEIDA, 2000).
Araujo-Silva (2009) ao avaliarem a fitoquímica dos extratos e frações de folhas

de Spondias sp. determinaram a marcada presença de composto de natureza
fenólica (taninos, flavonóides, saponinas); os quais são conhecidos por
apresentarem capacidade antioxidante e propriedades antiinflamatórias
(ESQUENAZI et al., 2002; GUTAM & JACHAK, 2009).
Assim, essas substâncias podem ser responsáveis, de maneira total ou parcial,

pelas atividades biológicas dos extratos brutos e das frações obtidos do extrato
metanólico.
- 62 -
5.2.1 CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓLICOS
A concentração de polifenólicos totais foi determinada pelo método de Folin-

Ciocalteau, conforme o procedimento descrito por GEORGÉ et al. (2005),
obtendo uma concentração em equivalente de acido gálico consideravelmente
maior para o extrato metanólico (12,08±1,20 mg de Eag/100 mg de extrato) em
comparação ao extrato aquoso (6,90±0,47 mg de Eag/100 mg de extrato) e
extrato etanólico (8,12±0,22 mg de Eag/100 mg de extrato).
5.2.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DO COMPOSTO MAJORITÁRIO
Após a maceração das folhas de Spondias sp. em metanol por 3 dias, para
obtenção do extrato bruto, foi rotaevaporado, após seco foram fracionado por
solventes de polaridade crescente, obtendo-se as frações hexânica,
cloroformica, acetato de etila e precipitado (Fração rica em Flavonoides). A
Fração rica em Flavonoides (FRF), foi fracionada em coluna de Sephadex
LH20, isolando o composto majoritário, um sólido amorfo de coloração
amarelada, com ponto de fusão de 181ºC (170-187ºC) e entalpia de -110ºC,
por calorimetria diferecial exploratória. O sresultados obtidos estão de acordo
com o mostrado na inclução de rutina em complexo sacarídeos (SRI et al.,
2007) (Figura 10).
Figura 10. Gráfico de calorimetria exploratória diferencial (DSC) do padrão de

rutina e do composto isolado. A rutina padrão (linha superior) e o composto
isolado (linha inferior) apresentaram pontos de fusão de 177 ºC (166 -184ºC);
181ºC (170-187ºC) e entalpias de -98ºC e -110ºC, respectivamente.
- 63 -
Os espectros de UV para flavonóides, em MeOH, exibem duas bandas de

maior absorção na região de 240-400 nm. A banda I absorve entre 300- 380
nm e a banda II entre 240-280 nm. A banda I se refere ao anel B (cinamoil) e a
banda II representa o anel A (benzoil).
Os espectros de UV obtidos de acordo com Mabry, Markham e Thomas (1970),

são apresentados na figura 11. O composto isolado, em metanol (Fig. 11A),
apresentou bandas (λmax) em 398 nm, referentes ao anel B, e em 263 nm,
referentes ao anel A. Valores próximos aos apresentado pelo padrão de rutina,
398 nm e 266 nm (Fig.11D).
A presença de AlCl3 forma complexos estáveis com compostos que têm grupos
hidroxila em C-3 ou C-5, e complexos menos estáveis (lábeis) com grupos
ortodiidroxila. O complexo formado com os grupos ortodiidroxila decompõe-se
rapidamente, mas a complexação com o grupamento cetona na posição 4 e o
grupo 5-hidroxila formam um complexo estável na presença do ácido HCl. Com
adição de HCl ocorre um deslocamento hipsocrômico da banda I (30-40nm)
devido à decomposição do complexo com o grupo ortodiidroxila, verificando-se
assim a presença deste grupo no anel B. Ainda com HCl na presença de AlCl3
é possível verificar a presença dos grupos 3 e/ou 5-hidroxila. Espectros de
substâncias com esses grupamentos apresentam a banda I com deslocamento
batocrômico em relação ao espectro com MeOH; para 3,5-hidroxiflavonas esse
deslocamento é em torno de 50-60nm, para 5-hidroxiflavonas com a posição 3
substituída é de 35-55nm, e já para 3- hidroxiflavonas em torno de 60nm.
O espectro original em MeOH do composto isolado apresentou bandas em

(λmax) 355, 257 e 267(ombro), características das bandas I e II de flavonóides.
A banda I relativa ao anel B sofreu um deslocamento hipsocrômico de 18 nm
em relação à quercetina este efeito é devido à substituição em C-3 (SANTOS,
SCHRIPSEMA e KUSTER, 2005; KALEGARI, 2009).
O espectro com AlCl3 revelou bandas em (λmax) 436, 303(ombro) e 275nm,

deslocamento batocrômico das duas bandas, sugerindo a presença de sistema
ortodiidroxila e hidroxila em C-5. A adição de HCl deslocou estas bandas para
(λmax) 400, e 270nm. Esse deslocamento hipsocrômico, na presença de HCl
em relação ao espectro com AlCl3, da banda I confirma a presença
- 64 -
ortodiidroxila no anel B. Em relação ao espectro original em metanol o

deslocamento batocrômico da banda I foi de 45nm, referente a presença do
grupamento 5-hidroxila com a posição 3 substituída. Identificando a aglicona
como um flavonol-3-O glicosilado, com hidroxilas no anel B substituídas em 3‟ e
4‟, caracterizada como quercetina.
Os deslocamentos químicos de RMN C e 1H foram obtidos com solvente

13
metanol à 60 e 300 MHz, respectivamente. Os espectros de RMN-13C

revelaram a presença dos 15 carbonos características da estrutura básica dos
flavonóides e mais 11 carbonos entre 60 e 105 ppm, região característica de
açúcar, referentes a duas unidade de açúcar, sendo duas hexoses, uma
glicose e outra ramnose, caracterizada pelo CH3 com deslocamento de 17 ppm,
totalizando uma estrutura com 27 carbonos. No espectro de RMN-1H foram
observados os deslocamentos na região de 6-8 ppm referentes aos anéis
aromáticos de flavonóides, além de deslocamentos na região de 3-4,6 ppm,
característicos de açúcares, confirmando assim a presença de duas unidades
de açúcares.
Figura 11. Espectros de UV, varredura de 200 – 500 nm, do composto isolado
(A), composto isolado + AlCl3 (B), composto isolado + AlCl3 + HCl (C), rutina
padrão (D), rutina padrão + AlCl3 (E) e rutina padrão + AlCl3 + HCl (F).
- 65 -
Os deslocamentos de RMN-13C e os hidrogênios em δ 6,9 (H5‟), δ 7,5 (H2‟), δ

7,4 (H6‟), correspondentes ao anel B, e os hidrogênios em δ 6,2 (H6) e δ 6,38
(H8) correspondentes ao anel A, evidenciam que o composto é um derivado da
quercetina. A localização do glicosídeo é dada pelo deslocamento, em relação
ao espectro da quercetina, observado em C-3 e C-2. Neste composto C-3 está
protegido em torno de 3 ppm e C-2 foi desprotegido em torno de 10ppm,
deslocamento que só pode ocorrer com a presença de uma substituição em C-
3, comprovando assim a presença da unidade de açúcar nesta posição.
Tabela 04. Deslocamentos Quimicos (ppm) de RMN-13C e RMN-1H do

composto isolado, padrão rutina e lituratura.
Experimental Padrão (Rutina) HENEIDAK 2009

Posição 13 1 13 1 13 1
C H J (Hz) C H J(Hz) C H J(Hz)
2 158.50 - - 158.46 - - 156.5 - -
3 135.62 - - 138.17 - - 133.2 - -
4 179.42 - - 174.23 - - 177.3 - -
5 162.94 - - 162.90 - - 161.2 - -
6 100.00 6.20 d 2.0 99.95 6.20 d 2.0 98.7 6.2 d 2.1
7 166.04 - - 166.00 - - 164.5 - -
8 94.92 6.40 d 2.0 94.87 6.40 d 2.0 93.6 6.4 d 2.1
9 159.37 - - - - - 156.4 - -
10 105.64 - - 104.71 - - 103.7 - -
1‟ 123.12 - - 123.09 - - 121.5 - -
2‟ 117.72 7.66 2.0 116.05 7.67 d 2.0 116.2 7.53 d 2.0
3‟ 149.82 - - 149.78 - - 115.2 - -
4‟ 145.84 - - 143.09 - - 148.5 - -
5‟ 116.10 6.85 d 8.2 116.20 6.87 d 8.2 115.2 6.83 d 9.0
6‟ 123.59 7.63 dd 2.0 8.0 123.56 7.64 dd 2.0 8.0 121.0 7.75 dd 2.4 7.8
Glicose
1‟‟ 104.6 5.10 d 7.4 103.91 5.11 d 7.4 101.2 5.44 d 7.2
2‟‟ 73.95 - - 73.91 - - 75.8 - -
3‟‟ 78.17 - - 78.15 - - 74.0 - -
4‟‟ 71.41 - - 71.36 - - 69.9 - -
5‟‟ 75.74 - - 75.71 - - 76.4 - -
6‟‟ 68.57 - - 66.50 - - 66.9 - -
Ramnose
1‟‟‟ 102.43 4.52 d 1.10 102.39 4.52 d 1.10 100.7 4.38 d 1
2‟‟‟ 72.26 - - 72.21 - - 70.5 - -
3‟‟‟ 72.11 - - 72.08 - - 70.3 - -
4‟‟‟ 73.94 - - 73.92 - - 71.8 - -
5‟‟‟ 69.73 - - 69.70 - - 68.2 - -
6‟‟‟ 17.90 1.10 d 6.20 17.89 1.11 d 6.20 17.6 0.99 d 6.0
Nota: d=dubleto, dd=duplo dubleto, J=constante de acoplamento
Os dados de RMN-13C são de grande valia na determinação da estrutura de um

flavonóide glicosilado, pois a partir destes dados é possível estabelecer o
número de açúcares ligados, a natureza dos mesmos, assim como a posição,
configuração e conformação (AGRAWAL 1989). A identificação do açúcar do
- 66 -
composto isolado foi baseada por comparação com os espectros obtidos com o
padrão de rutina e espectros da literatura e foi definido como rutosideo (uma
unidade de glicose, outra de ramnose) (Tabela 04). O experimento DEPT
revelou a presença de apenas um CH2 68.57 ppm, característico de glicosídeo.
Os resultados obtidos foram comparados com dados da literatura. O composto

isolado e identificado como quercetina-3-O-rutosídeo (Rutina) é inédito para a
espécie em estudo ao se revisar a literatura (Figura 12).
Figura 12. Estrutura química da rutina
A rutina é um flavonóide amplamente distribuído no reino vegetal, com elevada

capacidade antioxidante na remoção de radicais livres, exercendo assim um
papel citoprotetor. Além desta atividade este flavonóide apresenta atividade
antiinflamatória, imunomoduladora e antitumoral (BÜRGER, 2008).
5.3 Desenvolvimento de método analítico por

Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE-DAD)
5.3.1 ESPECTROS DE VARREDURA PARA OS PADRÕES
A varredura por espectrofotometria na região do UV (200-400 nm) permitiu a

visualização dos comprimentos de onda com maior absorção e assim uma
melhor resposta de sinal cromatográfico. (figura 13).
- 67 -
Figura 13. Varredura espectral em 2D e 1D dos padrões (1) Acido Galico, (2)
Ácido Clorogênico, (3) Catequina, (4) Galato de -(-) epigalocatequina, (5)
Rutina, (6) Hiperina, (7) Quercetina, (8) Apigenina e (9) Canferol.
- 68 -
5.3.2 ANÁLISE DOS PADRÕES DURANTE O GRADIENTE EXPLORATÓRIO
Nove padrões na concentração de 100 µg/mL foram inicialmente injetados (10

µL) em corrida cromatográfica na qual a fase móvel eluia de forma exploratória
(5 – 50% e 5 – 25% de fase B em 30 min), procurando a melhor separação dos
sinais cromatográficos, levando em consideração a porcetagem de fase B onde
encontrava-se a eluição e o tempo de retenção dos compostos. A fase A foi
constituída por água acidificada (pH 3,0, com ácido fórmico) e a fase B
acetonitrila, o fluxo utilizado foi 1,0 mL/min em temperatura ambiente. A leitura
foi realizada em 254 nm, considerado comprimento de onda de caráter
universal (KAN, 2007).(figura 14).
Figura 14. Análises cromatográficas exploratórias dos nove padrões, eluição

de 5-50% (superior) e 5-25% (inferior) de fase B, fluxo de 1 mL/min, volume de
injeção de 10 µL e detecção em 254 nm. Fase A:água acidificada, pH 3,0,
acido formico e Fase B: Acetonitrila.
- 69 -
Após a obtenção dos tempos de retenção e porcetagem de Fase A e Fase B

ideais para a eluição dos nove compostos de interesse, ajustes foram
realizados a fim de melhorar a resolução dos picos e diminuir o tempo de
análise. Com isso, foi obtido o gradiente exploratório, conforme mostrado na
tabela 3, com fluxo de 1,3 mL/min. O comprimento de onda em que a maior
parte dos compostos se apresentaram com máximos de absorção, foi 280 nm.
O volume de injeção foi corrigido para 9 µL, para minimizar a cauda frontal
identificada nos sinais 2, 3 e 4, como mostrado na figura 14. Desta maneira se
obteve o perfil cromatográfico dos nove padrões, que posteriormente foram
injetados individualmente para sua identificação, e injetados conjuntamente
com o extrato bruto para obtenção dos parâmetros de seletividade (Figura 15).
Coluna C18, 100x4,6 mm; 2,6 µm; Fase A = 0,1%

ácido fórmico; Fase B = Acetonitrila; Fluxo de 1,3 mL/min ;
Volume de injeção 9 µL; e comprimento de onda 280 nm,
em temperatura ambiente.
Figura 15. Análise cromatográfica dos nove padrões adicionados ao extrato

bruto de Spondias sp. , eluição por gradiente, fluxo de 1,3 mL/min, volume de
injeção de 9 uL e detecção em 280 nm. Fase A:água acidificada, pH 3,0, acido
formico, e Fase B: Acetonitrila. Sendo: (1) Acido Galico, (2) Ácido Clorogênico,
(3) Catequina, (4) Galato de -(-) epigalocatequina, (5) Rutina, (6) Hiperina, (7)
Quercetina, (8) Apigenina e (9) Canferol.
- 70 -
5.4 Validação de método analítico por CLAE-DAD

segundo a legislação brasileira
5.4.1 PARÂMETROS ANALÍTICOS DE VALIDAÇÃO
A seletividade foi avaliada através da pureza de pico através da comparação

entre os espectros UV (200-400 nm) obtidos pelo software galaxie ®, de acordo
com a figura 16. Os padrões (200 µg/mL) e EMS (10 mg/mL) 1:1 (v/v) foram
diluidos para obtenção de concentração 100 µg/mL e 5 mg/mL. A injeção foi
efetuadas em triplicata.
Figura 16. Análise de pureza de pico dos nove compostos. Área verde: pura;
área amarela: parcialmente pura e vermelha: impura. Sendo: (1) Acido Galico,
(2) Ácido Clorogênico, (3) catequina, (4) Galato de -(-) epigalocatequina, (5)
Rutina, (6) Hiperina, (7) Quercetina, (8) Apigenina e (9) Canferol.
- 71 -
O método mostrou-se seletivo, podendo distinguir a resposta do analito de

interesse dos demais componentes da amostra.
Através da análise por CLAE com DAD, foi possível verificar que a pureza de
pico e o índice de similaridade dos picos referentes aos marcadores no extrato
foram satisfatórios, quando comparados aos compostos puros. Esses dados
confirmam a ausência de impurezas ou interferentes que poderiam estar
coeluindo com as substâncias de interesse, assegurando que o método
proposto é adequado para a análise dos nove compostos fenólicos em extratos
de Spondias sp.
O teste de linearidade com adição de padrão permitiu avaliar a concordância

da resposta do sistema cromatográfico frente à diferentes concentrações do
analito de interresse, além de determinar a faixa linear de trabalho ou intervalo
de confiança. Nesta análise o método apresentou resposta linear na faixa de
1,5 a 100 µg/mL . As análises de variância dos dados demonstraram que o
método é linear para os nove padrões, conforme os coeficientes linear e
angular apresentados na tabela 5.
A repetibilidade intra-dia, avaliada com seis determinações a 45 μg/mL, foi

executada pelo mesmo analista, no mesmo equipamento e em curto período de
tempo (Tabela 5).
- 72 -
Tabela 5. Ensaios de validação segundo a RE nº 899.
RT Intervalo 2 LOD LOQ DPR % Intra-dia %

Composto a R
(min) (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) (45 ug/mL) (45ug/mL)
Ácido Gálico 1.71 1.5-50 9.2054 0.9945 0.260 0.520 3.96 98.62
Ácido
6.62 1.5-50 9.7922 0.9973 0.345 1.150 3.26 100.03
Clorogênico
Catequina 6.91 1.5-50 5.3171 0.9993 1.354 4.513 2.55 98.47
Galato de -(-)
8.18 1.5-50 8.7029 0.9989 0.834 2.780 3.76 98.76
Epigalocat.
Rutina 9.20 1.81-100 5.3938 0.9976 0.134 0.447 3.71 98.46
Hiperina 9.40 1.81-100 7.2496 0.9995 0.146 0.487 3.79 99.95
Quercetina 16.03 1.5-50 10.379 0.9991 0.329 1.097 3.77 99.96
Apigenina 18.51 1.5-50 10.022 0.9989 0.193 0.643 2.22 98.56
Canferol 18.85 1.5-50 5.443 0.9984 0.070 0.233 2.14 98.32

2
Nota: RT = tempo de retenção; a = coeficiente angular; R = coeficiente linear; LOD = Limite de
detecção; LOQ = Limite de quantificação; DPR % = Desvio padrão relativo.
5.5 Aplicação do método por CLAE no EMS e FRF

A análise cromatográfica do EMS mostrou a presença de 12 picos, como
mostrado na figura 17, que foram comparados aos dos nove padrões, quanto à
similaridade dos espectros de UV e quanto ao tempo de retenção, identificando
o composto. Assim, os sinais 1 (RT=1,43 min) e 2 (RT=1,73 min) foram
classificados como fenólicos simples (C6-C1) por possuirem espectros de UV
similares ao ácido gálico, sendo o composto 2 correspondente à 0,69±0,0012
µg de ácido gálico/mg de EMS. O sinal 3 (RT=6,63 min) correspondeu à
1,34±0,0065 µg de ácido clorogênico/mg de EMS. Os sinais 7, 8 e 9 (RT=
9,23; 10,05 e 12,65 min) corresponderam à flavonóis glicosilados, também
determinados na FRF. O composto 7 correspondeu a 21,63 ± 0,0039 µg de
rutina/mg de EMS e 253,67 ± 0,0023 µg de rutina/mg de FRF. Os sinais 10, 11
- 73 -
e 12 (RT= 15,99; 18,92 e 19,30) corresponderam a flovonóides agliconas. O

sinal 10 e 11, também encontrado na FRF corresponderam a quercetina (2,14
± 0,02 µg de quercetina / mg de EMS; 7,83 ± 0,0034 µg de quercetina / mg de
FRF) e canferol (4,44 ± 0,0046 µg de canferol/mg de EMS; 10,28 ± 0,0089 µg
de canferol/ mg de FRF). Os sinais 4, 5 e 6 (RT = 7,11; 7,90 e 8,73 min) não
apresentaram analogia espectral com nenhum dos padrões utilizados, não
sendo possível classificá-los por esse método.
Figura 17. Análise cromatográfica do extrato bruto de Spondias sp. , eluição

por gradiente, fluxo de 1,3 mL/min, volume de injeção de 9 µL e detecção em
280 nm. Fase A:água acidificada, pH 3,0, acido formico, e Fase B: Acetonitrila.
5.6 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE in vitro
A atividade antioxidante dos extratos e frações das folhas de Spondias sp.

pelos diferentes processos extrativos propostos foi avaliada in vitro pelo
método da redução do radical DPPH•.
O potencial da atividade antioxidante dos extratos foi determinado com base na
capacidade de seqüestrar 50% radical livre de DPPH (IC50). Esta capacidade,
- 74 -
expressa em µg/mL para os padrões e os extratos aquoso, etanolico e EMS, e

as frações, é mostrada na tabela 03.
Os resultados mostraram que os extratos de folhas de Spondias sp. possuem
potencial antioxidante de seqüestrar o DPPH• análogo aos mostrados pelos
antioxidantes de referências. Essa alta capacidade pode ser atribuída à
elevada concentração de polifenóis e flavonóides, que fora evidenciada
experimentalmente. Os resultados estão de acordo com os descritos por BEN
MANSUOR et al. (2011) ao avaliarem a ação antioxidante do extrato de Rhus
pentaphyllum e por HORT et al. (2008) ao estudarem a atividade antioxidante
de Cyathea phalerata Mart. (Cyatheaceae).
Tabela 3. Capacidade sequestradora de 50% dos radicais livres, em µg/mL,

dos padrões e dos extratos aquoso, etanolico e EMS, e frações.
Amostras IC50 (µg/mL)

Extrato aquoso 132,62 ± 0,40
Extrato etanólico 1 dia de maceração 85,45 ± 1,35
2 dia de maceração 68,20 ± 1,25
Extrato metanólico 1 dia de maceração 66,45 ± 1,25
Fração hexânica 180,64 ± 6,11
Fração Cloroformica 152,92 ± 8,99
F. de Acetato de etila 63,12 ± 4,68
Precipitado 27,16 ± 6,64
Fração Residual 461,51 ±114,43
Padrões Cardus Marianus 34,77±1,67
BHT 11,07±0,32
Quercetina 3,34 ± 0,03
Valores em média ± desvio padrão
5.7 Determinação da capacidade antioxidante in vivo

Um dos principais efeitos observados na lesão hepática é o aumento
significativo da atividade enzimática sérica (LEWIS et al., 2006), avaliada
através da determinação da atividade das enzimas AST e ALT, da BT e pelo
exame histopatológico do fígado. A elevação da atividade enzimática e da
concentração da BT indicam a perda da integridade funcional da membrana e
da função do hepatócito, respectivamente (RAJESH & LATHA, 2004).
- 75 -
A ALT, enzima citosólica hepatoespecífica, aumenta imediatamente após a

lesão celular ou a alteração na permeabilidade da membrana celular do
hepatócito (ETTINGER & FELDMAN, 1997). Sua atividade sérica reflete a
necrose hepatocelular como sua liberação na corrente sanguínea após o dano
membranar (JANBAZ & GILANI, 2000; CHOI et al., 2006).
Por outro lado, a AST, encontrada em maior quantidade na mitocôndria, pode
aumentar em em injúrias cardíacas e musculares. No dano hepatocelular leve,
a forma predominante no soro é a citoplasmática, enqunato que em lesões
severas, análogas à hepatite viral aguda, como é o caso da causada por CCl 4,
há liberação da isoenzima mitocondrial, elevando-se a relação AST/ALT, além
da elevação de BT. A perda da função do hepatócito em conjugar a bilirrubina
indireta em bilirrubina direta impossibilita a secreção dessa proteína, elevando,
portanto, os níveis de BT (MOTTA, 2003).
Os resultados obtidos nas análises bioquímicas dos soros de animais tratados
com o extrato metanólico de Spondias sp. em comparação com os outros
grupos de animais experimentais são mostrados na Tabela 7.
O dano hepático provocado pela administração do CCl4 é indicado pelo
aumento da atividade das transaminases e a perda de função hepática,
evidenciada pelo aumento de BT, quando comparado ao grupo controle.
Por outro lado, reduções significativas nas atividades de AST, ALT e na
concentração de BT foram observadas nos animais tratados com EMS e com
FRF, sendo similar ao observado no grupo de animais tratado com Legalon®,
cujas concentrações foram análogas às detectadas no grupo controle.
Assim, os resultados sugerem uma ação hepatoprotetora, que pode ser
explicada pela estabilização da membrana celular, com a concomitante
diminuição do extravasamento enzimático intracelular (THABREW et al., 1987).
A queda na atividade dessas enzimas indica uma melhoria do estado funcional
hepático, uma reversão da hepatite química induzida por CCl4.
Outros estudos com extratos de plantas mostram resultados semelhantes aos
observados com EMS e FRF. Neses estudo, o efeito hepatoprotetor de
preparações diminuiu a atividades de AST, ALT e a concentração de BT, como
é caso de Cytisus scoparius L. (RAJA et al., 2007). Resultados similares com
extratos ricos em flavonóis foram mostradas com com fração acetato de etila
- 76 -
de Coriandrum sativum Linn., e acacetin-7-O-galacturonideo, isolado de

Onopordum alexandrinum (PANDEY et al., 2011; SALAMA et al., 2011).
Tabela 7. Parâmetros bioquímicos de avaliação de lesão e função hepática nos

animais dos diferentes grupos experimentais.
Grupo AST (U/I) ALT (U/I) BT (mg/dL)
Controle 140,7 ± 30,6 37,2 ± 11,3 0,29 ± 0,01
CCl4 *** 871,3 ± 19,5 438,0 ± 21,2 0,56 ± 0,02
CCl4+Leg.®50mg/kg 160,7 ± 13,6 54,4 ± 29,6 0,30 ± 0,01
CCl4+300mg/kgEMS 169,3 ± 45,0 76,7 ± 7,6 0,35 ± 0,01
CCl4+25mg/kg FRF 183,7 ± 6,0 121,3 ± 29,1 0,29 ± 0,01
CCl4+50mg/kg FRF 147,4 ± 7,4 104,80 ± 22,8 0,30 ± 0,01
CCl4+75mg/kg FRF 136,5 ± 18,5 70,50 ± 26,5 0,27 ± 0,03
Valores em média ± desvio padrão, n=5/grupo.
*** Observa-se diferença estatistica, considerando p<0,001
AST, aspartato transaminase; ALT, alanina transaminase; BT, bilirrubina total; Leg., Legalon;
EMS, extrato metanolico de Spondias sp.; FRF, fração rica em flavonóides.
5.4.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
As análises histopatológicas do dano hepático causado por CCl 4, realizada por

microscopia óptica na região circunvizinha à veia centro lobular, confirmam a
natureza e o grau da lesão hepática nos animais, onde ocorreu a
biotransformação do CCl4 a CCl3-, um radical livre que lesa as células.
Assim, o grupo controle positivo (animais tratados com CCl4) apresentou dano
hepático grave, evidenciado pela balonização dos hepatócitos, pela esteatoses
e por um discreto infiltrado mononuclear parenquimatoso (Figura 17B). Este
dano foi revertido nos animais pré tratados com CCl4 e em seguida tratados
com EMS, FRF e Legalon®. Os grupos tratados com FRF 25 mg/kg e com
Legalon®, porém, foi observada uma esteatose discreta (Figura 17C e 17E),
enquanto os animais tratados com EMS e FRF 50 e 75 mg/kg apresentaram
apenas constricção dos sinusóides (Figura 17D, 17F e 17G). Os animais sem
tratamento (controle negativo) apresentaram vacuolizações e hepatócitos
alinhados, indicativo da estrutura tissular hepática normal (Figura17A).
- 77 -
O resultado histopatológico dos animais tratados com CCl4 mostraram necrose

hepatocelular nas regiões próximas a veia centro lobular e degenerações,
como esteatose hepática, infiltrado neutrofílico, balonização e tumefação
celular e discreta hemorragia. Isto é condizente com dados da literatura, que
mostram uma acentuada degeneração dos hepatócitos induzida por CCl 4
(WANG et al., 2008; SINGH et al., 2008).
O tratamento com EMS e FRF, no entanto, indicou uma ação reparadora com
clara proteção hepática, como mostrado histologicamente (Figura 17). Este fato
é coerente com a significativa diminuição das atividades de ALT e AST e a
redução na concentração de BT.
- 78 -
Figura 17. Histopatologia de fígado murino (Hematoxilina e Eosina).

(A) Grupo controle (B) Grupo tratado com CCl4
(C) Grupo com CCl4 + Legalon® (D) Grupo com CCl4 + SEM
(E) Grupo com CCl4 + FRF 25 mg/kg (F) Grupo com CCl4 + FRF 50 mg/kg
(G) Grupo com CCl4 + FRF 75 mg/kg
- 79 -
5.7.3 MARCADOR DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA – Substâncias Reativas ao

Ácido Tiobarbitúrico
A concentração de SRAT no homogenato de fígado dos animais do controle

positivo confirma o aumento da peroxidação lipídica nos animais com lesão
hepática (Figura 18). Nos animais submetidos à injuria hepática, após sete dias
de administração do EMS e FRF por gavagem, foi observada uma significativa
redução na concentração de SRAT. Fato que indica, portanto, a inibição da
peroxidação lipídica. Uma situação análoga, em termos de redução de ERO, foi
verificada também nos animais intoxicados com CCl4 e tratados com a
substância controle (Legalon®), sempre no mesmo período experimental.
80 ***
60
SRAT (µmol/L)
***
40
20
0
S
F.
F
F
l4
e
.
eg
ol
FR
FR
EM
C
FR
tr
+L
C
on
kg
kg
kg
kg
l4
g/
g/
C
g/
g/
C
5m
5m
m
0m
00
+2
+7
+5
+5
l4
l4
l4
l4
C
C
C
C
C
C
C
Figura 18. Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre as concentrações de

SRAT em homogenato de fígado de animais intoxicados com CCl4.
Valores expressos em média ± desvio padrão, n=5/grupo. *** Observa-se diferença estatistica
em comparação ao controle, p<0,05
O tratamento com EMS e FRF de animais pré tratados com CCl4 foi
satisfatório ao inibir a produção de ERO, com a consequente e significativa
diminuição da peroxidação lipídica. Estes resultados são coerente com o
- 80 -
elevado percetual de sequestro de radicais DPPH•, que fora detectado na

análise in vitro com as amostras em estudo. Em ambos os casos, a presença
de flavonóides (antioxidantes) no extrato e na fração deve estar envolvida na
capacidade de sequestro de radicais e na inibição do processo de peroxidação
lipídica.
A concentração de SRAT hepático decresceu significativamente, indicando que

a administração do extrato e da fração rica em flavonoídes melhorou a lesão
oxidativa, com a decorrente diminuição da atividade de AST e ALT, além da
concentração da BT. Os resultados apresentados neste trabalho estão de
acordo aos observados por JAIN et al. (2008) após a administração de extratos
de Momordica dioica, Rosmarinus officinalis L. (FREGOZO et al, 2012), e Vitex
glabrata (SRIDEVI et al., 2011), quanto à diminuição de SRAT no fígado que
comprovaram as atividades antioxidante e hepatoprotetora dessas plantas.
Uma situação similar foi mostrada por PEREZ, et al. (2011) em um estudo
realizado com extrato rico em flavonoides isolado de Prosthechea michuacana.
5.7.4 BIOMARCADORES ANTIOXIDATES
5.7.4.1 Glutationa Reduzida em homogenato de fígado
Os animais intoxicados com CCl4 e tratados com EMS e FRF mostraram uma
recuperação em relação ao conteúdo da GSH hepática. A diferença
significativa deste biomarcador foi evidenciado nos animais tratados com EMS
e FRF, sendo também observado no grupo de animais injuriados tratados com
o Legalon®. A comparação foi feita em relação aos grupos controle (tratado
com CCl4 e sem nenhum tratamento, sendo observado valores elevados, de
GSH, como mostrado na Figura 19.
- 81 -
10
### ### ###
8
GSH (mmol/L)
4
***
2
g.
e
F.
F
l4
ol
FR
FR
C
EM
Le
FR
C
tr
l4 +
on
kg
kg
kg
kg
C
C
g/
g/
g/
g/
C
m
0m
m
25
75
50
50
l4 +
l4 +
l+
l4 +
C
C
C
C
C
C
C
C
Figura 19. Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre o conteúdo de GSH em
homogenato de fígado de animais pré tratados com CCl4.
Valores expressos em média ± desvio padrão, n=5/grupo. *** Diferença estatistica comparado
###
ao controle, p<0,05 Diferença estatistica comparado ao CCl4+Leg., p<0,05
O tratamento com o EMS e FRF mostra a desintoxicação dos intermediários

reativos gerados pelo CCl4. Então, a avaliação de GSH fornece importantes
informações bioquímicas sobre o balanço redox no organismo, permitindo
correlações clínicas com processos patogênicos, onde a determinação de
GSH, como indicador de peroxidação lipídica relacionada à função hepática,
traçaria um perfil bioquímico mais amplo de possíveis doenças associadas ao
estresse oxidativo (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Os resultados
experimentais sugerem que a ação antioxidante do extrato é devido à presença
de substâncias fenólicas; uma vez que o estudo fitoquímico mostrou a
presença de flavonóides, principalmente rutina, na sua composição.
Os resultados obtidos com EMS e FRF no modelo de injúria induzida por CCl 4
são condizentes com os que preconizam a utlização de polifenóis no combate
ao estresse oxidativo, face ao seqüestro de radicais livres (BRITO, 2009).
O estrese oxidativo está envolvido em diversas desordens fisiológicas (e.g.
como processos inflamatórios e ulcerogênicos). Portanto, agentes
antioxidantes, como vitamina E (SODERGREN et al., 2001), Gingko biloba
(OZENIRLER et al., 1997) e extrato de Camélia sinensis (FADHEL & AMRAM,
- 82 -
2002) são capazes de aumentar o conteúdo de GSH, prevenindo os efeitos da

peroxidação lipídica causada pelo CCl4. Os polifenóis se enquadram neste
contexto, pois estudos com extratos ricos em rutina de Launaea procumbens
(KHAN ae al., 2011), Diospyros kaki L. (SUN et al., 2011) evidenciaram a
elevação do conteúdo de GSH em doses próximas as utilizadas de FRF.
5.7.4.2 Determinação da atividade da catalase em homogenato de fígado
O aumento da peroxidação lipídica e/ou ERO inativa enzimas antioxidantes

(e.g. CAT, SOD e GPx), envolvidas na degradação catalítica de ERO a
intermediários menos reativos ou inertes (GRISSA et al., 2007). O tratamento
com CCl4 reduziu de forma significativa a atividade dessas enzimas.
A primeira linha de defesa antioxidante endógena é a conversão de O2 - a H2O2,

que é responsável pela oxidação da glutationa. Essa reação é catalisada pela
GPx e pela glutationa redutase, cujo papel é restaurar o conteúdo de GSH
(GRISSA et al., 2007). Além da GPx e da SOD, a CAT é outra enzima
antioxidante de importância na eliminação do H2O2.
A atividade de CAT no homogenato hepático de animais tratados com 50 e 75

mg/kg de FRF e EMS+CCl4 foi superior à atividade determinada em animais
tratados com Legalon®. Em ambos os casos, houve recuperação significativa
da atividade diminuída no grupo de animais injuriados com CCl4 (Figura 20).
- 83 -
400
***
*** ***
CAT (U mol/min.L)
300
**
200
100
***
0
l4
e
F.
F
S
eg
ol
FR
FR
EM
C
FR
tr
+L
C
on
kg
kg
kg
kg
l4
C
g/
g/
C
g/
g/
C
5m
5m
m
m
00
0
+2
+7
+5
+5
l4
l4
l4
l4
C
C
C
C
C
C
C
Figura 20. Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre a atividade catalásica
em homogenato de fígado de animais intoxicados com CCl 4. Valores expressos
em média ± desvio padrão, n=5/grupo. *** Observa-se diferença estatistica em
comparação ao controle, p<0,05
5.7.4.3 Determinação da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e

da glutationa peroxidase (GPX) em homogenato de fígado
A atividade das enzimas Superóxido Dismutase e Glutiona Peroxidase em

homogenato hepático dos animais tratados com 75 mg/kg FRF e EMS+CCl4 foi
acima da atividade enzimática dos animais tratados com a substância de
referência (Legalon®), recuperando-se a atividade significativamente diminuída
no grupo controle positivo, os animais injuriados com CCl4 (Tabela 8).
- 84 -
Tabela 8. Atividade das enzimas Superóxido Dismutase e Glutiona Peroxidase

em homogenato hepático nos animais dos diferentes grupos experimentais.
Grupos GPX SOD

(U/g de prot) (U/mg prot)
Controle 9,01 ± 1,53 49,79 ± 3,55
CCl4 3,07 ± 0,95*** 24,27 ± 6,55 ***
CCl4 + Leg.®50mg/kg 10,15 ± 2,71 49,73 ± 4,25
CCl4 + EMS 500 mg/kg 10,53 ± 0,92 49,75 ± 7,01
CCl4 + FRF 25 mg/kg 6,50 ± 0,45** 34,27 ± 2,55 *
CCl4 + FRF 50 mg/kg 7,95 ± 0,62* 41,80 ± 5,43
CCl4 + FRF 75 mg/kg 10,58 ± 1,2 50,58 ± 3,07

*** Observa-se diferença estatistica em comparação ao controle, p<0,05
A diminuição da atividade de GPx, SOD e da CAT, devido ao dano hepático

gerado pelo CCl4, com provável acúmulo de H2O2, indica uma condição de
estresse oxidativo. Entretanto, o tratamento com o extrato reverteu o dano
oxidativo, havendo um aumento na atividade dessas enzimas.
5.8 Ensaio Antibacteriano

As propriedades microbiostáticas e microbiocidas a partir de produtos vegetais
têm sido comprovadas através de intensivas pesquisas em todo o mundo.
Geralmente, são estudadas, avaliadas e confirmadas por ensaios biológicos in
vitro, ou mediande testes de sucetibilidade ou sensibilidade (SOUZA et al.,
2003), como foi realizado no presente trabalho.
O extrato bruto e frações não inibiram o crescimento das bactérias utilizadas na
determinação da atividade antimicrobiana, as quais foram E.faecalis ATCC
29212, K. pneumoniae (amostra clínica) P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli
ATCC 25922, S. Typhimurium ATCC 14028), B. cereus (amostra clínica), S.
- 85 -
aureus ATCC 29213 e S. epidermidis ATCC 12228. A tabela 9 apresenta os

resultados de atividade antimicrobiana com EMS e FRF.
Tabela 09. Determinação da atividade antibacteriana do extrato bruto e das

frações contra as cepas testadas.
Extratos de Spondias sp. (1000 µg) ATM (30 µg)
Bactérias EMS HEX AcOEt CLO HA PPT VAN GEN
E. faecalis
- - - - - - 16,7* NT
ATCC 29212
E. coli
- - - - - - NT 19,7
ATCC 25922
K. pneumoniae - - - - - - NT 20,0
P. aeruginosa
- - - - - - NT 19,0
ATCC 27853
S. Typhimurium
- - - - - - NT 18,0
ATCC 14028
Bacillus cereus
- - - - - - NT 23,3
(amostra clínica)
Staphylococcus
aureus ATCC - - - - - - 17 NT
29213
Staphylococcus
epidermidis - - - - - - 18,7 NT
ATCC 12228
HEX- hexânico; AcOEt- acetato de etila; CLO- clorofórmico; HA- hidroalcoólico; PPT-
precipitado; VAN- vancomicina; GEN- gentamicina; NT- não testado; ( * ) medida do halo
inibitório em milímetros (mm).
5.9 Avaliação da atividade antinociceptiva e

antiinflamatória
A dor e a inflamação estão frequentemente associadas a muitas doenças.

Embora os avanços no conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos
na dor e inflamação e no investimento considerável na pesquisa farmacêutica
para desenvolver esta área, ainda existem poucas classes de fármacos
analgésicos, principalmente no controle da dor crônica (WOODCOCK,
WITTER, DIONNE, 2007). Além disso, as terapias antiinflamatórias atuais são
usualmente insuficientes, face aos efeitos colaterais severos e a efetividade
limitada (BOURINET et al., 2005). Por essa razão, há uma contínua busca por
novas moléculas com maior eficácia e menores efeitos adversos.
- 86 -
5.9.1 NOCICEPÇÃO INDUZIDA POR INJEÇÃO INTRAPLANTAR DE

FORMALINA EM CAMUNDONGOS
O estudo da ação antinociceptiva e antiinflamatória do EMS e FRF utilizou o

modelo de nocicepção induzida pela formalina; teste constituído por duas fases
distintas: 1). a nocicepção neurogênica (fase inicial) resultante do efeito irritante
direto sobre os nociceptores, que ao ativar fibras aferentes primárias, libera
neuropeptídeos como SP e CGRP em terminais periféricos e centrais, e 2). a
nocicepção inflamatória (fase tardia), mediada pela combinação de estímulos
periféricos e sensibilização da medula espinhal (HUNSKAAR, HOLE, 1987;
TJOLSEN et al., 1992; MCCALL; PUIG, SORKIN, 1996).
A administração por via oral do EMS (doses de 30 - 1000 mg/kg) inibiu as duas
fases da nocicepção induzida pela formalina com valores de 41,51 ± 2,7% e
79,87 ± 3,8%, respectivamente (Figura 21A e 21B). A FRF (3–100 mg/kg por
via oral) inibiu a segunda fase (inflamatória) da resposta nociceptiva. A dose de
30 mg/kg foi mais eficaz, com inibição de 75,71 ± 5%. Nenhuma alteração foi
observada na primeira fase da nocicepção com as (Figura 21C e 21D).
Os resultados evidenciam que o EMS e a FRF possuem um importante efeito
antiinflamatório, porém sem efeito antinoceptivo pronunciado.
Recetemente, foi relatado que a administração por via oral do extrato bruto e
de rutina isolada de Polygala paniculata L. reduziram de forma significativa a
resposta nociceptiva que fora induzida por glutamato, bem como também elas
foram efetivas em reduzir a resposta neciceptiva produzida pela administração
intraplantar de formalina em camundongos (LAPA, et al. 2009).
- 87 -
Figura 21. Efeito do EMS e FRF sobre a nocicepção induzida por formalina
2,5% em camundongos. A nocicepção foi avaliada na primeira fase(0-5 min,
painel A e C) e na segunda fase (15-30 min, painel B e D).
Os resultados estão expressos como médias ± desvio padrão (n=6). A comparação entre os
grupos foi realizada através da variência (ANOVA) seguida do teste de Newman-Keuls.
Diferente do grupo controle para ** p<0,01 e ***p<0,001.
5.9.2 EFEITO DO EMS E FRF SOBRE A ATIVIDADE LOCOMOTORA

ESPÔNTANEA EM CAMUNDONGOS
O tratamento de animais com o EMS e a FRF (doses de 300 e 1000 mg/kg, e

3-100 mg/kg, respectivamente, por via oral) não alterou a atividade locomotora
espontânea dos murinos quando avaliada po 6 min no teste de campo aberto,
comparados aos grupos controle e tratados com o veiculo de disolução da FRF
nos modelos de nocicepção e de atividade antiinflamatória. A dose de 3 mg/kg
de FRF induziu exitabilidade nos animais, elevando o número de quadrantes
percorridos no mesmo periodo de tempo (Figura 22).
O teste do campo aberto foi utilizado para excluir a possibilidade da ação
antinociceptiva e antiinflamatória do EMS e FRF estar relacionada a distúrbios
- 88 -
não-específicos da atividade locomotora dos animais. Os resultados mostraram

que as doses do EMS e FRF que tiveram ação antiinflamatória não alteraram o
desempenho motor dos camundongos.
Figura 22. Efeito do EMS e FRF sobre a atividade locomotora espontânea em

camundongos.
grupos foi realizada através da análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Newman-
Keuls. Diferente do grupo controle para ** p <0,01.
5.9.3 EFEITO DO EMS E FRF SOBRE A PERITONITE INDUZIDA POR

CARRAGENINA
Devido à eficácia apresentada pelo EMS e pela FRF no modelo da formalina,

em termos inflamatórios, foi investigada esta atividade aniinflamatória
utilizando-se o modelo de peritonite induzida por carragenina.
A peritonite induzida por carragenina é um modelo experimental bem
caracterizado de inflamação aguda empregado largamente em testes de novas
terapias anti-inflamatórias pois permite quantificar e correlacionar a migração
celular e do exsudato inflamatório (SHERWOOD, TOLIVER-KINSKY, 2004).
A administração da carragenina aumentou a migração de leucócitos e
neutrófilos para 3,81 e 2,51 x 10-6 na cavidade peritoneal (Figura 23A e 23 B).
- 89 -
O tratamento por via oral dos animais com EMS (300 mg/kg) e com FRF (3-10
mg/kg) reduziu a migração de leucócitos totais com uma inibição de 31,75 ±
2,7% e 68,67 ±3,8% (Figura 23A), enquanto a migração de neutrófilos foi
reduzida em 87,8 ± 2,7 % e 72 ± 3,7 %, respectivamente (Figura 23B).
Figura 23. Efeito do EMS e FRF sobre a migração de leucócitos totais (painel
A), e neutrofilos (painel B) induzida pela carragenina (750 ug/cavidade) por 4 h.
A comparação entre grupos (n=6) foi realizada através da análise da variância (ANOVA)
seguida do teste de Newman-Keuls. Diferente do grupo salina para *** p< 0,001. Diferente do
# ## ###
grupo carragenina para p<0.05, p<0,01 e p<0,001.
A injeção de carragenina também diminuiu os níveis de glutaniona reduzida do

exudato. O tratamento dos animais com a dose de 30 mg/kg do FRF não
reverteu o possivel dano oxidativo gerado pela carragenina, sendo assim
descartada a associação entre a atividade antioxidante e atividade
antiinflamatória (Figura 24).
- 90 -
Figura 24. Efeito do tratamento com FRF sobre o conteúdo de GSH em

exudato peritonial de camundongos pré tratados com carragenina.
Valores expressos em média ± desvio padrão, n=6/grupo. Observa-se diferença estatistica
comparado ao grupo salina, * p<0,05.
Alguns estudos sugerem que as propriedades antioxidantes do gênero

Spondias seriam as responsáveis pela atividade antiinflamatória (PENA et al.,
1999). Porém, os dados experimentais obtidos com a quantificação da
glutationa reduzida demostraram resultados contrários aos preconizados.
5.9.4 EFEITO DA FRF SOBRE A NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA INJEÇÃO

INTRAPLANTAR DE CAPSAICINA OU CINAMALDEÍDO EM
CAMUNDONGOS
Como o FRF não apresentou efeito antinociceptivo frente a fromalina, o

próximo passo deste trabalho foi avaliar outros agonistas mais específicos.
Assim, foi avaliada a participação dos receptores TRPs. Neste estudo, foi
observado que a FRF administrado v.o. não reverteu efetivamente as
respostas nociceptivas induzidas pelas injeções i.pl. de capsaicina ou
cinamaldeído, que são agonistas altamente seletivos dos canais TRPV1 e
TRPA1, respectivamente. Portanto, não houve envolvimento de receptores
TRPA1 numa possivel atividade antiinflamatória com capsaicina (Figura 25).
- 91 -
A administração da FRF (30 mg/kg, v.o.) não inibiu a nocicepção induzida por
capsaicina (5,2 nmol/pata), não havendo envolvimento de receptores TRPA1
na possivel atividade antiinflamatória (Figura 25) ou induzida por cinamaldeído
(Figura 26).
Figura 25. Efeito da FRF sobre a nocicepção induzida por capsaicina (5,2
nmol/pata) em camundongos.
Resultados estão expressos como médias ± desvio padrão (n=6). A comparação entre os
grupos foi realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Newman-
Keuls.
Figura 26. Efeito da FRF sobre a nocicepção induzida por cinamaldeído

(10nmol/pata) em camundongos.
Keuls.
A literatura revisada não foram evidenciada relação entre rutina e inibição de

TRPA1 ou TRPV1, Lapa e colaboradores (2009) sugerem que a rutina possui
atividade antinflamatória, apresentando atividade nociceptiva desconsiderável,
- 92 -
o qual é condizente com estudos realizados com Ixora coccinea Linn., rica em
rutina (BAGILA & KURIAN, 2012).
5.9.5 EFEITO DO EMS E FRF SOBRE A ALODINIA MECÂNICA INDUZIDA

PELO ADJUVANTE COMPLETO DE FREUD (CFA)
A injeção intraplantar de CFA foi capaz de induzir alodínia mecânica na pata de

camundongos 24 h de aplicação deste agente inflamatório, com redução do
limiar 50 % de retirada (Figura 27).
O tratamento agudo com FRF (30 mg/kg) diminuiu significativamente a alodinia
mecânica avaliada com filamentos de von Frey na pata de animais que
receberam CFA. Seu efeito mais intenso foi após 1-2 horas da sua
administração (decurso temporal), enquanto o tramento com EMS (300 mg/kg)
não alterou a sensibilidade aumentada pela injeção de CFA (figura 27).
Figura 27. Efeito do tratamento com EMS (300 mg/kg) e FRF (30mg/kg) sobre
a alodinia mecânica induzida pela injeção intraplantar de CFA em
camundongos. B representa o limiar dos animais nates de receberem o CFA.
Inj. representa o limiar dos animais após 24h da injecção intraplantar do CFA.
Keuls. Diferente do grupo veiculo para *** p< 0,001.
- 93 -
A dose de 30 mg/kg de FRF foi administrada diariamente, não sendo efetiva

em reduzir a alodínia mecânica avaliada após 1-2 h de tratamento. No quinto
dia, o tratamento foi suspenso e observado um possivel efeito de tolerância,
Apá retomada, no oitavo dia, não foi observada alteração no limiar dos animais.
Nos segundo e terceiro dias, após não ser observada resposta do tratamento
com FRF (30mg/kg) na alodínia mecanica, os animais foram submetidos ao
teste de placa quente, nocicepção ao calor (Figura 28) e ao teste de acetona,
nocicepção ao frio (Figura 29).
Figura 28. Efeito do tratamento com FRF (30mg/kg) sobre a sensibilidade na

placa quente (56ºC) em camundongos com dois dias de inflamação crônica
induzida por CFA.
Keuls. Diferente do grupo salina para ** p< 0,01 e *** p< 0,001.
Figura 29. Efeito do tratamento com FRF (30mg/kg) sobre a sensibilidade ao

frio (0,2 ml/pata de acetona) em camundongos com três dias de inflamação
crônica induzida por CFA.
Keuls. Diferente do grupo salina para ** p< 0,01.
- 94 -
5.4 Ensaios Toxicológicos
Ao se avaliar a toxicidade oral aguda e 28 doses em animais tratados com

EMS não foram observados efeitos tóxicos nem alterações no peso corpóreo,
no consumo de água e de ração (Figuras 30 e 31). Ainda, nenhuma alteração
comportamental foi observada, sendos os parâmetros bioquímicos e
hematológicos avaliados comparáveis aos valores dos controles (Tabela 10).
Nenhuma alteração quanto ao peso relativo dos órgâos foi observada.
O tratamento com extrato bruto indicam atoxicidade para toxicidade aguda
(2000 mg/kg) e para toxicidade 28 doses repetidas. (500 mg/kg).
Figura 30 – Gráfico de acompanhamento do consumo de água, ração e peso

corporêo de animais controle e tratados com dose única de EMS 2000 mg/kg,
no período de 14 dias.
Valores em média ± desvio padrão, n=6/grupo. Não foram observadas diferença estatistica,
considerando p<0,05
- 95 -
Figura 31 – Gráfico de acompanhamento do consumo de água, ração e peso

corporêo de animais controle e tratados com doses de EMS 500 mg/kg, no
período de 28 dias.
Valores em média ± desvio padrão, n=6/grupo. Não foram observadas diferença estatistica,
considerando p<0,05
Os resultados experimentais mostraram a rutina, como composto majoritário

em EMS e FRF. Ainda, os componentes de EMS e de FRF apresentaram
elevada capacidade de seqüestro de radicais livres, portanto, excelente
atividade antioxidante ao inibir a peroxidação lipídica no fígado, permitindo o
aumento do conteúdo de GSH e da atividade das enzimas antioxidantes. A
atividade antioxidante do EMS está, provavelmente, correlacionada à presença
de flavonóides, capazes de prevenir o dano oxidativo em vários órgãos
(NASCIMENTO et al., 2006). Quanto a atividade antiinflamatória, foi evidente a
ação frente a processos inflamatórios agudos, em baixas concentrações da
FRF. Assim, o EMS e a FRF apresentam potencial terapêutico, confirmando
um uso na medicina popular em afecções com envolvimento acentuado do
estresse oxidativo e de inflamação aguda. Ainda, o EMS não apresentou
toxicidade aguda ou subcrônica, um indicativo do uso seguro. No entanto,
estudos adicionais devem ser efetuados visando a validação do uso popular,
face ao emprego indiscriminado de plantas medicinais.
- 96 -
Tabela 10 – Parâmetros hematológicos e bioquímicos dos animais

controle e tratados com dose única de EMS 2000 mg/kg, e 28 doses de 500
mg/kg.
Controle 2000 mg/kg 500 mg/kg
Parâmetros Hemoglobina 8,49 ± 0,21 7,89 ± 2,42 7,35 ± 3,45
Hematológico Hematócrito 47,5 ± 0,99 46,33 ± 8,92 45,7 ± 4,70
Leucócitos 7,6 ± 0,85 9,2 ± 0,20 8,0 ± 0,70
Linfócitos 6,70 ± 0,70 7,52 ± 0,40 7,03 ± 0,80
Monócitos 0,82 ± 0,02 1,02 ± 0,23 1,03 ± 0,30
Granulócitos 0,3 ± 0,14 0,4 ± 0,23 0,4 ± 0,15
Plaquetas 865 ± 9,90 945 ± 20,4 900 ± 20,7
Parâmetros Úreia 54,5 ± 7,78 57,33 ± 14,22 55,78 ± 5,67
Bioquímicos Creatinina 0,65 ± 0,07 0,67 ± 0,08 0,66 ± 0,07
ALT 47 ± 4,24 48,33 ± 14,22 46,03 ± 5,34
AST 150,5 ± 23,34 117,67 ± 15,30 135,13 ± 14,05
λ-GT 3,2 ± 0,14 3,7 ± 0,15 3,5 ± 0,30
Bil. Total 0,38 ± 0,02 0,34 ± 0,10 0,40 ± 0,05
Colesterol 29,03 ± 3,6 30,15 ± 1,05 32,08 ± 1,08
Prot. Totais 6,6 ± 0,3 7,04 ± 1,26 6,8 ± 1,2
Glicose 70,5 ± 1,4 61,67 ± 2,1 65,67 ± 5,8
Triglicerídeos 53,00 ± 5,65 49,67 ± 1,22 54,00 ± 7,96
Não foram observadas diferença estatistica, considerando p<0,05
- 97 -
CONCLUSÃO
- 98 -
7. Conclusão
Com base nos resultados experimentais in vitro e in vivo, pode-se concluir que:
1. Os extratos aquoso, etanólico e metanólico, e suas frações obtidos de

folhas de Spondias sp. apresentaram uma eficiente capacidade
antioxidante, demonstrada pelo seqüestro do radical DPPH•;
2. A rutina foi caracterizada como o composto majoritário do EMS e da FRF;
3. O método análitico desenvolvido e validado se mostrou eficaz na

determinação dos componentes do EMS e da FRF;
4. O EMS e a FRF por via oral foi capaz de reverter o dano hepático induzido
com CCl4 em ratos Wistar tratados durate sete dias, ao se observar a
diminuição de parâmetros bioquímicos da função hepática (AST, ALT, BT);
5. O tratamento dos animais com EMS de folhas de Spondias sp. e com a

FRF apresentou uma ótima ação antioxidante ao inibir a peroxidação
lipídica e aumentar o conteúdo da GSH em um tratamento de sete dias;
6. A atividade das enzimas antioxidantes avaliadas (CAT, GPx e SOD)

aumentou nos animais tratados com o extrato (500 mg/kg) e com a FRF
(75 mg/kg).
7. O extrato metanolico de folhas de Spondias não apresentou toxicidade oral

aguda e 28 doses repetidas em ratos fêmeas e machos.
8. A administração de EMS e de FRF apresentaram efeito antinoceptivo frente

a segunda fase da injeção intraplantar de formalina, indicando efeito
antiinflamatório;
9. O efeito antiinflamatório foi confirmado com o tratamento dos animais no

modelo de peritonite induzida por carragenina, com EMS e FRF, inibindo a
migração celular.
10. A avaliação da alodínia mecânica no modelo de neuropatia induzida por

CFA a 80% evidencou atividade inflamatória aguda da FRF, não
apresentando efeito crônico, enquanto que o EMS não apresentou efeito no
modelo avaliado.
- 99 -
- 100 -
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Anexo 01
- 114 -
- 115 -
- 116 -
- 117 -
Anexo 02
- 118 -
Antioxidant and hepatoprotective activities of Spondias sp. leaf extract
Gabriel Araujo-Silvaa, Naira J.N. Britoa, José B.M. Macedoa, Sibele de O. Tozettob,
Alessandra S. Guedesc, Jorge A. Lópezd2, Maria das Graças Almeidaa
a
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, 59012-57 Natal, RN, Brazil
b
Departamento de Patologia Humana, Escola Bahiana de Medicina, Salvador, BA,
Brazil
c
Faculdade de Tecnologia e Ciências, Salvador, BA, Brazil
d
Curso de Biotecnologia, CCBS, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba -
PR, Brazil
Abstract
The study was undertaken to evaluate the effects of a methanolic leaf extract of
Spondias sp. (MLES) on CCl4-induced hepatotoxicity in rats. Twenty female Wistar rats
were divided into four groups. Group 1 served as normal control. Group 2, 3 and 4 rats
were induced hepatotoxicity by CCl4 administering a single dose. Group 2 was the
toxicant control. Group 3 received MLES (500mg/kg body weight, p.o.) while group 4
was treated with reference drug Legalon (50mg/kg bodyweight, p.o.) by oral
administration once daily for 7 days. At the end of the experiment, animals were
sacrificed and blood were collected for assaying biochemical parameters. The livers
were excised for evaluating peroxidation products and histopahology. The results
showed that MLES significantly (p<0.05) lowered alanine aminotransferase (ALT),
aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase, total bilirubin (tBIL), reduced
the content of the peroxidation products malondialdehyde (TBARS) and elevated the
glutathione content (GSH) and the superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase
(GPx) and catalase (CAT) activities, compared to CCl4-treated group. Histopathological
results were also in accordance with the biochemical findings. Therefore, the results of
this study suggest that the MLES protective role might be correlated with its antioxidant
and free radical scavenger effects.
Keywords: Spondias sp.; methanolic extract; Carbon tetrachloride; Hepatoprotective;
antioxidant

Corresponding author. Tel./Fax +55 84 3342 9807
E-mail addresses: mgalmeida@diginet.com (M.G. Almeida)
- 119 -
Introduction
Excessive generation and accumulation of free radicals and reactive oxygen species
(ROS) have been implicated in a multitude of disease states, including inflammation
and some hepatopathies (Halliwell, 2006). Normally, ROS are efficiently neutralised by
a cell potent armoury without any untoward effect. However, hampering the balance
between ROS production and antioxidant defenses lead to the onset of oxidative stress,
which seek stability through electron pairing with biological macromolecules (proteins,
lipids and DNA) in healthy human cells and cause protein and DNA damage along with
lipid peroxidation (Valko et al. 2007). These changes contribute to numerous
manifestations (e.g. cancer, atherosclerosis, cardiovascular diseases, ageing and
inflammatory diseases) (Halliwell, 2006), that have been proven to be associated with
redox imbalance and oxidative stress (Jones 2006). All cells protect themselves against
oxidative damage by enzymes such as catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) or
compounds (e.g. glutathione (GSH), ascorbic acid, tocopherol (Zadák et al. 2007).
Therefore, compounds that exhibit antioxidant properties, scavenging of free radicals
and inhibition of lipid peroxidation are expected to show protective activity (Handa et
al. 1986; Wu et al. 2001; Dhanasekaran et al. 2009.).
Spondias sp (family Anacardiaceae) is a typical fructiferous tree, widely ditributed in
Northeastern Brazil, commonly known as “cajá-umbu” (Lira Júnior et al. 2005). This
species is still in domestication process, possibly the product of natural crossing
between Spondias mombim L. and S. tuberosa Arr. Cam. (Almeida et al. 2007). Besides
the industrial importance (jelly, juice) (Silva Junior et al. 2004), some pharmaceutical
properties have been reported for this plants. Their leaves as infusion are commonly
used in folk medicine to produce a wide variety of remedies against ulcers and
inflammatory processes (Teixeira and Melo 2006).
Therefore, the aims of this study were to evaluate the antioxidant potential and free
radical scavenging activity of a methanol extract of Spondias sp. leaves, employing an
in vitro assay and also investigated the protective effect of this extract against liver
injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) in a murine experimental model.
Histological analysis of liver tissues was also carried out.
- 120 -
Materials and methods
AST, ALT, ALP and tBIL kits were supplied by Biosystems (Spain). Legalon  was
obtained from Nycomed (Brazil). All the other chemicals used were of analytical grade.
Spondias sp. leaves, collected from Itaberaba, BA, Brazil, were identified and
authenticated by Dr. Maria das Graças Ferreira (Department of Botany, Bahia Company
for Agro-Livestock Development (EBDA), Salvador, BA, Brazil). A voucher specimen
(Herbarium Nr. 2897/12.09) was deposited at the Herbarium of the Faculty of
Technology and Sciences (FTC, Salvador, BA, Brazil). Collected leaves were shade-
dried at 40°C and powdered by an expeller. Leaf powder (350 g) was soaked in 3L of
methanol for extraction for seven days with periodical shaking. After filtration, the
solvent was condensed using a rotary evaporator at 40°C, giving a yield residue of
39.5±2.7 g. The crude extract (MSE) was stored at -20ºC for subsequent experiments.
Total phenolics in leaf Spondias sp. extract were determined using Folin-Ciocalteu
reagent, based on procedure described by Georgé et al. (2005), and the results were
expressed as mg of gallic acid equivalents per g of extract. The determination of radical
scavenger activity of the extract was performed by the DPPH test (Brand-Williams et al.
1995), using Carduus marianus extract and BHT as positive controls. The results
expressed in % RSC.
Twenty adult female Wistar rats (160 – 210 g) were used. Animals were bred in the
Central Animal House (CCS, Federal University of Rio Grande do Norte) at 223ºC in
12 h light/dark cycles with standard diet and water ad libitum. The experiments were
performed in accordance with the guidelines provided by the Brazilian College of
Animal Experimentation (COBEA) and Institutional Animals Ethics Committee
(protocol 100312/09).
Animals were divided into four groups (n = 5). Group 1 served as normal control and
received vehicle corn oil. Group 2, 3 and 4 were induced liver toxicity by CCl4
administration by a single dose of CCl4 (2.5 ml/kg CCl4, diluted in corn oil). Groups 2
served as toxicant control, while groups 3 and 4 received MSEL and Legalon®
(antioxidant control) at doses of 500 mg/kg and 50 mg/kg, respectively, for seven days.
Administration was done orally using the intragastrictubes .Animals were humanly
sacrificed 24 h after the last treatment by cervical dislocation, anesthesied with
Tiopental (40 mg/kg b.w.). Blood was collected and serum was separated to analyze the
- 121 -
biochemical parameters, while livers were dissected out for analysis and
histopathological analysis.
Serum level of ALT, AST, tBIL were estimated according to the manufacturer‟s kit
instructions (Biosystems, Spain). Catalase was determined as described by Beutler
(1975). GSH was determined by the method of Beutler et al. (1963), while the levels of
TBARS were estimated as describe by Ohkawa et al. (1979) was determined in liver
homogenate. For histopathological examination livers sections were fixed in 10%
buffered formalin, processed, and embedded in paraffin, cut into 5 - 6 µm thick sections
and stained with haematoxylin-eosin (H&E), using a standard protocol and then
analyzed by light microscope.
Acute toxicity study was performed according to Organisation for Economic Co-
operation and Development guidelines No. 423 (OECD, 1996). Wistar rats of either sex
were divided into six groups with six animals each. MESL was administered orally as a
single dose to rat at different dose levels of 250, 500, 1 000, 1 500 and 2 000 mg/kg
b.w. Animals were observed periodically for the symptoms of toxicity and death within
24 h and then daily for 14 days.
Reverse-phase HPLC analysis were performed by a method development and
validation, on the VARIAN ProStar HPLC system (Walnut Creek, USA), consisting of
HPLC pump, ProStar 240 quaternary gradient unit, 335 PDA UV/Vis detector. In order
of chromatographic separation, we accomplished on a Phenomenex C18 reverse phase
column (Phenomenex, 4.6 X 100 mm, 2.6 µm) at room temperature and monitored at
280 nm. The gradient solvent system consisted of 0.1% formic acid in water (solvent A)
and acetonitrile (solvent B) according the table 01, with a flow rate of 1.3 ml/min. For
preparation of stock solutions, extracts and nine phenolic compounds were dissolved in
MeOH at concentrations of 5 mg/mL, and 1 mg/mL, respectively. After filtration
through a syringe filter (0.22 µm, Allcrom), 9 µl of each sample was injected. The
retention times, linear ranges, linear coefficients, correlation coefficients and UV
spectrums were showed in table 02. The relative quantity of phenolic compounds in the
extract was calculated from each equation, considering the spectrum similarity, and the
results were expressed in mg of equivalent standard/ g of the extract.
The experimental results were expressed as meanSD. Analysis of variance was
(ANOVA) used for statistical analysis by and post-hos test of Tukey-Kramer, using the
Graph PAD Software version 4.0. p <0.05 implied significance.
- 122 -
Results and Discussion
The methanolic crude extract from Spondias sp. leaves produces no mortality at 2 000
mg/kg. Therefore, one-quarter of the maximum no mortality dose of extract, it were
selected as therapeutic dose (500 mg/kg) in this study.
In the present study, it was evaluated the methanolic crude extract from Spondias sp.
leaves which was tested against the CCl4 induced hepatotoxicity.
Fig. 1 shows the percentage of radical scavenger activity of the extract. It was found
that the reduction of DPPH occurred in a concentration-dependent manner, as observed
with the decrease in the absorbance of DPPH. This result was in accordance with the
concentration of phenolic compounds determined in the extract (12.08±1.20 mg
EAG/100 mg of extract).
The hepatoprotective efficacy of the MSEL against CCl4-induced liver injury was
evaluated in a murine model. The administration of a single dose of CCl4 resulted in a
significant increase of the serum levels of AST, ALT, ALP and tBIL (p<0.05) due to
liver injury. In treated animals with MSEL (group 3) and Legalon (group 4), there was
a significant (p<0.05) decrease in these serum hepatic marker levels (Table 1).
The activities of CAT, SOD,GPx and the GSH content were significantly reduced in the
CCl4-intoxicated group (p<0.05) when compared to normal control animals. In the
group 3 which received CCl4 with MSE and in rats treated with Legalon (group 4), it
was observed a significant (p<0.05) increase in the levels of CAT and GPx activities, as
well as in the GSH content, which were near to normal (Group 1) (Table 2).
The administration of CCl4 in rats increased the TBARS level in the liver when
compared to normal control animals (p<0.05). However, the TBARS content was
significantly reduced by the oral administration of the MSEL or Legalon (p<0.05),
when compared with animals from group 2 (Fig.2).
In the histopathological analysis of group 1 (Fig. 3a), animals showed normal
architecture of liver. In rats treated with CCl4 alone, the liver normal architecture was
completely lost with the appearance of vacuolated hepatocytes and degenerated nuclei.
Vacuolization, fatty changes and necrosis of hepatocytes were severe in the
centrilobular region and these changes were also observed in areas other than the
centrilobular regions (Fig. 3b). The livers of rats treated with MSEL (Fig. 3c) or
Legalon (Fig. 3d), group 3 and 4, respectively, showed a significant recovery from
CCl4-induced liver damage as evident from normal hepatocytes with well defined
- 123 -
nuclei, almost comparable to those of the control group. Vacuolization and fatty
degeneration were remarkably prevented by the treatment with extract and Legalon.
The HPLC method applied to separation of major number of compounds in the
Spondias sp. extract, were efficient to identification of the majors compounds and
groups in MSEL. In fact, were observed twelve major compounds (Figure 1A), and the
group were identified by comparison between their and external standards (Figure 1B)
UV spectrums and retention times, which just the compounds 4, 5 and 6 no possible
identified the group. The compound 1(RT=1.43) was identified as simple phenolic by
shown the RT and UV spectrum similar to Gallic acid, and compound 2 (RT= 1.73)
was identified and quantified as 0.69±0.0012 µg Gallic acid/mg of MSEL. The
compound 3 (RT=6.63) was quantified as 1.34 ±0.0065 µg de Chlorogenic acid /mg de
MSEL. The compounds 7, 8 and 9 (RT=9.23, 10.05 and 12.65) corresponding at
glycosylated flavonoids, and the compound 7 was identified and quantified as 21.63 ±
0.0039 µg of rutin/mg de MSEL. Flavonoids aglicon, compounds 10(15.99), 11(18.92)
and 12(19.30), were found, and the compound 10 corresponding at 2.14 ± 0.02 µg of
quercetin/mg MSEL. The compound 11 were quantified as 4.44 ± 0.0046 µg of
kaempferol/mg de MSEL.
The results indicate that the methanolic crude extract from Spondias sp. leaves was
found to be rich in phenolics and flavonoids, a flavonol-3-O-glycosilate (compound 7)
with near retention time and similar UV spectrum of rutin, and were identified gallic
acid, chlorogenic acid, quercetin and kaempferol.
Acknowledgements
The authors thank to FAPESB, CNPq (proc. 478652/2010-0), Faculdade de Tecnologia

e Ciências, Salvador – BA for the preliminary assay and Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal for Grant and financial support.
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- 126 -
Table 1. Scheme of the elution gradient established for the separation of phenolic
compounds
Time (min) ACN (%) Remarks

0-3 5 Isocratic range
3-7 520 Linear increase
19-20 505 Return to initial conditions
- 127 -
Table 2. Parameters to quantification of nine phenolic compounds used a external

standard method.
Linear
Retention time
Compound range a R2 UV (nm)
(min)
(mg/mL)
Gallic acid 1.71 1.5-50 9.2054 0.9945 271
Chlorogenic acid 6.47 1.5-50 9.7922 0.9973 326
Catechin 7.19 1.5-50 5.3171 0.9993 278
(-)-Epigallocatechin
8.18 1.5-50 8.7029 0.9989 275
gallate
Rutin 9.20 1.81-100 5.3938 0.9976 257 - 354
Hiperin 9.40 1.81-100 7.2496 0.9995 256 - 354
Quercetin 16.03 1.5-50 10.379 0.9991 255 - 371
Apigenin 18.51 1.5-50 10.022 0.9989 266 - 337
Kaempferol 18.85 1.5-50 5.443 0.9984 263 - 367

- 128 -
Table 3. Effect of methanolic leaf extract of Spondias sp. on serum aminotransferases

and total bilirubin in control and treated animals groups.
Parameters Group 1 Group 2 Group 3 Group 4
AST (IU/L) 140.7±30.6 871.3±19.5 169.3±45.0 160.7±13.6
ALT (IU/L) 070.7±18.1 438.0±21.2 076.7± 7,6 069.3± 8.3
ALP (IU/L) 142.0± 7,0 213.0± 2.8 97.2± 5.2 137.0±28.3
tBIL (mg/dL) 0.29 ± 0,01 0.56 ± 0.2 0.35± 0.01 0.30 ± 0.01
Values are expressed as means±S.D.

Values not sharing a common superscript differ significantly at p<0.05
Table 4. Effect of methanolic leaf extract of Spondias sp. on antioxidant parameter

(CAT, GPx, SOD and GSH) in control and treated animals groups.
Parameters Group 1 Group 2 Group 3 Group 4

CAT (Umol/min.L) 223.01±79.12 84.25±43.10 242.08±53.33 271.71±78.39
GPx (U/mg protein) 18.21±4.54 11.42±0.95 23.18±2.78 20.93±3.61
SOD(U/mg protein) 74.58±3.55 24.27±6.55 105.90±4.25 98.52±7.01
GSH (nmol/mL) 5.51±0.40 2.89±0.29 6.74±0.76 5.45±0.93
Values are expressed as means±S.D.

Values not sharing a common superscript differ significantly at p<0.05
- 129 -
Fig. 1. HPLC–UV chromatogram of phenolic compounds in MESL. Detection was at

280 nm (A), HPLC–UV chromatogram of standard phenolic compounds(B).
- 130 -
- 131 -

Avaliação Ação Faramcologica Fitoterapico Varias

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-1-

Avaliação da composição química, atividade antioxidante, antibacteriana,

GABRIEL ARAUJO DA SILVA

ORIENTADORA: PROFª. DRª. MARIA DAS GRAÇAS ALMEIDA

Avaliação da composição química, atividade antioxidante, antibacteriana,

GABRIEL ARAUJO DA SILVA

Dissertação submetida ao programa de Pós-

ORIENTADORA: PROFª. DRª. MARIA DAS GRAÇAS ALMEIDA

GABRIEL ARAUJO DA SILVA

Avaliação da composição química, atividade antioxidante, antibacteriana,

Agradeço a todos que ajudaram para o êxito da realização deste trabalho, e

À Mainha, Elenilda S. A. da Silva [Bebel], e a Painho, Wanderley P. da Silva,

Ao meu irmão, Filipe A. da Silva, pelos muitos momentos de conversa

À Profª. Drª. Maria das Graças Almeida, pela orientação e confiança

À coordenação do curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,

Ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas na pessoa da Prof. Dr.

Aos colegas do Laboratório Multidisciplinar dos Programas de Pós Graduação

A turma do Fogo Violeta, desde baianos, gaúchos, potiguares, cearenses à

As minhas amigas Suzane Guimarães Cairo e Monaliza L. Maia, por muitas

Aos meus amigos e funcionários do Biotério Central do CCS, Ana Auxiliadora

A todos do Laboratório de Fitoquímica da UFPR, em especial ao Prof. Obdúlio

Ao Prof. Adair Roberto Santos, e todos do Laboratório de Neurobiologia da

A CAPES pelo apoio financeiro, disponibilizando bolsa de mestrado desde o

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (MCT/CNPq), que por meio do fomento

“Pipas sobem mais alto contra o vento, não com ele.”

Spondias sp. (Anacardiaceae), popularly known as cajá-umbu, is an endemic

Keywords: Spondias sp., pharmacology activities, toxicity, rats and mice.

SME Spondias sp. Methanolic Extract

05 Estrutura do -tocoferol (BRITO, 2009) 30

06 Estrutura base dos flavonóides (TIWARI, 2001). 34

07 Mecanismo de sequestro das ERO (R•) por flavonóides, 35

11 Espectros de UV, varredura de 200 – 500 nm, do composto 62

12 Estrutura química da rutina 66

13 Varredura espectral em 2D e 1D dos marcadores 67

14 Análise cromatográfica exploratória dos nove padrões, 68

15 Análise cromatográfica dos nove padrões e extrato bruto de 69

16 Análise de pureza de pico dos nove compostos. Área verde: 70

4.5 Determinação da capacidade antioxidante in vitro 47

5.3 Desenvolvimento de método analítico por CLAE-DAD 66

Esse imenso patrimônio genético, já escasso nos denominados países

No intuito de estabelecer diretrizes para a atuação do governo e de grupos de

Os países desenvolvidos detêm as maiores indústrias farmacêuticas e geram

a pesquisa e desenvolvimento desses medicamentos são caracterizados por

Assim, no presente trabalho as atividades farmacológicas dos extratos, frações

2.1 Levantamento botânico

A família Anacardiaceae compreende 77 gêneros e cerca de 600 espécies,

No Brasil, este gênero é representado por várias espécies, como mostrado na

Tabela 1. Espécies do gênero Spondias distribuídas no Brasil

Nome científico Nome popular

O cajá-umbu (Spondias sp.) é uma planta frutífera nativa do Nordeste

O fruto do cajá-umbuzeiro é caracterizado como uma drupa arredondada, de

Figura 1. Detalhes da exsicata de Spondias sp.(voucher nº

Os caracteres físicos dos frutos referentes à aparência externa, ao tamanho, à

Quanto às folhas do cajá-umbuzeiro, as mesmas foram descritas

secretores e dois feixes vasculares, e idioblasto com inclusão de oxalato de

Figura 2. Cajá-umbu (Spondias sp.) Linn. (EMBRAPA)

2.2 Atividade farmacológica

A família Anacardiaceae apresenta espécies e variedades com usos populares,

Tabela 2. Bioatividade atribuídas a espécies da família anacardiácea

Quimicamente, o gênero Spondias é caracterizado pela presença de

O fruto do cajá-umbu apresenta teores elevados de vitamina C e glicídios.

Rhus, outro gênero da família anacardiácea, possui múltiplas atividades

2.3 Estresse oxidativo

2.3.1. ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO