ENZIMAS MICROBIANAS

Josué Picho, (2016)

Microbiología Aplicada, Universidad San Francisco de Quito

Breve introducción a las enzimas microbianas

Las enzimas microbianas, en la última década, han sido empleadas en industrias que van desde
alimentos hasta la biología molecular. Debido a que muchos microorganismos son una fuente
excelente de producción de enzimas, en la actualidad, esta fuente ha sido una matriz para
el desarrollo de nuevos productos industriales (Thieman y Palladino, 2010). Las enzimas
microbianas son un grupo de proteínas que aceleran las reacciones químicas (Gurung et al.,
2013). Las enzimas microbianas han sido probadas en múltiples áreas como la medicina,
textiles, biosoluciones, et al. Uno de los primeros procesos fue en la biología molecular en donde
se utilizó polimerasas de ADN y enzimas de restricción procedentes de bacterias (Thieman y
Palladino, 2010). Aisladas de E. coli, las polimerasas de ADN se usan en técnicas de ADN
recombinante (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).
La descomposición de moléculas que realizan las enzimas microbianas determina su función.
Por ejemplo, la enzima celulasa, descompone la celulosa, un polisacárido que se encuentra en
las plantas. Además, se la utiliza para suavizar y desteñir pantalones, esto gracias a derivados
provenientes de Trichoderma reesei y Aspergillus niger. Esta celulasa degradan parte de los
filamentos de algodón que se quedan en los pantalones dando como resultado una tela más
suave (Gutiérrez, Pérez y Uribe, 2012). Tambien, el uso de la enzima proteasa subtilisina,
proveniente de Bacillus subtilis, en la actualidad es parte importante de varios detergentes,
cuya función es degradar y quitar manchas de origen proteico en prendas de vestir (Martínez y
García, 2014). Además, un cierto número de enzimas bacterianas se utilizan tambien para
emplear alimentos, tales como las enzimas que descomponen carbohidratos llamadas amilasas,
que degradan almidón; proteasas, que degradan otras proteínas; y lipasas, que descomponen
grasas (Cavicchioli et al., 2011 y Mganga, Razavi y Kuzyakov, 2015).
1. Ventajas del uso de enzimas microbianas.
Las enzimas microbianas poseen ventajas como especificidad en las reacciones catalíticas,
transformación de una forma de energía a otra, manejo moderado de concentraciones de
sustrato. Además, son moléculas de mucha importancia debido a que determinan la pausa en
las modificaciones químicas (Anbu, 2015). En aspectos como la fermentación disminuyen el
gasto energético y valor de producción (Wackett, 2015). Tambien, poseen mayor capacidad de
adatarse a un medio y por ende poseen un alto potencial de formación de colonias, con el fin,
de mejorar la capacidad catalítica y proveer beneficios mutuos de actividad enzimática
1.1. Gran capacidad catalítica y sintética
 La particularidad de muchas enzimas son su dominio catalítico y su especificidad. La catálisis
se desarrolla en un lugar específico de la enzima conocida como centro activo. Las proteínas
son macromoléculas son eficaces para catalizar alta variedad de reacciones químicas, debido
a su eficacia a la hora de unirse a un gran número de moléculas. Además, las enzimas catalizan
las reacciones en base a la estabilización de los estados de transición (Stryer, Berg y Tymoczko,
2013).
1.2. Potencial amilolítico de microrganismos
Las enzimas que hidrolizan moléculas de almidón, incluyendo pequeños polímeros de glucosa
se denominan amilasas. Estas enzimas pueden ser sintetizadas por animales, plantas y
microorganismos. Se dividen en α-amilasas, β-amilasas y glucoamilasas. Estas enzimas poseen
beneficios a la biotecnología, industria de textiles y alimentación. Una de las más importantes
son las catalíticas: beta-amilasa y isoamilasa que forman parte de gran variedad de bacterias y
hongos (Vanegas, Méndez & Murillo, 2015). Además, las enzimas microbianas poseen potencial
celulítico y lignolítico de enzimas que aportan beneficios en la obtención de metabolitos que se
utilizan de forma industrial, mediante el uso de biodegradación de proteínas de celulosa, almidón
y lignina (Buitrago, Sánchez y Guerrero, 2014).
2. Microorganismos productores de enzimas
2.1. Bacterias
2.1.1. Bacterias celulolíticas
Son las responsables de la degradación de celulosa en forma constante, colonizan la
superficie de restos vegetales; en donde, forman una cubierta extracelular para su
adhesión a las paredes celulares de los vegetales y su posterior crecimiento
dependiendo de la cantidad de sustrato existente. Como resultado final de la
degradación se produce acetato o propionato, algunos ejemplos de este tipo de
bacterias son: Fibrobacter succinogenes, Gram-; Ruminococcus albus, Gram+;
Ruminococcus flavefaciens, Gram+ (Frioni, 2011).
2.1.2. Bacterias xilanolíticas
Son bacterias menos estudiadas responsables de la biodegradación de xilanos en
relación con la celulosa, algunos ejemplos de bacterias son: Butyrivibrio fibrisolvens,
Gram+, produce ácidos butírico, fórmico, acético y láctico como producto final de la
fermentación; Prevotella ruminicola, Gram- que produce ácidos succínico, acético y
fórmico como productos finales (Frioni, 2011).
2.1.3. Bacterias amilolíticas
Estas bacterias representan entre el 22 al 51% de bacterias viables, su principal sustrato
es el almidón, sin embargo, pueden utilizar lactato; son responsables de la degradación
de materiales amiláceos en ácidos grasos volátiles. Algunos ejemplos son: Bacteroides
 amylophilus, Gram-; Streptococcus bovis, Gram+; Selenomonas ruminantium, Gram-
(Frioni, 2011).
2.1.4. Bacterias proteolíticas
Son organismos de rápida fermentación de aminoácidos y proteínas a amonio, además,
de ser una importante fuente de ácidos grasas volátiles (AGV) y proporcionar amonio
como fuente de nitrógeno; dichas bacterias se adhieren a la pared del rumen e hidroliza
la urea. Algunas bacterias son: Peptostreptococcus anaerobius, Clostridium sticklandii
y Clostridium aminophilum (Frioni, 2011).
2.1.5. Bacterias hidrolíticas
Organismos que utilizan oligosacáridos y azúcares solubles para la degradación y
posterior obtención de energía en forma de ATP, poseen un poder reductor y
ferredoxina reducida que es reciclada con la liberación de hidrógeno molecular;
ejemplos de estas se encuentran en: Clostridium, Bacteroide, Propionibacterium (Frioni,
2011).
2.1.6. Bacterias metanogénicas
Son Arqueas, organismos primitivos con un pseudopeptidoglicano en su pared que los
permite ser resistentes a pH bajos y altas temperaturas; son anaerobios estrictos y son
los únicos microorganismos capaces de producir metano gracias a sus distintas
enzimas, sin embrago, son dependientes al sustrato que degradan. Pueden ser:
Methanobacterium, Methanospirillum y Methanobrevibacter (Frioni, 2011).
2.1.7. Bacterias Acetogénicas
Organismos especializados en la producción de acetato a través de la reacción de
dióxido de carbono e hidrógeno, pueden ser: Acetobacterium, Acetogenium y
Clostridium (Frioni, 2011).
2.1.8. Bacterias Sulfatoreductoras
Bacterias que emplean los distintos productos de las fermentaciones para reducir
sulfatos en sulfuros, de dicha reacción obtienen energía; pueden ser oxidantes
completos si degradan ácidos orgánicos de hasta 18 carbonos u oxidantes incompletos
si no pueden seguir degradando (Frioni, 2011).
2.1.9. Bacterias Desnitrificantes
Bacterias que obtienen energía por la oxidación de compuestos orgánicos y del azufre,
mediante nitratos; este proceso facilita la remoción del oxígeno, la clase más distribuida
en la naturaleza son las Pseudomonas (Frioni, 2011).
2.2. Protozoos
2.2.1. Ciliados celulíticos
Producen enzimas degradadoras de restos vegetales que fragmentan el material, pocos
géneros de Epidinium (Frioni, 2011).
 2.2.2. Ciliados amilolíticos
Utilizan el almidón para la producción de energía, sin embargo, estos son responsables
de entre el 30 al 40% de la lipolisis o el incremento del contenido de ácidos grasos
saturados, Son todos los Entodiniomorphes (Frioni, 2011).
3. Aplicaciones actuales de las Enzimas microbianas
3.1. Enzimas catalíticas
3.1.1. Amilolíticas; degradación de almidón
Son enzimas microbianas responsables de la degradación de almidón, han sido
ampliamente utilizadas en los diferentes procesos industriales; es así como, dichas
enzimas se emplean en la producción de jarabes, dextrinas, edulcorantes y en la
panadería (Fennema et al. 2010).
3.1.1.1. α- Amilasas
Es una endoenzima responsable de reducir rápidamente el peso molecular de los
polímeros de almidón, es utilizado para el procesado de almidón y se caracteriza
por tener tres dominios en el interior de la proteína; el primero le sirve para la
catálisis, el segundo como sitio de unión del almidón y el tercero une el calcio y une
los anteriores dominios. Su tamaño oscila entre 50 a 70 kDa; el producto final son
dextrinas ramificadas (Fennema et al. 2010).
3.1.1.2. β- Amilasas
Es una glicosidasa de tipo exo e inversor responsable de liberar unidades de
maltosa de las cadenas de amilasa y mezclarlas con dextrinas β límite, su tamaño
es de 30 y 160 kDa. Son enzimas únicas ya que poseen un solo dominio a
diferencia de las demás enzimas (Fennema et al. 2010).
3.1.1.3. Ciclomaltodextrina glucanotransferasa
Estas son endoenzimas que se encargan de catalizar reacciones de hidrólisis o de
transglicosilación inter e intra moleculares, de tipo conservador con cinco dominios
proteicos y tamaño alrededor de los 75 kDa. Como producto final de su reacción
se producen ciclodextrinas hexa, hepta u octoligómeros (Fennema et al. 2010).
3.1.1.4. Glucoamilasa
La glucoamilasa o amiloglucosidad es una enzima de tipo exo, de inversión
encargada en la hidrólisis de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor
del almidón, este, a diferencia de la pululanasa actúa solo sobre el enlace α-1,4
glucosídico, produciendo tan solo glucosa. Su tamaño oscila entre los 37 y 112 kDa
y se las puede encontrar principalmente en Aspergillus y Rhizopus (Fennema et al.
2010).
3.1.1.5. Pululanasa
 Son enzimas desramificadoras o dextrinasas límite ya que hidrolizan dextrinas en
los enlaces α-1,4 y α-1,6 que forman parte de la ramificación de la amilopectina; se
caracterizan por actuar sobre el pululano y como producto final se obtiene
glucooligosacáridos pequeños. Dichas enzimas se obtienen particularmente de
Kleibsiella y Bacillus (Fennema et al. 2010).
3.1.2. Proteasas; degradación de proteínas
Son usadas para quitar restos biológicos de la ropa, varios detergentes añaden en su
fórmula enzimas como proteasas. Estas enzimas poseen estabilidad en condiciones de
lavado que incluyen la presencia de varios agentes oxidantes, surfactantes y en algunos
casos altas temperaturas. Las Proteasas pueden clasificarse convenientemente según
sus actividades y grupos funcionales.
3.1.2.1. Serina-proteasas
Son endopeptidasas que poseen serina reactivo y pH optimo a 7.
3.1.2.2. Subtilisina
La subtilisina es una enzima que posee actividad proteasas, es decir, elimina
proteínas. Al ser obtenida de Bacillus subtilis, esta enzima posee un aminoácido
metionina que es apto para ser oxidada, pero tambien disminuye la actividad
catalítica. (Martínez y García, 2014).
3.1.2.3. Carboxipeptidasa A
Carboxipeptidasa A del páncreas de bovino, ayuda en la eliminación de
aminoácidos C que proceden de sustratos polipéptidos tales como la fenilamina
(Antigua, 2014).
3.1.3. Lipasas; degradación de grasas
Las enzimas procedentes de las lipasas catalizan la hidrolisis para digregar lípidos en
productos de origen vegetal y animal (Thieman y Palladino, 2010).
4.1.3.1 Fenoloxidasas
Estas enzimas son dependientes de actividad oxidativa de microorganismos. En la
formación de humus se polimerizan fácilmente, además, son excelentes
biocatalizadores en la fase de oxidación de quinonas. Sin embargo, existen casos como
Phanerochaete chrysosporium que proporcionan parte de la degradación de
compuestos clorados (Sanchez et al., 2011).
3.1.4. Lactasas; degradación de la leche
Algunos tipos de quesos requieren de cepas de origen bacteriano tales como
Lactococcus lactis, L. acidophilus para realizar procesos de coagulación. Estas
bacterias degradan una proteína conocida como caseína y usan la enzima lactasa para
eliminar los azucares de que se encuentran en la leche, que a menudo son empleadas
para realizar la fermentación (Thieman y Palladino, 2010). En la producción de quesos
 encontramos una enzima proteolítica conocida como quimosina, se obtiene a partir del
abomaso de las vacas jóvenes (Moral, Ramírez & García, 2015). Además, en la
fabricación de quesos industriales una de las enzimas más utilizadas es la proteinasa,
obtenida a partir de Rhizomucor sp que es parecida a la quimosina. Esta enzimas es
termoresistente y termolábil por lo que se rompe en su etapa de calentamiento (Morillo
et al., 2015). Se usan porque estas enzimas poseen altos grados de especificidad,
además sus periodos de crecimiento microbiano son cortos (Khademi, Abachi y
Malekzadeh, 2013). Gran parte de las enzimas coagulantes son de origen fúngica tales
como Thermomucor indicae-seudaticae, Mucor circinelloides y Rhizomucor
nainitalensis (Morillo et al., 2015).
3.1.5. Celulasas y hemicelulasas; degradación de celulosa
A la celulosa, en la naturaleza, la encontramos en forma de un polisacárido de fácil
degradación para hongos y bacterias. Muchos hongos aeróbicos son los principales
degradadores de celulosa tales como: Trichoderma reesei y Aspergillus niger. Además
de Neurospora sp y algunos hongos para la alimentación (Gutiérrez, Pérez y Uribe,
2012). A partir de estos hongos se han obtenidos productos que poseen un sistema
enzimático de células, las cuales degradan la celulosa a glucosa y celobiasa.
Trichoderma reesei se caracteriza por degradar la celulosa, además, es resistente a
reactores químicos e inhibidores de pH bajo. Además, los mecanismos de acción
enzimática que muestra Trichoderma reesei determina modelos parecidos de
regulación de genes (Gutiérrez, Moreno y Montoya, 2015). El potencial de las enzimas
celulíticas además, se centra en la producción de zumos de fruta, así como en la
producción de cuero las cuales se derivan de Trichoderma reesei y Aspergillus niger
que eliminan el pelo y la piel de tejidos y ablandar la indumentaria de vestir para un
fácil manejo (Gutiérrez, Pérez y Uribe, 2012).
3.2. Enzimas sintetizadoras
3.2.1. Celulasas y hemicelulasas; en procesos de fermentación
Dentro de la fermentación denotamos el uso de enzimas y procesos microbianos que
tienen como objetivo el producir bebidas y productos como yogur, queso, pan y vino
(Cavicchioli et al., 2011 y Mganga, Razavi y Kuzyakov, 2015). Para la creación de vino
y cerveza varias técnicas necesitan cepas de levaduras como es el caso de
Saccharomyces cerevisae. En el caso de la fabricación de vino se utiliza enzimas
celulasa derivadas de Oenococcus oeni una bacteria que es responsables de
transformar el sabor agrio del ácido málico a un sabor dulce de ácido láctico. Para el
yogur, se utilizan cepas de microrganismos anaerobios que proceden del ácido láctico,
tal es el caso de Streptococcus thermopilus, Lactococcus lactis y una última cepa de
Lactobacillus bulgaricus (Thieman y Palladino, 2010)
 3.2.2. Penicilina acilasas; producción de penicilina.
La penicilina fue el primer antibiótico utilizado a gran escala en humanos y fue
descubierto de Penicillum notatum un hongo que impide el crecimiento de la bacteria
Staphylococcus aureus. La gran mayoría de los antibióticos se aíslan de bacterias, y la
mayor parte de esta materia inhibe el crecimiento de otras bacterias. Además, en la
actualidad tenemos antibióticos que derivan de bacterias o arqueas tales como Bacillus
subtilus que se encuentra en el antibiótico Bacitracina o Streptomyces erythraeus que
está en Eritromicina (Thieman y Palladino, 2010).
3.3. Enzimas termoestables
Son enzimas capaces de soportar incrementos de temperatura sin que lleguen a
desnaturalizarse, existen algunos casos del uso de enzimas termoestables, pero hay
demasiado uso por el momento, a pesar de las continuas investigaciones de las que objeto.
La posibilidad de resistir incrementos de temperatura es ideal para reacciones que requieran
de energía en forma de calor (Zapata, Castellanos, 2014).
3.3.1. Tac polimerasa
Una de las primeras y más famosas enzimas para la PCR es conocida como Taq ADN
polimerasa. Taq se obtiene de Thermus aquaticus, una especie que se desarrolla en
fuentes de agua caliente, además su ADN polimerasa se transforma a tal punto que
aguanta muy altas temperaturas. Como Taq es estable a altas temperaturas, puede
tolerar los cambios de temperatura necesarios sin desnaturalizarse. Una de las ventajas
del PCR es su capacidad para aumentar millones de copias de ADN partiendo de un
pedazo muy pequeño de material vivo (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).
4. Perspectiva futuras de las Enzimas Microbianas
4.1. Búsqueda de enzimas lipolíticas termófilas
Las investigaciones microbiológicas se ven cada vez más impulsadas por la diversidad de
soluciones que los microorganismos proveen a numerosos escenarios, es por ello que en
el futuro se vislumbra un sinfín de usos de microorganismos para resolver de manera
satisfactoria y controlable los problemas que se presenten. Pero para lograr resolver los
problemas primero es necesario contar con los medios necesarios. Las enzimas
microbianas tienen una variedad enorme de usos, pero condiciones que limitan su uso y
eficacia son factores físico y químicos, tales como la elevada temperatura de reacción
(Zapata, Castellanos, 2014). Es en base a esto que se busca usar microorganismos
termófilos, por tener una alta estabilidad a altas temperaturas, pH extremos y agentes
desnaturalizantes (López, 2015). En un estudio en la zona geotermal de Calientes, en el
Perú, se llevó a cabo un muestreo en fuentes termales con temperaturas entre 60-88 ºC, un
pH entre 7,1-7,5 (Zapata, Castellanos, 2014). Se usaron muestras de tapetes microbianos
 y biopelículas Se determinó la actividad cualitativa y cuantitativa de la celulasa, la biomasa
celular, cuantificación de proteínas solubles y se extrajo el ADN.
Se encontró un alto grado de heterogeneidad entre las poblaciones de las bacterias
celulolíticas termófilos, se notó la actividad de la celulasa, con cepas que mostraron gran
actividad de endoglucanasas, enzima que actúan en la degradación de la celulosa.
Obtuvieron el valor óptimo de pH 5,9 y temperatura 67,5 °C, dando un valor maximizado de
actividad enzimática de endoglucanasas de 0,56 UI ml (Zapata, Castellanos, 2014). Esta
investigación arroja un resultado interesante para la biotecnología y la industria, tal como
en la cepas obtenidas las “características fisicoquímicas son favorables para el desarrollo
de microorganismos productores de celulasas (Zapata, Castellanos, 2014). Pudiendo ser
usadas a la temperatura de 70 °C y pH neutro, que facilitan que bacterias esporógenas y
actinomicetos incrementen su actividad (Granados, Valderrama, 2003).
La diversidad de microorganismos que pueden ser usados por sus enzimas termófilas es
bastante variado, en este caso podemos analizar la construcción de dos cepas productoras
de enzimas lipoliticas de Thermus thermophilus, todo esto se hizo usando un sistema de
expresión en la levadura Saccharomyces cerevisiae (López, 2015). Las enzimas usadas
fueron la esterasa y la lipasa, la esterasa fue clonada y exhibió una actividad óptima a los
40ºC y un pH superior a 7, la producción de la cepa de levadura recombinante,
Saccharomyces cerevisiae, fue 10 veces mayor en la actividad extracelular a lo usual para
Thermus thermophilus en el caso de la lipasa no se mostró actividad lipolítica en el medio
extracelular, a pesar de que si mostro actividad fosfatasa superior al grupo de control
(López, 2015).
Si usamos el enfoque de enzimas microbianas que sean funcionales, podemos ligarnos al
hecho de que estas pueden ser optimizadas. Es por ello que debemos conocer la posibilidad
de optimizar enzimas, para ello analizaremos un experimento donde se buscó el
mejoramiento de la termoestabilidad (Jofré, 2012). Tal como nos dice Jofré (2012) “Se
diseñó una estrategia basada en la dinámica de la estructura enzimática que permite la
proposición de mutaciones rigidizantes de regiones flexibles en la estructura de una
enzima.”. En este experimento se simulo el comportamiento de la enzima a temperaturas
de 27ºC, 77ºC y 127ºC (Jofré, 2012). A partir de esto se determinó la funcionalidad en
diferentes enzimas, se encontraron 5 enzimas para una mutación que mejoraba la
termoestabilidad (Jofré, 2012).
4.2. Microrganismos y la degradación de plaguicidas
El impacto de los plaguicidas son bien conocidos, pero un tratamiento eficaz para su
degradación o eliminación son bastante cuestionables, es por ello que los microrganismos
son una respuesta eficaz para este problema. Gran cantidad de plaguicidas son usados
actualmente, en este caso hablaremos de los plaguicidas N-metilcarbamatos, usados para
 eliminar insectos, ácaros, nematodos, hongos y malezas en diferentes cultivos (Castellanos,
Rache, 2013). Las enzimas carbamato hidrolasas pueden actuar sobre una gran cantidad
de sustratos y en diferentes condiciones (Castellanos, Rache, 2013). En la investigación
analizaron las enzimas carbamato hidrolasa, estas enzimas actúan la hidrolisis primaria de
carbofuran, aunque existen otras enzimas que actúan para que se complete la degradación
pero no se conocer aún, es por ello que el autor habla sobre el análisis de diferentes
microrganismos para identificar las diferencias entre enzimas carbamato hidrolasas y su
funcionamiento (Castellanos, Rache, 2013).
Se reconocen 2 rutas para la degradación de los N-metilcarbamatos, una es la vía oxidante
y la otra es la vía hidrolítica (Castellanos, Rache, 2013). Pero existe un gran problema con
la vía catabólica oxidante, ya que al darse el proceso se producen metabolitos que son aún
más tóxicos que los N-metilcarbamatos; afortunadamente la hidrolisis es el mecanismo
primario para la degradación de N-metilcarbamatos, cuando ocurre la hidrolisis del enlace
carbamato se pueden dar dos resultados, el rompimiento del enlace éster o un rompimiento
del enlace amida (Castellanos, Rache, 2013). Sea cual sea el resultado después de la
hidrolisis será carbofuran 7-fenol, el cual es menos toxico que el carbofuran, también
metilamina la cual fuente de carbono o nitrógeno para cartas bacterias que hidrolizan suelos
(Castellanos, Rache, 2013). Por ello no se puede estancar el uso de estas enzimas, puesto
que generar degradadores de compuestos xenobióticos, solubilizadores de fosfato, fijadores
de nitrógeno y controladores biológicos, entre otros toman un papel preponderante para ser
usadas con interés agrícola, ambiental y para la salud humana (Castellanos, Rache, 2013)
4.3. Usos de enzimas celulolitica en la industria.
La alimentación es extremadamente importante y su mejoramiento es transcendental para
el ser humano, por ello analizaremos un uso de enzimas celulolítica en la industria pecuaria,
ya que la alimentación en esta industria ocupa un enorme porcentaje de gastos, alrededor
del 80 % (López, 2013). El uso de microrganismos que tengan enzimas celulolíticas es un
apartado en esta industria que se encuentra fuera del foco por el momento, para este caso
se los uso un microrganismo el cual produjo la enzima en una medio especifico con
temperatura constante de 39ºC (López, 2013).Se puso a prueba la enzima colocándola 60
minutos antes en los alimentaos que iban a ser ingeridos por los individuos (López, 2013).
Se usaron diferentes grupos, en los cuales había un grupo de control, alientos con enzimas,
y alimentos sin enzimas. (López, 2013). Al analizar los metabolitos en la sangre se constató
que la glucosa tenía mejores resultados pero para los otros metabolitos (proteínas,
queratina, colesterol, calcio y fósforo) no se obtuvieron estos resultados favorables. (López,
2013).
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