TOXICIDAD

Microscopio
 Tener presionado el botón fondo derecha
 Para apagar con solo sostenerlo
 Cámara de Neubamer (cuarzo) ubicar la cámara en el microscopio de tal
forma que queden bajo el objetivo de las cruces de la cámara (cuadros
pequeños).

Objetivo más pequeño – se enciende la luz.

Enciende

Luz

Camara A B Camara

Camara C D Camara

Las células que estén sobre los límites (líneas gruesas externas de cada cámara).
El objetivo pequeño 100X es solo para ubicar la cámara de Neubamer. Se utiliza es
el objetivo 500X.
 Agua destilada
 Azul de metileno
 Levadura → una solución de levadura para el dia.
50 mg → 5 mL ∫ → 1000 ppm
En el blanco deben haber más células vivas que muertas.

Blanco Muestra 1 Muestra 2 Muestra ....

Hay que leer cada hora, una sola lectura. La idea es dejar 20 min entre cada montaje
para alcanzar a leer entre cada una.
I. Blanco
 100 µL de sln de levadura.
 900 µL de H2O desionizada.
 Agitar.
 Se toma el tiempo de inicio de 1h.
1 h después.
 100 µL de blanco.
 100 µL de azul de metileno.
II. Muestra.
 100 µL de sln de levadura.
 900 µL de muestra.
 Agitar.
 Se toma el tiempo de inicio de 1h.

Lecturas.
 Agitar para tomar la muestra.
 Se toma 100 µL y se deposita objetos.
 Luego se agrega 100 µL de azul de metileno y se mezcla con la misma punta
de la micropipeta.
 En la cámara de Neubamer se pone una gota diminuta de agua (en los
canales), para que se pegue el cubre objeto.

Agua Agua

 Se ubica el cubre objeto para que tape las 2 cámaras.

 Se decide qué cámara se va a usar y con una micropipeta se agrega la
muestra azul.
 Se ubica la cámara de Neubamer.

ACTIVIDAD ANTIBIOTICA
Preparar cabina laminar (conectarle).

 Limpiar con alcohol.

 Encender lámpara UV por ⋍ 30 min.
 Apagar la lámpara UV.
 Encender la lámpara de luz visible.
 Encender el verificador.

Procedimiento para crecer bacterias y leer densidad óptica.

 Desinfectar guantes todo el tiempo.

 Encender el mechero.
 Para medir la intensidad óptica, se espera 4 h, que se tiene la suficiente
turbidez de bacterias.
 Tubo falcon rotulado y autolavado.
 7 mL de caldo nutritivo, no olvidar flamear para evitar contaminación.
 El tubo se desinfecta pasándolo por la llama, se sirven el tubo y se vuelve a
flamear.
 Ojo, si el mechero se empieza a quemar es porque el alcohol se acabó.
 Luego se dejan 4 h en la incubadora a 35 °C.
 Después de las 4 h se lee la densidad óptica en el espectrofotómetro 580 nm
(turbiedad para aproximar cantidad inicial de bacterias).
Las lecturas debe dar absorbancias de 0.6, después de cada lectura se desecha y
se dejan en limpio.

Ej: abs → 0.412 E.coli

abs → 0.674 Aureas

0.6∗10 µL
V0= = 8.9 µL Aureas
0.674

0.6∗10 µL
V0= = 14.56 µL E.coli
0.412
Se agrega las bacterias en el caldo en 10 mL de Agar nutritivo.

4 2

Se mide el halo de inhibición, diámetro del halo.

Ej: 1.3 cm, 1.2 cm, 1.2 cm.
La respuesta se da: H/H0.

La muestra debe tomarse y antes de agregarse al agar debe estar filtrada y sin
peróxido de hidrogeno (usar bisulfito) se debe garantizar que la muestra no tenga
otras sustancias.
 10 mL de agar nutritivo.
 Inocula 10 µL/ 10 mL para 50 mL de agar → 50 µL de caldo de bacteria.
 El agar nutritivo debe ponerse liquido – se usa el microondas ⋍ 2 -3 min – 4
min hasta que quede completamente líquido. Se destapan los frascos antes
de meterlos al microondas.
Como repicar bacterias:
 10 mL de agar nutritivo a la placa y se espera a que se solidifique.
 Se esteriliza el agua.
 Introducir en el caldo de bacterias.
 Luego se esparcen en el agar solidificado (Ojo todo cerca del mechero).

Para la AA
 Cerca del mechero destapar la caja de Petri. Primero se rotula la caja de Petri
(caben hasta 5 muestras con esta metodologia) y se coloca una base de agar
de papa (5 mL) permite la claridad para mejor lectura del halo de inhibición,
 se acerca al mechero, se destapa y se agrega el agar a la caja de Petri –
hasta la mitad del círculo.
 Se deja solidificar.

Aparte se inoculan las bacterias en el agar nutritivo, se adiciona 10 mL / caja de

Petri en el tubo de falcon.

 Se destapa el agar y se agrega al tubo falcon.

 Se mide la T del tubo y debe estar entre 45 – 50 °C.
 Se debe esterilizar el termómetro.
 Luego se adiciona el caldo de bacterias (10 µL/ 10 mL de agar nutritivo).
 Se usa punta micropipeta esterilizado, la punta se descarta en un tarrito de
descarte.
 Se agita suavemente y se sirve el contenido del tubo de falcon sobre la caja
de Petri donde ya está el agar el agar papa.
 Cuando se ha solidificado el agar se ubica los pozos (en los sitios que se
selecciona y se rotula), se deposita sobre el agar. Los pozos deben estar
esterilizadas.
 Luego de ubicarlas se agrega la muestra, 30 µL en cada pozo. Ojo se ayuda
con el dedo para sostener la micropipeta y no perder el pulso (ojo no puede
quedar burbujas.
 Después de ubicar la muestra en cada pozo, se deja aproximadamente 1h
con la cabina encendida, mechero encendido. Velocidad del ventilador 50
rpm.