Tinción de Ziehl-Neelsen

Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga
que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con
colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. La coloración requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el
calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el
colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética
de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que
resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul
Gram
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de
dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana
plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado
solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína)Por el contrario, la capa de
peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana
plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa
delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está
hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se
tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el
peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram
positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
-La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de
las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona.
La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de
cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la
coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Grampositivas, al poseer una pared celular más
resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente
orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse
el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea

- 1.El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias
cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y
Gram negativas son teñidas de color violeta.

2.Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una superficie
determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la pared célular bacteriana usando de
mordiente al lugol, en la pared bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo
que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague.Ya sabemos que la pared de los Gram
positivos son ricos en ácidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes,
todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un
caracter mas ácidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante básico cristal
violeta.

3.La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que decolora la pared bacteriana disolviendo el
complejo cristal violeta-lugol, esta decoloración no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias
explicaciones al respecto, les menciono las dos más aceptadas.
-Una teoría dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos
grampositivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del
complejo cristal violeta-lugol. En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco péptido glicano y una
gran cantidad de lípidos estos últimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del
complejo cristal violeta-lugol.
-Otra teoría dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran
cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-acetona
formando una especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la sálida del complejo cristal violeta-
lugol por ende se retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso de decoloración.

4.La safranina es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos
cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se tiñen de color rosa, sin embargo
las bacterias Gram positivas no se tiñen debido a que su pared célular esta saturada del colorante cristal
violeta y esto no permite la entrada de la safranina.

Tinción de esporas
La envuelta de la endospora es mas compleja e impermeable que la envuelta de las células vegetativas
en las que se forma. Solo se puede teñir el contenido de la espora alterando su envuelta. La
impermeabilidad de las cubiertas dificulta que las endosporas se decoloren una vez teñidas.
El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por tanto, se
une débilmente a la bacteria. Penetra en las células vegetativa . Cuando se calienta la preparación
también penetra las endosporas.
Durante el lavado con agua, el verde de malaquita se elimina de las células vegetativas, pero no de la
endospora.
El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las células vegetativas (decoloradas por el
agua)

Tincion simple

La tinción simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. Utiliza un solo
colorante (violeta de genciana, azul demetileno, fuscina diluida).La tinción simple se utiliza para destacar
el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas. En las
tinciones simples se usa un único reactivo, que preferentemente es de tipo básico y contiene un
cromógeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias
posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromógeno. Se utilizan solamente para
incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color.
Por tanto, la tinción simple mejora la observación de la célula completa. Se fija el espécimen, se añade el
colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y
la preparación ya está lista para ser observada.