Departamento de Biotecnología

Escuela de Industria Alimentaria y Biotecnología

Análisis microbiológico de agua.

Práctico Nº4
Nicolás Figueroa, Joaquín Rivas, Luciano Sau, Macarena Yañez

Fecha: 26 de diciembre de 2017

RESUMEN

El agua para beber debe cumplir con diversas normas para que esta no provoque algún tipo
de enfermedad o infección al momento de ingerirla, dado que el agua es un medio de
difusión de agentes patógenos (provocando un potencial peligro para la salud pública) es
necesario analizar los microorganismos que están presentes en el agua a utilizar. En el
presente práctico experimental se utilizaron diversas técnicas de estudio. Una de ella es la
de filtración por membrana determinándose que no existió en la muestra un crecimiento de
coliformes totales expresando el resultado como colonias incontables debido a un error
experimental. Por otra parte se utilizó el método de los tubos múltiples (número más
probable), en dicho ensayo se estudia la capacidad que tienen los coliformes de fermentar
la lactosa con producción de gas. Los resultados fueron 4 tubos positivos para la muestra
de 10 ml de agua clorada en los 5 tubos de caldo lauril triptosa, 1 tubo positivo para la
muestra de 1 ml y 1 tubo positivo para la muestra de 0,1. Dicho resultado nos otorgó un
código (4,1,1), el cual fue buscado en la tabla de NMP y arrojó el valor de 27 coliformes por
cada 100ml de agua. En el procedimiento experimental se logró adquirir el conocimiento
para la aplicación de distintas técnicas de análisis microbiológico del agua con el fin de
estipular si cumple o no la norma establecida.

Palabras Claves: Agua, coliformes, norma, microorganimos, número mas probable, filtración
por membrana.

1 Introducción denominaba coliformes fecales. El cambio de

El crecimiento de la población a nivel mundial
y el aumento del uso del agua para diferentes
actividades, ha incrementado los niveles de
contaminación. Esta contaminación está
relacionada con los vertidos de origen
doméstico e industrial a los cuerpos de agua.
En el caso de los residuos de origen
doméstico, la carga contaminante está
representada por altos porcentajes de materia
orgánica y microorganismos de origen fecal.
Estos microorganismos son causantes de
enfermedades de origen hídrico, que generan
altos porcentajes de morbi-mortalidad en la
población. El control de la calidad
microbiológica del agua de consumo y de
vertido, requiere una serie de análisis dirigidos
a determinar la presencia de microorganismos
patógenos(1). Dentro de los microorganismos
patógenos se encuentran el grupo de
bacterias coliformes el cual está conformado
por dos subgrupos: los coliformes totales y los
termotolerantes. A estos últimos antes se los
nombre se debe a que se demostró que en el
grupo de coliformes que se detectaban en
siembras incubadas a temperaturas de 44,5
°C y en medios de cultivo específicos, sólo
una parte del grupo eran bacterias de origen
fecal; el resto eran bacterias ambientales. Se
les puso entonces el nombre de bacterias
coliformes termotolerantes debido a la alta
temperatura de incubación (44,5 °C) en la cual
se obtenía un óptimo desarrollo. En el grupo
de bacterias termotolerantes está incluida la
Escherichia coli, considerada como un
organismo indicador de contaminación fecal (2).
Se ha demostrado que esta bacteria siempre
está presente en un número elevado en las
heces de humanos y animales de sangre
caliente y comprende casi 95% de los
coliformes en las heces(3). Por esta razón, la
contaminación de origen fecal puede ser
evaluada mediante la determinación de
coliformes termotolerantes o mediante la
presencia de E. coli.

Laboratorio de Microbiología e Inmunología 1 | Page


Los objetivos propuestos en esta experiencia
son conocer los parámetros microbiológicos
que debe cumplir el agua dependiendo de su
uso, aplicar la técnica de filtración por
membrana para agua clorada y la técnica del
numero mas probable en agua clorada y de
canal.
2 Materiales y Métodos
2.1 Materiales
Los materiales utilizados en esta experiencia
fueron muestras de agua clorada y de canal,
un equipo de filtración, el cual consistía en una
trampa de agua entre la bomba de vacío y un
matraz receptor del filtrado, membrana,
embudo, tubos con caldo lauril triptosa (o
caldo lactosado), tubos con caldo bilis lactosa
brillante y por ultimo tubos con caldo EC.
2.2 Técnica de filtración por membrana.
Para realizar esta experiencia primeramente
se tomo una membrana, con una pinza
esterilizada, para luego colocarla sobre el
portafiltro del equipo de filtración, luego se
agrego agua tamponada (humedeciendo la
membrana) para realizar la filtración bajo
vacío. Posteriormente en una probeta estéril
medimos 100 ml de la muestra a filtrar,
vaciándola en dentro del embudo. Luego se
realizo la filtración de la muestra bajo vacío
parcial, para posteriormente lavar el embudo
con el filtro de membrana, con
aproximadamente 30 ml de agua de dilucion
estéril, luego se saco el embudo y de manera
inmediata se llevo el filtro a una placa Petri
con agar mEndo LES (dejando la parte
cuadriculada hacia arriba). Por ultimo se
realizo la respectiva incubación de la placa en
posición invertida en un ambiente húmedo
durante aproximadamente 24 horas a 35ºC.
Luego de la incubación antes mencionada se
realizo la verificación de desarrollo de
colonias.
2.3 Método de los tubos múltiples (NMP).
Dicho método se basa en la capacidad que
tienen los organismos coliformes de fermentar
la lactosa con producción de gas,
primeramente se realizó la siembra de 5 tubos
con caldo lauril triptosa con 10 ml de agua
clorada, también se realizó la siembra de 1
tubo con caldo lauril triptosa con 1 ml de la
muestra de agua clorada y finalmente se
realizó la misma siembra mencionada
anteriormente pero esta vez con 0,1 ml de la
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muestra de agua clorada. Paralelamente se
realizó la misma siembra antes mencionada
pero esta vez en una cantidad mayor de tubos
(5 por cada volumen de la muestra). Luego de
las siembras respectivas se realizó la
incubación de los tubos durante 48 horas a
35ºC aproximadamente. Posteriormente se
realizó el recuento de aquellos tubos que
presentaban un enturbiamiento del medio de
cultivo y formación de gas de mas del 40%, si
dichos tubos presentaban las características
mencionadas se consideraban como
positivos.Adicionalmente con el número de
tubos positivos determinamos el numero mas
probable de bacteria coliformes por 100 ml a
través de la tabla NMP.
2.4 Método de los tubos múltiples (NMP),
Ensayo confirmativo.
Los tubos que obtuvieron un resultado
positivos fueron sometidos a un ensayo
confirmativo, el cual consistió en la
transferencia a través de una asa de anillo de
una pequeña cantidad de muestra a otro tubo,
el cual contenía caldo bilis lactosa verde
brillante (BVB, utilizado para realizar la
confirmación de coliformes totales),
adicionalmente se realizo la misma siembra
antes mencionada pero esta vez a un tubo con
caldo EC (utilizado para realizar la
confirmación de coliformes fecales), por ultimo
se realizo la incubación a 35ºC y a 44ºC
aproximadamente, para los tubos con caldo
bilis lactosa verde y caldo EC,
respectivamente. Luego de esta incubación se
realizo nuevamente el recuento de aquellos
tubos que presentan turbidez y formación de
gas, para finalmente determinar el numero
mas probable de bacterias coliformes por 100
ml.
3 Resultados y Discusiones
Los resultados obtenidos en esta experiencia
corresponden a el número más probable de
bacterias coliformes por 100 ml antes del
ensayo confirmativo y después de dicho
ensayo, adicionalmente también se obtuvo el
resultado de la técnica de filtración por
membrana.
3.1 Resultados técnica de filtración por
membrana.
Tras haber realizado los procedimientos para
la técnica de filtración por membrana, y luego
de analizar los resultados obtenidos, se
determinó que no hubo crecimiento por parte
de coliformes totales ni coliformes fecales (Fig.
1), lo cual es muy raro, debido a que
generalmente debería haber algún crecimiento
de microorganismos, por lo mismo es que se
infiere que debe haberse producido algún
error experimental, sobre todo con respecto al
manejo de la membrana, probablemente la
cantidad de agua filtrada no fue la suficiente, o
bien algún error instrumental, como por
ejemplo, la membrana no se encontraba en
buenas condiciones como para retener los
microorganismos presentes en el agua. Es por
esto que el resultado de este experimento se
puede expresar como Incontables colonias,
ya que no se puede distinguir ninguna colonia
presente.
Fig. 1 Imagen correspondiente a la membrana
en placa Petri, en donde no se observa
crecimiento de ningún tipo de colonia.
3.2 Resultados obtenidos en los tubos con
caldo lauril triptosa o caldo lactosado.
Como se logra observar en la tabla 1 se
obtuvieron 4 tubos positivos para la muestra
de 10 ml de agua clorada en los 5 tubos de
caldo lauril triptosa, 1 tubo positivo para la
muestra de 1 ml y 1 tubo positivo para la
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muestra de 0,1. Dicho resultado nos otorgó un positivo (BVB) positivos (EC)
código (4,1,1) el cual al buscarlo en la tabla 10 4 0
NMP nos entrego el resultado de bacterias 1 1 0
coliformes por 100 ml, el cual corresponde a 0,1 1 0
27 coliformes por 100 ml.

Como se logra observar en la tabla 4, en el

Tabla 1 Resultados obtenidos en la muestra
de agua clorada.
Cantidad Tubos con
Volumen (ml)
de tubos resultado positivos
10 5 4
1 1 1 coliformes por 100 ml, el cual corresponde a
0,1 1 1
Como se logra observar en la tabla 2 se
obtuvieron 4 tubos positivos para la muestra
de 10 ml de agua clorada en los 5 tubos de
caldo lauril triptosa, 2 tubos positivo para la
muestra de 1 ml y ningún tubo positivo para la
muestra de 0,1. Dicho resultado nos otorgó un
código (4,2,0) el cual al buscarlo en la tabla
NMP nos entregó el resultado de bacterias
coliformes por 100 ml, el cual corresponde a
22 coliformes por 100 ml.
Tabla 2 Resultados obtenidos en la muestra
de agua de canal.
Cantidad Tubos con
Volumen (ml)
de tubos resultado positivos
10 5 4
1 5 2 las muestras de agua clorada y agua de canal
0,1 5 0
3.3 Resultados obtenidos en el ensayo
confirmativo.
Como se logra observar en la tabla 3, en el
ensayo confirmativo con caldo bilis lactosa
verde brillante para la muestra de agua
clorada se obtuvieron los mismos resultados
anteriores (4,1,1) lo que nos indica la
presencia de 27 coliformes totales por 100 ml.
Adicionalmente en el ensayo confirmativo con
caldo EC ningún tubo presento un resultado
positivo, lo que nos indica la presencia de 0
coliformes fecales por 100 ml.
Tabla 3 Resultados obtenidos en la muestra
de agua de clorada. (tubos con caldo bilis
lactosa verde brillante y caldo EC)
ensayo confirmativo con caldo bilis lactosa
verde brillante para la muestra de agua de
canal se obtuvieron 4 tubos positivos para la
muestra de 10 ml y 1 tubo positivo para la
muestra de 1 ml, los cuales nos otorgaron un
condigo (4,1,0), el cual al buscarlo en la tabla
NMP nos entregó el resultados de bacterias
17 coliformes totales en 100 ml.
Adicionalmente en el ensayo confirmativo con
caldo EC solo un tubo presento un resultado
positivo, obteniendo un código de 1,0,0 , dicho
código al buscarlo en la tabla NMP nos
entregó un valor de 17 coliformes fecales en
100 ml.
Tabla 4 Resultados obtenidos en la muestra
de agua de canal. (tubos con caldo bilis
lactosa verde brillante y caldo EC)
Tubos con Tubos con
Volumen
resultado resultado
(ml)
positivo (BVB) positivos (EC)
10 4 1
1 1 0
Según los resultados obtenidos, el análisis de
indicaron que en ambas se encontraban
coliformes totales, y solo en la muestra de
agua de canal se encontraron coliformes
fecales, lo cual hace bastante sentido, debido
a que en teoría el agua de canal es mucho
mas sucia que el agua clorada que ya ha sido
tratada con diferentes procedimientos. Lo que
es extraño es el número de coliformes totales
presentes en la muestra de agua clorada, lo
que indica que es un agua medianamente
contaminada, llevándonos a inferir que lo mas
probable es que haya habido alguna
contaminación entre las muestras de agua
clorada y de canal, debido a que es inusual
que dicha agua tratada presente niveles tan
altos de coliformes totales.
4 Conclusiones

Volumen Tubos con Tubos con En el presente práctico experimental se logró

(ml) resultado resultado conocer los parámetros microbiológicos

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establecidos que debe cumplir el agua
estudiada dependiendo su uso, según el IN
para poder cumplir con la norma y no sea
rechazada. Además se logró aplicar diversas
técnicas de estudio o análisis, como lo son la
técnica de filtración por membrana para agua
clorada, y la técnica del número más probable
en agua clorada y no clorada. Ambas con la
finalidad de determinar si el agua analizada
cumple con los parámetros para poder ser
utilizada en diversas actividades.

Referencias

(1) American Public Health Association-American Water Works Association (1999). Standard Methods
for the Examination of Water and Wastewate.
(2) J. Rodier, Análisis de las aguas, Omega, Barcelona, (1989).
(3) H.G. Schlege, General Microbiology, Cambridge University Press, Cambridge, (1987).
F.A. Skinner y J.M. Shewan, Aquatic Microbiology, Academic Press, New York, (1977).

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