Informe 2 Cultivo Lote Alimentado Aireado

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE INGENIERÍA
AGROINDUSTRIAL
NFORME N° 2
TEMA:
CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO
CURSO:
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
GRUPO:
C-2
PROFESOR:
Ing. AUGUSTO CASTILLO CALDERON
ALUMNOS:
 OSORIO DURAN ALEXANDER

 PARIA CABALLERO MILAGROS
 QUILICHE VERAMENDEZ WILDER
 QUISPE CIUDAD JUNIOR
 TERRONES ROSALES RUTH
Nvo. Chimbote-Perú
2017
E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
INFORME N° 02
TÍTULO: CULTIVO CELULAR POR LOTES ALIMENTADO (CLA) CON AIREACION

Y ALIMENTACION CONSTANTE UTILIZANDO UNA CEPA DE Saccharomyces
cerevisiae ATCC 4126
RESUMEN
El presente trabajo está referido al desarrollo del inóculo y cultivo celular por
lote alimentado con aireación y alimentación constante de Saccharomyces
cerevisiae ATCC 4126, desarrollado por alumnos en el laboratorio de
Bioprocesos.
Para este trabajo se contó con cepas de Saccharomyces cerevisiae ATCC

4126, la cual fue tomada de un medio en el cual se encontraba inactivada. Se
procedió a preparar un determinado medio de mantención, activación y
fermentación. Seguido fue la activación y acondicionamiento de la cepa
Saccharomyces cerevisiae.
La experiencia consistió en obtener la cinética de crecimiento de

Saccharomyces cerevisiae. Este proceso se realizó en un matraz en Shaker,
por 11 horas. Evaluando parámetros como consumo de sustrato (sacarosa),
densidad óptica. Se observó cómo se va produciendo el crecimiento celular del
Saccharomyces con los nutrientes de los medios y como va disminuyendo el
sustrato, la Sacarosa (principal fuente de carbono). Y esto fue posible
determinarlo mediante las lecturas de absorbancia (640 nm) en el
espectrofotómetro y con las prueba de determinación de azúcares reductores –
DNS, absorbancia de 540 nm.
El monitoreo de la cinética de crecimiento de microorganismos es de gran

importancia, en especial la de Saccharomyces cerevisiae, por sus tantas
aplicaciones, ayudando así a obtener productos con la calidad o características
deseadas u optimizar procesos.
LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 1

I. INTRODUCCIÓN:
Las levaduras son importantes para la ciencia desde hace 200 años
(recordemos por ejemplo, a Louis Pasteur, considerado padre de la enología
moderna, y que realizó grandes descubrimientos acerca de las
fermentaciones). La importancia tecnológica de estos microorganismos es
evidente: llevan a cabo reacciones de importancia crucial para la elaboración
de productos como el vino o la cerveza. Sin embargo, con el desarrollo de la
genética, la biología molecular y el estudio de los genomas, las levaduras se
han convertido en herramientas de experimentación en laboratorio. Ejemplo de
ello es que la levadura Saccharomyces cerevisiae que se utiliza para la
elaboración del pan, la cerveza y el vino ha sido el primer organismo eucariota
completamente secuenciado, en un proyecto llevado a cabo por un programa
internacional. Las industrias que utilizan esta levadura para la alimentación o
para la producción de medicamentos o de vacunas estaban interesadas en
obtener los resultados de esta secuencia para intentar mejorar sus
procedimientos de producción.
Al hablar de Saccharomyces, es inevitable pensar en la gran utilidad práctica

de la levadura en la vida del hombre, desde tiempos antiguos. Fue tal vez un
descubrimiento casual de nuestros predecesores y que actualmente
agradecemos profundamente. La realidad de la alimentación que conocemos
actualmente, fermentada, es una realidad histórica, basada en el tipo de
agricultura que implementaron nuestros antepasados mesopotámicos. Pero en
muchas partes del mundo los seres humanos controlan fermentaciones de
productos sólidos o líquidos, y las especies de levaduras implicadas no son
siempre las mismas.
Saccharomyces cerevisiae es un hongo ambiental levaduirforme, unicelular,

sus células son ovoides y se reproduce por gemación, miden entre 5 y 10
micras, vienen estado aislado hasta que adquieren el tamaño necesario para
dividirse, taxonómicamente pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase
Hemiascomycetes, del orden Saccharomycetales y de la familia de las
Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le permite crecer tanto en condiciones
de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann, 2005).

Además posee alta actividad metabólica, por lo que en la fase aerobia se

caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por
la producción de etanol, fermentando alrededor del 90% del medio. Es
importante la fase aeróbica, ya que la levadura presenta una fase de
adaptación para producir las enzimas necesarias (tipo invertasa) que le
permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la
fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y
sólo el 2% se asimila como material celular (Sánchez, 2010).
En el transcurso de la fermentación hay 4 fases de crecimiento: 1) lag o de

adaptación en el que no hay incremento en el número de células, sino que se
adaptan al medio y en ocasiones sintetizan enzimas o componentes
estructurales; 2) exponencial o log, donde las células se reproducen sin
limitación de de sustancias nutritivas a velocidad máxima y toman sustratos,
excretando productos metabolizados; 3) estacionaria, que es la etapa donde el
crecimiento celular desciende o para completamente ya que se han
transformado las sustancias nutritivas, el sustrato se ha metabolizado y las
condiciones el medio se han modificado y la 4) muerte, en donde las células
mueren, debido a que su reserva de energía se ha agotado (Sánchez, 2003).
Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción

de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y
etanol durante el proceso de fermentación (Feldmann, 2005).
En esta práctica se monitoreó el crecimiento de Saccharomyses cerevisiae en

un medio determinado. La preparación de medios para el desarrollo de
procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la
productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los
efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en
los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de
formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de
metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante que los
microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que
pueden necesitar.

II. OBJETIVOS:
2.1 OBJETIVOS GENERALES:
1. Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lote

alimentado (CLA) con alimentación constante utilizando una cepa
de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Diseño del medio de cultivo.
2. Activación celular y desarrollo del inóculo.
3. Identificar y describir las partes, accesorios y geometría,
conocimiento de la operación del fermentador, esterilización,
carga, descarga y toma de muestras.
4. Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y
control automatico, asi como la calibración de los sensores.
5. Puesta en marcha del CLA. En el cultivo por lote determinar
µmax y Yx/s
6. Obtener los perfiles de masa celular, fuente de C y O2 disuelto
a través del tiempo total de fermentación en el bioreactor.
7. Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitado.
8. Determinar Yx/s y Qx del CLA.

III. MARCO TEORICO
CRECIMIENTO MICROBIAL
Para la obtención de datos confiables, la evaluación del crecimiento microbial

requiere la normalización de métodos experimentales. En un cultivo por lotes,
después de proveer las sustancias nutritivas al fermentador y suministrar los
materiales y la energía requeridos para la síntesis de biomasa, se inocula el
medio con una cantidad determinada de células viables con lo que el cultivo se
desarrolla sin intercambio de materiales con los alrededores, excepto por la
transferencia de gases tales como aire, dióxido de carbono e hidrógeno.
El desarrollo de un cultivo por lotes bajo condiciones fisicoquímicas adecuadas

en un sustrato simple y homogéneo (cSi), libre de gradientes de concentración
y de sustancias inhibitorias, donde las células se reproducen a intervalos
regulares, puede representarse mediante una curva típica, en la cual se
observan las diferentes etapas representativas de los cambios de la biomasa
(X) y de su ambiente.
Curva de crecimiento microbial
El período de latencia (lag) (A), es el período de adaptación de la célula a los

cambios de su ambiente fisicoquímico. Puede ser el tiempo requerido para
desactivar un inhibidor presente en el medio, o el tiempo de germinación de un
inóculo de esporas.

En el período de crecimiento acelerado (B), la velocidad aumenta desde cero

hasta un valor máximo.
En el período de crecimiento exponencial (C), las células se reproducen, en un

medio sin limitación de sustancias nutritivas, a la máxima velocidad compatible
con el conjunto de condiciones existentes.
En el período de desaceleración (D), la velocidad disminuye al limitarse la

disponibilidad de sustancias nutritivas.
El período estacionario (E) se produce cuando se agota una sustancia nutritiva.
El período de muerte o decaimiento (F) ocurre en aquellos cultivos, en

condiciones de inanición, por la formación de enzimas autolíticas. En algunos
cultivos puede apreciarse un período de crecimiento críptico, producido por las
sustancias nutritivas liberadas por el citoplasma de las células lisadas.
VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO
En los procesos de fermentación los microorganismos desarrollan su actividad

vital en medios de elevada complejidad. El agente responsable de la
transformación es una célula viva que asimila diversos materiales, se
reproduce y produce otras sustancias, algunas de interés económico. Uno de
los aspectos más importantes del estudio de la cinética de estos procesos es la
selección de los métodos analíticos seguros para evaluar confiablemente las
sustancias consumidas y producidas por el microorganismo y la variación de su
concentración con el tiempo.
La concentración de células en el medio constituye una medida adecuada de la

concentración del sistema enzimático responsable de la transformación. Por
esta razón las velocidades crecimiento, consumo de sustrato y de formación de
producto, generalmente se expresan como velocidades específicas referidas a
la concentración de células activas.

Velocidad específica de crecimiento
Velocidad específica de consumo de sustrato
Velocidad específica de formación de producto
INFLUENCIA DE ALGUNAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE LA

VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO
Temperatura
La temperatura afecta la velocidad de las reacciones celulares, la naturaleza

del metabolismo, los requerimientos nutricionales y energéticos y la
composición de la biomasa. Generalmente los microorganismos crecen en un
intervalo de temperatura ambiente entre 25 y 30ºC, aunque existen
microorganismos que se desarrollan a temperaturas inferiores a 0ºC y otros a
temperaturas superiores a 93ºC.
El requisito fundamental es la presencia de agua líquida. En la Antártida existen

bacterias que se reproducen a 7ºC, pero que se desarrollan a mayor rapidez a
temperaturas entre 20 y 30ºC, (Pelczar, 1977). En la siguiente tabla se
presenta una clasificación de los microorganismos en función de la
dependencia de la velocidad de crecimiento con la temperatura.

Temperatura (ºC)
Grupo Mínimo Óptimo Máximo
Termófilos 40 – 45 55 – 75 60 – 80
Mesófilos 10 – 15 30 – 45 35 – 47
Psicrófilos -5 – 5 15 – 18 19 – 22
obligados
Psicrófilos -5 – 5 25 – 30 30 – 35
facultativos
Energía de activación
En el intervalo adecuado de temperatura, se estimula inicialmente el

crecimiento de los microorganismos. Cuando es demasiado alta, los destruye.
La ecuación de Arrhenius constituye una hipótesis apropiada para describir el
efecto de la temperatura sobre el crecimiento:
Donde, m EF es la velocidad efectiva de crecimiento que es igual a la velocidad

de síntesis menos la velocidad de muerte; A, AD son los factores de frecuencia;
EA es la energía de activación para el crecimiento, y es la energía necesaria
para llevar las moléculas a un estado energético en el cual puedan reaccionar;
ED es la energía de activación para la muerte térmica; R es la constante de los
gases, y T la temperatura absoluta.
La aplicación de la ecuación de Arrhenius a un proceso microbiológico es un

procedimiento cinético formal. Sin embargo, la complejidad del crecimiento
microbial, entendido como una secuencia de reacciones, permite prever
desviaciones de este comportamiento.

pH
En muchos procesos de fermentación aerobia y anaerobia, el pH del medio de

cultivo cambia como respuesta a la actividad microbial: se genera H + durante la
demanda de NH4+; se consume H+, en el metabolismo de NO3- y en la
utilización de aminoácidos como fuente de carbono. Estos cambios muestran la
necesidad de determinar y controlar el pH de un cultivo, usualmente mediante
la adición de ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y una de las bases: hidróxido
de sodio, de potasio o de amonio; al medio. Se prefiere el amoníaco gaseoso
en lugar del hidróxido de amonio, por la posibilidad de contaminación de éste
con esporas bacterianas. La concentración del ion hidrógeno puede afectar en
gran medida el crecimiento celular y, si el pH no está regulado, se debe
considerar como un factor inhibitorio
MEDIOS DE FERMENTACION
La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es

una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Como ya se explicó, los componentes de los medios constituyen los efectores

externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los
procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de
formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de
metabolitos y para el mantenimiento celular.
No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de

los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las
siguientes categorías de componentes:
a. Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que están

representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg;
b. Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn,
Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos
o microgramos por litro; y

c. Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por

componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son
sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a
estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas,
algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc.
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los

componentes, en
1. Medios sintéticos o medios químicamente definidos.
2. Medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen
animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz,
harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya
mencionadas, pero que son químicamente indefinidas y de composición
variable.
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer
lugar el diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los
mismos.
Diseño
El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los

componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos
correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en
cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el
proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos
nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la
disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias
primas. Otros aspectos que son también importantes se refieren a todos los
procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de fermentación y al
conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de
algunos productos.

Requerimientos nutricionales
Los requerimientos nutricionales están determinados por el tipo de

metabolismo celular, ya sea autotrófico, que corresponde a los
microorganismos que obtienen el carbono del C0 2 como las algas y algunas
bacterias, y los heterotróficos que necesitan compuestos orgánicos como
fuente de carbono. Otro factor esencial está determinado por las condiciones
del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 0 2 es uno de los oxidantes más
comunes en el metabolísmo energético. En la ausencia del 0 2, el N03 o S04 son
utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias
metanogénicas son auxótrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el C02 a
CH4 para obtener energía. Otras protistas obtienen su energía, en condiciones
anaerobias por reacción de óxido-reducción realizadas sobre compuestos
orgánicos. Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de
energía.
Otro requerimiento nutricional está constituido por las fuentes de nitrógeno que
pueden ser de naturaleza inorgánica u orgánica. El nitrógeno es utilizado para
la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular.
Para la síntesis de proteína se requieren en general L-aminoácidos, aunque

también son necesarios algunos aminoácidos de la serie D como D-alanina y
D-aspártico para su incorporación a la pared de las células. En algunos casos
se requieren también póptidos de histidina.
Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son

suministrados en forma de P04H y S04 (o aminoácidos azufrados). El fósforo se
incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la
síntesis de aminoácidos azufrados, y además se necesita para la biotina,
coenzima A, tiamina y otros componentes.
Los requerimientos de K y Mg son también esenciales. Una parte importante

del primero está unida al RNA de manera que los requerimientos de K
aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las células,
como la velocidad de crecimiento. El ión K actúa como coenzima y
probablemente actúa como esencial para la estabilidad de los ribosomas y

actua como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K

como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y
sulfato.
Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorías:
1) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como

Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y
2) Los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni,
As, Se, Mo, Sn, e I. En general los requerimientos de trazas de
elementos son conocidas cualitativamente.
A veces es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque
generalmente está presente en suficiente cantidad como impureza de los
componentes principales. Los requerimientos de éstos compuestos pueden
aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por
ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor óptimo.
Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos

aminoácidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido
pantotético, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras
factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento
celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas.
Otros factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, cte.
En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte

de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los
requerimientos específicos del proceso considerado.
Materias primas fundamentales
Los componentes empleados en la industria de fermentación son generalmente

complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de
los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composición química. Si
tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el
60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentación, se hace
prioritario disminuir el costo de los medios.

Las materias primas más importantes corresponden a fuentes de carbono y de

nitrógeno.
Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hidratos de carbono como glucosa o

dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina; 2) Alcoholes como el glicerol y
manitol; y 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros. Son muy
importantes también por su disponibilidad y costo reducido otras materias
primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas,
suero de queso, etc. También se pueden emplear otros subproductos o
efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son
interesantes para algunos procesos como las vinazas de destilería, alpechín y
residuos sulfiticos, que son sin embargo solamente útiles para procesos de
producción de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen
hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los
microorganismos, también contienen muchas impurezas que impiden su
utilización en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan
las operaciones de separación y purificación de los productos.
Las fuentes de nitrógeno de naturaleza inorgánica más comunes son el

amoníaco o las sales de amonio. Las orgánicas están representadas por varios
productos, como ser: 1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que son
obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas fuentes proteicas como
carne de diferentes órganos y animales, pescado, caseína, gelatina, harina de
soja, algodón, girasol, etc.. Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y
variando tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño de la cadena de
polipéptidos. Aparte de su función como fuente nitrogenada, las peptonas
aportan algunas vitaminas y sales inorgánicas como fosfatos y suministran
también algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu. 2) Extracto de carne,
que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior variando su tipo
de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extracción y temperatura de la
misma. 3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y
puede ser obtenida mediante autólisis o plasmólisis de la levadura, es
básicamente una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en H2O
y carbohidratos. 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la
malta de la cebada y 5) "Cornsteep", el agua de maceración de la industria del

maíz tiene mucha importancia por su utilización como componente esencial de

los medios para la producción de varios antibióticos y enzimas.
Es muy importante también la correcta elección de una determinada fuente

cuando se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben
considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que
puede acompañar a las distintas materias primas utilizadas.
Formulación
La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es
decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser
utilizadas.
Una primera aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las

diversas fuentes lo da el conocimiento de la composición de biomasa del
microorganismo a ser empleado. Una composición elemental y típica de la
biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 1-
3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.4-1%. Es decir, que si queremos formular un medio
para producir una determinada cantidad de biomasa debemos promover las
distintas fuentes que aseguren como mínimo las cantidades de elementos que
deben ser suministrados. La composición de un medio mínimo basado en este
principio, que además tiene en cuenta los requerimientos de las fuentes de
energía.
Por el conocimiento de la estequiometria de crecimiento y de formación del

producto, es posible formular adecuadamente un medio. Aunque este tema se
tratará en el capítulo 5 es conveniente adelantar aquí algunos aspectos
necesarios.
En general podemos escribir para cualquier proceso de fermentación:
Fuente de C + Fuente de N + 02 + Minerales + nutrientes específicos --->

biomasa + productos + C02 + H20.

Conservación de la calidad nutriente
Como ya dijimos anteriormente, los medios de fermentación utilizados en la

industria son casi siempre complejos y a menudo con sólidos en suspensión,
de manera tal que los cambios que se producen durante la esterilización
pueden ser importantes. A veces puede haber modificaciones beneficiosas o
perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización.
Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilización 50 a 60 min se

producen pérdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al
medio normal. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min
se puede producir un efecto beneficioso.
La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de

un medio, durante la esterilización por calor, dependerá no solamente de la
naturaleza de los componentes sino también de la temperatura, duración del
calentamiento, pH del medio, y de la agitación. Un ejemplo típico de interacción
es la reacción de Maillard que tiene lugar entre los grupos carbonilos de los
azúcares con los grupos amino de proteínas, aminoácidos, etc. Se forman así
productos de condensación con lo cual se inactivan significativas cantidades de
carbohidratos y nitrógeno amínico. Por ese motivo es necesario que los
carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados
orgánicos.
Las sales de NH4+ se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no el amonio se

volatiliza.
En medios químicamente definidos se puede observar pérdida importante de

magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por precipitación de sales poco
solubles como MgNH4PO4, MgKP04 y MgNaP04. Es importante por lo tanto
autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de los fosfatos.
Los aminoácidos y factores de crecimiento son muy lábiles al calor. Entre los
aminoácidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre las vitaminas
hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son las más susceptibles de
sufrir descomposición. En todos estos casos es aconsejable disolverlas

separadamente en pequeños volúmenes de H2O y luego esterilizarlas por

filtración.
Como ya dijimos es fundamental, además de esterilizar correctamente los

medios, conservar al máximo la calidad nutriente de los mismos. En la misma
forma que la inactivación de microorganismos puede ser considerada una
reacción cinética de primer orden, también la destrucción de algunos
compuestos sensibles al calor puede ser tratada en la misma forma.
LEVADURAS
Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de hongos,

incluyendo tanto especies patógenas para plantas y animales, como especies
no solamente inocuas sino de gran utilidad. De hecho, las levaduras
constituyen el grupo de microorganismos más íntimamente asociado al
progreso y bienestar de la humanidad.
Las levaduras tienen importancia económica, social y de salud en la

culturahumana. A menudo, las levaduras han sido referidas como los primeros
organismos “domesticados”, debido a que la fermentación para la producción
de vinos representa, probablemente, la primera biotecnología
Algunas especies de levaduras del género Saccharomyces son capaces de

llevar a cabo el proceso de fermentación, propiedad que se ha explotado desde
hace muchos años en la producción de pan y de bebidas alcohólicas, y que a
su vez ha inspirado un sinnúmero de obras de arte que ensalzan al Dios del
vino y a aquellos que disfrutan su consumo. Desde el punto de vista científico,
el estudio de las levaduras como modelo biológico ha contribuido de manera
muy importante a elucidar los procesos básicos de la fisiología celular.
Dentro del género Saccharomyces, la especie cerevisiae constituye la levadura

y el microorganismo eucariote más estudiado. Este organismo se conoce
también como la levadura de panadería, ya que es necesario agregarla a la
masa que se utiliza para preparar el pan para que este esponje o levante; de
hecho el término levadura proviene del latín levare, que significa levantar.

SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Saccharomyces cerevisiae es una

levadura, un hongo unicelular, del grupo de
los ascomicetos. Este grupo incluye a más
de 60000 especies, entre ellas las trufas,
las colmenillas o el Penicillium, el hongo
que produce la penicilina, pero también a
hongos patogénicos tanto de plantas como
de animales, el más conocido de los cuales
es Candida. En la naturaleza se encuentra
sobre sustratos ricos en azúcares o en los
exudados y savias dulces de algunas
plantas. El término "levadura" (de "levare"
en la acepción de subir o levantar) remite a la experiencia visual de la masa del
pan que se "levanta" cuando se añade levadura a la harina.
Saccharomyces cerevisiae es un hongo ambiental levaduirforme, unicelular,

sus células son ovoides y se reproduce por gemación, miden entre 5 y 10
micras, vienen estado aislado hasta que adquieren el tamaño necesario para
dividirse, taxonómicamente pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase
Hemiascomycetes, del orden Saccharomycetales y de la familia de las
Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le permite crecer tanto en condiciones
de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann, 2005).
Además posee alta actividad metabólica, por lo que en la fase aerobia se

caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por
la producción de etanol, fermentando alrededor del 90% del medio.
Es importante la fase aeróbica, ya que la levadura presenta una fase de

adaptación para producir las enzimas necesarias (tipo invertasa) que le
permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la
fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y
sólo el 2% se asimila como material celular (Sánchez, 2010).

Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción

de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y
etanol durante el proceso de fermentación (Feldmann, 2005).
La fisiología de las levaduras es definida como el entendimiento de su

crecimiento y metabolismo. En términos generales explica cómo las levaduras
interactúan con su medio biótico y abiótico, específicamente explica cómo las
levaduras se alimentan, metabolizan, crecen, se reproducen y finalmente
mueren. La biotecnología de levaduras se define como el uso de la fisiología de
levaduras (Walker, 1998). A continuación se hará una revisión sobre los
aspectos más importantes sobre la nutrición y metabolismo de las levaduras.
NUTRICIÓN DE LEVADURAS
El término nutrición de levaduras se refiere a cómo las levaduras se alimentan;

de forma específica involucra dos aspectos: requerimientos nutricionales y la
adquisición de los nutrientes. El entendimiento de los requerimientos
nutricionales y las estrategias de adquisición de nutrientes, junto con la
regulación del transporte de nutrientes es importante no sólo para el cultivo de
las levaduras en el laboratorio, sino también para la optimización del proceso
de fermentación industrial.
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
Los compuestos orgánicos e inorgánicos en un medio de cultivo desempeñan

funciones de activadores o inhibidores para el crecimiento, su efecto dependerá
de su naturaleza y de las concentraciones en el medio de cultivo. Cada
levadura presenta requerimientos nutricionales diferentes, sin embargo, es
posible generalizar sobre sus requerimientos de la siguiente forma: carbono,
hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo, oligoelementos y factores de
crecimiento.

CARBONO
Las levaduras son organismos quimioorganotróficos porque obtienen la energía

y el carbono de compuestos orgánicos. Estos compuestos son generalmente
azúcares, de los cuales la glucosa es la más empleada en levaduras; sin
embargo, no es el azúcar más efectivamente metabolizable para todas ellas,
debido a que no se encuentra libre de forma natural en sus hábitats. Además,
la glucosa generalmente ocasiona efectos inhibitorios y de represión en la
asimilación de otros azúcares. Las levaduras pueden asimilar azúcares
(hexosas, pentosas, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos, polisacáridos),
alcoholes, ácidos orgánicos, ácidos grasos, hidrocarburos y compuestos
aromáticos.
Una pequeña proporción (5%) de sus requerimientos de carbono pueden ser

incorporados del dióxido de carbono.
GLUCOSA
La glucosa es un monosacárido con fórmula empírica C6H12O6, la misma que

la fructosa pero con diferente posiciones relativa de los grupos–OH y O=. Es
una hexosa, es decir que contiene seis átomos de carbono y es una aldosa,
esto es el grupo carbonilo está en el extremo de las moléculas, es una forma
de azúcar que se encuentra libres en las frutas y en la miel.
SACAROSA
La sacarosa tiene la fórmula C12H22O11 que pertenece a un grupo de hidratos

de carbono llamados disacáridos. Es el azúcar normal de mesa, extraída de la
remolacha azucarera o de la caña de azúcar, es soluble en agua y ligeramente
soluble en alcohol y éter.
SULFATO DE AMONIO
El sulfato de amonio y sulfato diamónico son las sales más utilizadas como
fuente de nitrógeno, ya que aportan, al mismo tiempo, azufre y fósforo que la
célula necesita. El ión amonio es empleado por las levaduras para la formación
del ácido glutámico, que actúa como donador de un grupo amino para la
síntesis de otros aminoácidos para la célula (Aguilar, 1998). La asimilación y

utilización de nitrógeno amoniacal y nitrógeno amino pueden variar según la

levadura utilizada, ya que puede ser afectada por numerosos factores como la
aireación y la concentración de glucosa, entre otras. Por otro lado, el ion sulfato
aporta el azufre necesario para maximizar el crecimiento de las levaduras.
FOSFATO DE AMONIO
El fosforo es esencial para las células de levaduras para su incorporación en

moléculas estructurales, los ácidos nucleicos y sus metabolitos fosforilados.
Levaduras también pueden almacenar fosforo en la vacuola, en forma de
fosforo ortofofato polimérico común mente disponible para la levadura en forma
de ortofosfato inorgánico. Que metabolizan muy rápidamente para el transporte
de nucleótidos trifosfato, en la levadura se produce contra un transporte de
concentracion en contra de un gradiente de concentración y por lo tanto se
activa. También depende de la presencia en la de un sustrato fermentable
exógeno como la glucosa, pero sustratos respirables como acetato o etanol
que no son compatibles con la absorción de fosfato. En s. Cerevisiae, al menos
tres sistemas se cree que translocan ortofosfato. En s. cerevisiae es concebible
que los bajos ylos sistema de alta afinidad pueden operar simultanea mente
dependiendo sobre la disponibilidad de fosfato, de hecho la absorción de
fosfato pueden ser controlados por la concentración de ortofosfato intracelular.
ADQUISICIÓN DE NUTRIENTES
Para que las levaduras puedan cumplir con sus funciones, no solo es
importante que en el medio de cultivo se tengan los compuestos necesarios,
sino que la levadura sea capaz de adquirir estos nutrientes del medio y guarde
un equilibrio con el mismo. El transporte de azúcares en levaduras ha sido
estudiado por muchos años, debido a la importancia biotecnológica de esto en
fermentaciones industriales. Así, se conoce que la velocidad de formación de
etanol está limitada por la velocidad de transferencia de azúcares al interior de
la célula (Walker, 1998).

Las levaduras, generalmente, transportan preferentemente la glucosa; sin

embargo, las membranas celulares no son permeables a azúcares, por lo que
existen varios mecanismos para la translocación de la glucosa y otros
sacáridos; por ejemplo: en S. cerevisiae se conocen 20 transportadores de
hexosas que difieren en su abundancia y afinidad para ciertas hexosas
(Kruckeberg, 1996).
Aunque cada levadura es diferente se pueden realizar ciertas generalidades

con respecto al transporte de azucares:
a. La glucosa es tomada en contra de un gradiente de concentraciones.

b. Los transportadores de glucosa son estéreo específicos para ciertas
hexosas, y pueden transportar glucosa, fructosa y manosa.
c. El transporte de glucosa alcanza el equilibrio y no es acumulativo.
d. Los transportadores de glucosa facilitan la difusión libre.
e. Durante el transporte no hay consumo de energía.
f. La fosforilación acompaña a la glucosa al entrar a la célula.
TRANSPORTE DE NITRÓGENO
Las levaduras no pueden fijar el nitrógeno atmosférico, pero son capaces de

trasportar y utilizar compuesto de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno
generalmente tienen una función anabólica de proteínas estructurales y
enzimas funcionales. Algunas fuentes de nitrógeno pueden ser catabolizadas
inmediatamente a la entrada de la célula. Las fuentes favorables de nitrógeno
para maximizar el crecimiento de levaduras son los iones de amonio, glutamato
y glutamina. Todas las levaduras son capaces de usar el amonio como una
fuente de nitrógeno y sales de amonio.

IV. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL:
Empleando la técnica de batch alimentado (BA) o fed batch. Esta técnica

se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente
medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que
se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar
la velocidad de crecimiento () del microorganismo.
El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento

celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del
sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la
poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados.
Así, este método se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de
inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de
biomasa.
ESQUEMA
Donde F(t): caudal de alimentación
Sr(t): concentración de sustrato de la alimentación

Vf: volumen final de trabajo
Vo: volumen al inicio de la alimentación
Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación
So: concentración de sustrato limitante al inicio de la
alimentación
El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que V o, Xo y

So son las condiciones finales de dicho batch.
Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante

el empleo de caudales variables (F = F (t)), o bien mediante la variación
de la concentración de sustrato limitante (Sr=Sr (t)). En el caso del

Trabajo Práctico se utilizará el sistema más simple, es decir F=cte. y

Sr=cte.
F(t)
SR(t)
Vf, Xf
VR = Vf - V0
V0, X0, S0
RESERVORIO BOMBA
BIORREACTOR
Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las

condiciones halladas.
S0'
X.V = X0.V0 + F.SR.YX/S.t
X0.V0 µ < µmax
X.V
µ = µmax
X0'.V0' S0 = 0
BATCH t = t0 BATCH ALIMENTADO t
Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el

cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta
que tanto F como Sr sean constantes. Es claro que en caso de ser F =
F(t) y/o Sr = Sr(t), dicha funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para
resolver las ecuaciones planteadas.

4.1 DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO
Para diseñar el medio de cultivo se realizará de acuerdo a los alcances

que nos proporciona la guía de práctica, en el cual podemos conocer los
requerimientos del microorganismo, para su mantención, activación y
para la fermentación del cultivo por lote alimentado.
El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección

de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación
de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto
se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el
microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son
los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos
específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y
consideraciones sobre las materias primas.
Para el diseño se debe considerar:
 Usar Sustrato limitante: SACAROSA( C12H22O11).

 Duración aproximada de 4 a 6 horas de la etapa de CLA.
 Usar el bioreactor automatizado Biostat – A Plus recipiente de 2
litros.
 Control de pH usando electrodo y unidad de control.
 La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y limitado.

COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y

CULTIVO PARA Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126
4.1.1 MEDIO SOLIDO DE MANTENCION (YM solido)
Tabla 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención

(50 mL)
Peso (g)
Nutriente Concentración (g/l)
Para 50 mL
Extracto de
3 0.15
Levadura
Peptona 5 0.25
Extracto de Malta 3 0.15
Agar 20 1.00
Glucosa 10 0.50
Procedimiento: Preparar el medio de mantención, según la tabla Nº1 para

el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.
 Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de
cultivo de mantención para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.
 Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 anterior se pesan las cantidades
requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, con la ayuda de la
balanza analítica.
 Medir 50 ml de agua destilada, en una probeta graduada.
 Mezclar todos los compuestos ya pesados en un matraz Erlenmeyer, y
después agregar los 50 ml de agua destilada.
 Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando
constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de
la primera burbuja, a partir de lo cual se controla 2 minutos.

 Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 6-7ml de la

mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente
taparlos, esperar 1 hora.
 Colocar los tubos en un vaso de precipitado previa cobertura con cartón, y
llevarlos a la olla a presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el
intercambio de gases.
 Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a partir de ello
controlar 20 minutos, finalizando la esterilización.
 Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla, luego
colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.
4.1.2 MEDIO DE ACTIVACION
Tabla 02: Concentración de Nutrientes para un medio de activación

(15 mL)
Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)

Sacarosa 5 0.075
Extracto de levadura 3 0.045
Extracto de malta 5 0.075
Solución de sales 5 ml/L 0.075 ml
75ul
Procedimiento: Preparar el medio de activación, según los la tabla Nº2

para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.
 Pesar los componentes descritos en la tabla Nº2

 Prepara 15 ml de medio de activación en un matraz de 50ml (separando
fuente de carbono, extracto de levadura y malta, y sales).
 Se esterilizan por separado el extracto de levadura y malta en un tubo de

ensayo (hasta 5 ml con agua destilada), la sacarosa en un matraz de 50
ml; esto para evitar la reacción entre estos dos componentes; y por

último las sales en otro tubo de ensayo (hasta 5 ml. De agua destilada),
por un tiempo de 15 min, contando desde la primera burbuja.
 Luego de enfriar, mezclar todo en el matraz en torno al mechero con

todas las indicaciones de asepsia, y después llevar al Shaker por un
tiempo de 10h; 35°C y 200rpm.
4.1.2 MEDIO DE FERMENTACION

 Para un volumen de medio: 30% del volumen del matraz.
 Para una concentración final: g/l.
TABLA 03, 04 y 05: Concentración de Nutrientes para el medio de

fermentación
TABLA 03
Peso (g)
Para 100 mL
Sacarosa 4.26 0.426
Extracto de
1.8 0.18
Levadura
(NH4)2 SO4 1.67 0.167
KH2 PO4 0.35 0.035
Mg SO4 7H2O 0.16 0.016
Solución de sales 5ml/L 0.50
Tampón Citrato
100 ml/L 10 ml
pH 4,2
TABLA 04

Nutriente Fuente % S(g/l)

Elemento
Nutriente
C 42.11% 3.85g/l
C12H22O11
(NH4)2SO4 N 21.21% 0.76
(NH4)2SO4 S 24.24% 0.0165
KH2PO4 P 22.79% 0.09
KH2PO4 K 28.68% 0.157
MgSO4.7H2O Mg 19.86% 0.073
 Limitante: Fuente Nitrógeno.
Procedimiento: Preparar el medio de fermentación, según la tabla Nº4

para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.
 Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 4

 Disolver completamente cada compuesto con agua destilada de la siguiente
manera:
 Sacarosa en un matraz con agua destilada + 15ml de medio de

activación.
 (NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + solución de sales en un
tubo con 10 ml. de agua destilada.
 Extracto de levadura en un tubo con 10 ml de agua destilada
 Esterilizar las diluciones por separado durante 15min. contando

desde la primera burbuja.
 Terminada la esterilización dejar enfriar.
FERMENTACIÓN DEL CULTIVO

Inocular el caldo (medio rico + biomasa) a un matraz conteniendo medio

de fermentación, para la adaptación del crecimiento
Durante el desarrollo del cultivo, para las evaluaciones del crecimiento

de biomasa, tomar una muestra inicial, al que se le mide la absorbancia
y se centrífuga, guardando el sobrenadanante en viales y la masa
sedimentada en capachos que serán expuestos a la estufa.
Una vez iniciado el crecimiento de biomasa se manipula el flujo de

alimentación de tal manera que en tiempos determinados, se provoque
en el comportamiento del crecimiento.
Luego se llevará a cabo la alimentación; luego, una segunda

fermentación que se realizará en el fermentador de 2000 ml.
A. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE SALES CONCENTRADAS (1L)

 Pesar las correspondientes sales que conforman nuestra solución de
sales concentradas para sepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC
4126.lo cual se muestra en la guía de Práctica de Bioprocesos:
Tabla 05 Composición de la solución de sales 100 veces concentrado,

utilizadas en los medios de cultivo en g/l

CaCl2.2H2O 1.12
ZnSO4.7H2O 0.11
FeSO4.7H2O 0.06
CuSO4.5H2O 0.05
CoCl2.6H2O 0.01
MoO3 0.0005
MnCl2.6H2O 0.027
NaCl 0.28
 Cada compuesto se pesara con cuidado.

 Luego de pesar, cada compuesto lo diluiremos con agua destilada en un
vaso de precipitado adicionándole 100 ml de agua destilada con la
ayuda de un agitador de vidrio, la solución se colocara en una fiola de 1
litro y se enrazara con agua destilada hasta completar 1litro.
 Una vez realizado el preparado se llevara a refrigeración para su

posterior utilización.
B. ESTERILIZACIÓN DE PIPETAS
 Las pipetas, serán lavados y secados en la estufa
 Luego en cada pipeta se colocara un filtro de algodón para no
contaminarlo al momento de ser utilizada.
 Las pipetas serán forradas con papel aluminio y puestas a la estufa por
un tiempo 20 minutos a temperatura de 140-150 º C.
C. TÉCNICA DE ASEPSIA
Se usara en los días en que hay sembrado e inoculación de células.

 Para realizar la inoculación es necesario y muy importante tener el

lugar bien desinfectado, por lo que se limpiara con paños de algodón
toda la zona de trabajo hasta 3 veces, así como también el total
acomodo de las herramientas de trabajo (tubos de ensayo y gradilla)
a utilizar, etc.
 Los tubos de ensayo y los matraces que serán utilizados en el medio
rico primero serán lavados, secados y esterilizados en la estufa por
un tiempo 20 minutos a temperatura de 140-150 º C.
D. INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN

Para la inoculación partimos de la cepa incubada en medio sólido de
mantención (Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.)
 Tomar una azada e inocular en un matraz con 20 ml del medio de
activación, con la ayuda del mechero.
 Tapar el matraz que contiene el medio de activación con un tapón de
gasa y algodón.
 Llevar al Shaker a 200 rpm, Tº = 35ºC y un t=10 horas hasta alcanzar
un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la
turbidez del medio.
E. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS

(ÁCIDO DINITROSALICÍLICO)
La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:
 10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)

 200 ml/l de NaOH 2N
 300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en

aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido
DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se
agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para
posteriormente aforar hasta un litro.

Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra:
1. Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a

analizar.
2. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5
minutos para luego dejar enfriar.
3. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada.
4. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
5. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia
en la curva de calibrado.
6. La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras
de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.
F. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse
la concentración de microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente
por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta determinación es necesario que
previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las
concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por
peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:
1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm.

Durante 20 minutos.
2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua
destilada.
3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar
restos de sustrato que pudieran alterar la determinación.
4. Se elimina el sobrenadante, se redisuelve el precipitado y se seca en la
estufa a 80 ºC hasta peso constante.

CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES
Plan de Muestreos y Registro de Datos
Grupo:
Día:
Microorganismos: Fuente Carbono:
Nombre del
Nº HORA TIEMPO Abs.(640 nm) Observaciones
alumno y grupo
01 0
02
03
04
05
06
Nombre del
CLA HORA TIEMPO Abs.(640 nm)
alumno y grupo
01
02
03
04
05
06
07

V. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
Material Biológico: Cepa liofilizada de Saccharomyces cerevisiae

ATCC 4126
5.1 PREPARACIÓN DE SÓLIDO DE MANTENCIÓN:

5.1.1 Materiales y Equipos:
 Balanza analítica
 Matraz Erlenmeyer de 250 ml.
 Mechero Bunsen
 Gradilla
 6 Tubos de ensayo con tapas.
 Pipeta de 10 ml.
 Vaso de precipitado.
 Cocina a gas
 Olla a presión.
 Varilla de vidrio
 Guantes.
 Espátula
3.1.2 Reactivos y nutrientes:
 Agua destilada.
 Extracto de levadura.
 Peptona.
 Extracto de malta.
 Agar.
 Glucosa.

5.2 PREPARACIÓN DE MEDIO DE ACTIVACIÓN:

 2 Matraz de 125 ml.
 Una probeta de 100ml
 Micropipeta
 Estufa
 Algodón
 Gasa
 Espátula

 Sacarosa
 Extracto de levadura
 Extracto de malta
 Solución de sales
 Agua destilada
 Alcohol
5.3 PREPARACIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN:

 Matraz de 1 L
 2 Matraces de 125 ml.
 Gasa y algodón
 Papel aluminio – capachitos.
 pHmetro.


 Sacarosa
 (NH4)2SO4
 Solución de sales
 KH2PO4
 MgSO4.7H2O
 Extracto de Levadura
 Agua destilada
 Alcohol
5.4 INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN:

5.4.1 Materiales y equipos
 Matraz de 125 ml.
 Algodón
 Gasa
 Agua destilada
 Aza bacteriológica
 Shaker
 Mechero Bunsen, trípode y rejilla
5.5 RESIEMBRA CELULAR (Solido - sólido )

 Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O.
 Mechero Bunsen, trípode y rejilla.
5.6 ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO

 Matraz de 125 ml.
 Algodón

 Gasa
 Agua destilada
 Shaker
 Mechero Bunsen, trípode y rejilla
5.7 DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA

BIOMASA
 Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación

 Espectrofotómetro
 pHmetro
 Gasa y algodón
 Centrifuga
 Tubos de ensayo
 Capachos de papel aluminio
5.8 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR

DENSIDAD ÓPTICA:
 Espectrofotómetro.
 Centrífuga.
 Estufa.
5.8.2 Reactivos
 Muestra del medio.
 Agua destilada.

5.9 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL

DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO)
 Espectrofotómetro.
 Agitador magnético.
 Mechero bunsen.
 Espátula.
 Papel aluminio – capachitos.
 2 Vasos de precipitado de 1 litro
 Matraz de aforo de 1 litro.
 Pipeta.
 Gradilla
5.9.2 Reactivos
 10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)
 200 mL / L de NaOH 2N
 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
 Sacarosa Estándar
5.10 INSTRUMENTOS
Balanza analítica
La balanza analítica es una clase de balanza utilizada principalmente
para medir pequeñas masas. Este tipo de balanza es uno de los
instrumentos de medida más usados en laboratorio y de la cual
dependen básicamente todos los resultados analíticos. Las balanzas
analíticas modernas, que pueden ofrecer valores de precisión de
lectura de 0,1 µg a 0,1 mg, están bastante desarrolladas de manera
que no es necesaria la utilización de cuartos especiales para la
medida del peso. Aun así, el simple empleo de circuitos electrónicos
no elimina las interacciones del sistema con el ambiente. De estos,

los efectos físicos son los más importantes porque no pueden ser
suprimidos.
Shaker
Tiene como función agitar los recipientes, en este caso, matraces de

distintos volúmenes con sus respectivos tampones para evitar el
despilfarro de soluciones, pudiendo modificar el número de las
revoluciones y la temperatura. También pueden tener movimientos
de balanceo o vibraciones. Se emplean para mover cultivos
celulares. A veces tienen un control termostático adicional. El
movimiento puede ser orbital o de balanceo.
Mechero Bunsen
Es un instrumento utilizado en los laboratorios científicos para
calentar o esterilizar muestras o reactivos químicos. El quemador
tiene una base pesada en la que se introduce el suministro de gas.
De allí parte un tubo vertical por el que el gas fluye atravesando un
pequeño agujero en el fondo de tubo. Algunas perforaciones en los
laterales del tubo permiten la entrada de aire en el flujo de gas
(gracias al efecto Venturi) proporcionando una mezcla inflamable a
la salida de los gases en la parte superior del tubo donde se produce
la combustión, muy eficaz para la química avanzada.
pHmetro
Es un sensor utilizado en el método electroquímico para medir
el pH de una disolución. La determinación de pH consiste en medir
el potencial que se desarrolla a través de una
fina membrana de vidrio que separa disoluciones con diferente
concentración de protones. En consecuencia se conoce muy bien la
sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio durante el
pH. Una celda para la medida de pH consiste en un par
de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de mercurio) y otro
de vidrio, sumergidos en la disolución de la que queremos medir el
pH. La varita de soporte del electrodo es de vidrio común y no
es conductor, mientras que el bulbo sensible, que es el extremo

sensible del electrodo, está formado por un vidrio polarizable (vidrio

sensible de pH).
Espectrofotómetro
Sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre
valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de
radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden
en una muestra. También es utilizado en los laboratorios de química
para la cuantificación de sustancias y microorganismos.1Hay varios
tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica, de
absorción molecular (que comúnmente se conoce como
espectrofotómetro UV-VIS), y no debe ser confundido con un
espectrómetro de masa. Este instrumento tiene la capacidad de
proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y
medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra.
Incubadora
Dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos
microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora mantiene
la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado óptimo,
tales como el contenido dedióxido de carbono (CO2) y de oxígeno en
su atmósfera interior.
Autoclave
Una autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para

esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta
presión y temperatura, evitando con las altas presiones que el agua
llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento de la
autoclave es que coagula las proteínas de los microorganismos
debido a la presión y temperatura, aunque recientemente se ha
llegado a saber de algunas formas a celulares, tal como los priones,
que pueden soportar las temperaturas de autoclave.

Bioreactor
Es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
biológicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un
recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que
involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas
derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o
anaeróbio. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos, variando
en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son
usualmente fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser
también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células
o tejidos en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se
encuentran en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos. En
términos generales, un birreactor busca mantener ciertas
condiciones ambientales propicias (pH, temperatura, concentración
de oxígeno, etcétera) al organismo o sustancia química que se
cultiva. En función de los flujos de entrada y salida, la operación de
un birreactor puede ser de tres modos distintos:
 Lote (batch)
 Lote alimentado (fed-batch)
 Continuo o quimiostato
Unidad de control
El diseño compacto de la unidad de control centraliza todos los

componentes, tales como:
 Sistema electrónico de control y medida.

 Bombas con cabezales expuestos.
 Sistemas de control de temperatura oxígeno, espuma. Control
automático de proceso de pH, pO2, velocidad de agitación,
mezcla de gas, nivel de espuma y bomba de sustrato.
Todo en una sola carcasa, ayudando especialmente en el ahorro de

espacio. Los sistemas pre configurados para las aplicaciones

microbianas o de cultivo celular facilitan la selección y permiten un

inicio rápido y sin complicaciones en el laboratorio. El sistema
incluye además un potente ordenador portátil para el control del
biorreactor así como el software BioPAT® MFCS/DA para la
adquisición y evaluación de los datos. El software de control puede
adquirirse también por separado para poder utilizar los ordenadores
ya disponibles.
Figura 1: Biorreactor con unidad de control compacta acoplado al

tanque de agitación y ordenador para control de datos.
Simple y control automático de aireación
El sistema de aireación de la BIOSTAT® A plus proporciona control de

flujo continuo sobre el rango de cada gas utilizado.
Sólo tiene que conectar el tubo de aireación, configurar de manera

pulsada cuenta con una boya flotante en la que se regula el flujo de aire
que ingresara al bioreactor este se mide en el centro de la circunferencia
y va desde 0.42 a 4.2 .
Para aplicaciones de cultivo celular, interfaces para cuatro gases (aire,

O2, CO2 y N2) están disponibles para la OD y el control del pH. La

versión microbiana cuenta con dos líneas de gas (aire y O2) para el
control del OD.
Figura 2: Colocación de los conductos Figura 3: Sistema de control

de silicona esterilizables en la unidad de manual de flujo de aire.
control
 Operación:
El equipo “Fermentador automatizado Biostat – A Plus de 3 litros” es

operado desde el software que es accionado desde la laptop, donde
podemos fijar las condiciones como pH, temperatura, velocidad de
agitación, reflujo de agua.
Y para el caso específico de darle la aireación se tiene el compresor de

aire de diafragma, que es modulado por el centro de control en el
rotámetro donde controlamos el flujo de aire.
 Esterilización:
Se esteriliza todo el fermentador menos los sensores, se coloca en el

autoclave por 2 horas aproximadamente.
 Carga y descarga:
Para cargar primero se toman las condiciones de asepsia para evitar

cualquier contaminación, luego se coloca un embudo, previamente ya
esterilizado, sobre uno de los agujeros en la tapa del fermentador y se

inocula el medio de fermentación con el medio de activación vaciando en

el fermentador.
 Toma de muestras:
Las muestras son tomadas por succión, por el conducto para tomar
muestras, un tubo hueco. Las muestras se van a tomar a un nivel entre
los dos rotores.
Con la jeringa se succiona 5ml de muestra y se vacía en el tubo de

ensayo; luego se cierra el conducto a presión con las pequeñas prensas.
Antes de tomar la muestra se debe sacar con la jeringa 3ml, que son los
que se contienen en el conducto.
SENSORES:
Sensor de temperatura:
 Función:
Es un sensor de temperatura que a 0 °C tiene 100 ohms y

que al aumentar la temperatura aumenta su resistencia
eléctrica. Este sensor PT100 es el corazón sensible a la
temperatura de cualquier termómetro de resistencia. El
incremento de la resistencia de la PT100 no es lineal pero
si creciente y característico del platino de tal forma que
mediante tablas es posible encontrar la temperatura exacta
a la que corresponde. En un extremo está el elemento
sensible (Sensor RTD) y en el otro está el terminal eléctrico
de los cables protegido dentro de una caja redonda de aluminio
(cabezal).

Sensor de pH:
 Función:
Para realizar la medición de pH se usan

básicamente los sensores electroquímicos
translucen la actividad química del ión de
hidrógeno en una señal eléctrica. Los
componentes básicos de un sensor
electroquímico son un electrodo de trabajo
(que detecta), un contra electrodo y generalmente también un electrodo
de referencia. Estos se encuentran dentro de la carcasa del sensor y en
contacto con un líquido electrolítico.
 Calibración:
La calibración del medidor de pH varía dependiendo del fabricante, pero

básicamente el método es el siguiente. Primero, limpie el bulbo de vidrio
del electrodo sumergiéndolo en agua destilada, muévalo para apartar los
restos de la solución del sustrato, luego saque el electrodo y déjelo
secarse. Siguiente, encienda el medidor en el modo de calibración. Debe
de verter la solución de calibración 4,0 en un vaso y después sumerja el
electrodo en ella. Una vez que se calibra en la solución de 4,0, el
número 7,0 va a comenzar a parpadear. Enjuague el electrodo con agua
destilada, déjelo secar y luego sumérjalo en la solución de calibración de
7,0. Una vez que para de parpadear, está calibrado y listo para
utilizarse. Descarte las soluciones de calibración; no vuelva a vaciar la
solución en el envase original. La calibración debe de realizarse el día
que se va a usar el medidor.

Sensor de Oxigeno:
 Función:
Los sensores de medición de oxígeno disuelto (OD) consisten

básicamente de una camisa de acero inoxidable o de cristal
que contiene dos electrodos y un electrolito adecuado. Para
separar los electrodos y los electrolitos del caldo de
fermentación, el sensor está cubierto por una membrana. El
oxígeno difunde a través de la membrana y se reduce en el
cátodo, que está polarizado negativamente con respecto al
ánodo. Esto produce una corriente que puede ser traducida
como concentración de oxígeno
 Calibración:
El método más simple para calibrar este sensor es en aire, ya que si el

Agua está saturada en aire la presión parcial de O.D. en agua será la
misma que este tiene en aire. De este modo se obtiene el 100%. El 0%
se logra mediante una solución saturada en Bisulfito de Sodio. Aguardar
en cada caso a que la medición se encuentre estabilizada previo a tomar
las mediciones, esto puede tomar unos 10 minutos aproximadamente.
Sensor de Espuma:
 Métodos mecánicos:
Consisten de adaptaciones de disco rotatorios montados sobre el eje
principal de agitación. Estos dispositivos aseguran una buena eliminación
de espuma, con la desventaja de que consumen elevadas cantidades de
energía, lo cual se refleja en un incremento en los costos de producción.

 Métodos químicos
Se realizan con la ayuda de agente antiespumantes los cuales pueden ser
suministrados de forma automática. Algunos antiespumantes son
metabolizados por los microorganismos, por lo cual pueden ser
considerados como una fuente de carbono adicional
VI. PROCEDIMIENTO
6.1 Preparación Del Medio De Mantención
De acuerdo con la tabla N° 01, se pesaron las cantidades requeridas,

haciendo uso de la balanza analítica.

Se mezcló todos los compuestos ya pesados, en un matraz Erlenmeyer, y

después se le agregó los 50 ml de agua destilada ya medidos.
Se calentó el matraz en el mechero Bunsen agitando constantemente

con ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera
burbuja, a partir de lo cual controlamos 2 minutos.
Se preparó 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente se le adicionó entre 6-

7ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, y se tapó
inmediatamente.

Luego se colocó los tubos en un vaso de precipitado y se puso dentro de la

olla a presión, previamente se aflojaron las tapas, para permitir el
intercambio de gases.
Se calentó hasta que la temperatura alcanzó los 121°C y a partir de ello se

controló 20 min. Finalizando la esterilización. Se ajustó las tapas de los
tubos y luego se les colocó en posición inclinada a temperatura ambiente.

6.2 Resiembra Celular (Solido - sólido )
Para la resiembra se siguieron las técnicas de asepsia y se colocó bajo

mechero para mantener un ambiente estéril. El asa bacteriológica se
sometió a fuego hasta alcanzar el rojo vivo.
El procedimiento de resiembra se hizo en los tubos de ensayos

preparados con medio sólido (con agar). La azada se realizó en el tubo
desde adentro hacia fuera. Luego se llevó a la incubadora a 30 °C
durante 48 h.

6.3 Determinación de La Curva de Calibrado de DNS (Ácido

Dinitrosalicílico)
Hidrólisis acida de la muestra
Se tuvo una solución estándar de Sacarosa 2g/L, de la cual se prepararon 8

tubos de ensayo a diferentes concentraciones, indicados en la siguiente
tabla:
N° Tubo ml. Solución ml. Agua Concentración

Stándar destilada g/l
1 2 0 2
2 1.75 0.25 1.75
3 1.5 0.l50 1.5
4 1.25 0.75 1.25
5 1 1 1
6 0.75 1.25 0.75
7 0.5 1.5 0.5
8 0 2 0

A los 8 tubos que contenían diferentes concentraciones de sacarosa, se les

agregó a cada uno 0.5 ml de HCl concentrado y se agitó bien en el agitador de
tubos.
Se colocó los 8 tubos de ensayo en un vaso precipitado y se llevó a baño María

a 60 °C por 10 minutos. Seguido se colocó el vaso precipitado con los tubos en
baño con hielo por 3 minutos. Luego se agregó 3.5 ml de NaOH 1.7M y se llevó
nuevamente al agitador de tubos.

Reactivo DNS
Se rotuló 8 tubos de ensayo con tapas y de las muestras de la Hidrólisis

Acida, se cogió con una micropipeta 500 µl de cada una de ella y se
vacío a estos tubos.
Se adición 500 µl de DNS a cada tubo y luego se llevaron a ebullición por 5,

luego se llevó a agua con hielo por 3 minutos.

Luego con una pipeta, se agregó 5 ml de agua destilada a cada tubo, y se dejó
reposar por 15 minutos.
Después de reposar los tubos, se agitó en el Maxi mix 8agitador de tubos). Luego
se llevó al espectrofotómetro y a 540 nm se midió la absorbancia.

LECTURA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO A 540nm – CURVA DE CALIBRADO DNS:
Se había encendido el equipo al inicio de la práctica. Luego se calibró el

espectrofotómetro con DNS (blanco). Después se realizó la lectura de cada
tubo, para ello se vació la muestra en el tubo o celda del espectrofotómetro,
se leyó la absorbancia a 540 nm, y seguido se lavó el tubo (3 veces con agua
destilada), simultáneamente se había colocado en el equipo otro tubo con
agua destilada. Seguido se vació la muestra del segundo tubo en el tubo que
se lavó, se retiró el tubo con agua destilada, se colocó el tubo con la muestra
en el equipo y se leyó su absorbancia. De la misma forma se leyó las
absorbancias de las muestras de los tubos restantes. Así se obtuvo los datos
para la curva de calibrado de DNS.

6.4 Preparación Del Medio De Activación para la curva de Calibrado

de Biomasa.
Se pesó todos los componentes descritos en la tabla N°02 en la balanza

analítica para un medio de activación de 25 ml. Previo a esto se elaboró un
tapón hecho de gaza y algodón, para colocarlo en el matraz para evitar la
contaminación del medio.
En un tubo de ensayo se colocó el extracto de levadura y malta y se le agregó

5ml de agua destilada, en otro tubo se agregó la solución de sales y agregamos
5ml de agua destilada. En un matraz de 125ml se adicionó la glucosa y se
agregó 15ml de agua destilada.

Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz en la olla a presión, se

cubrió los tapones con papel aluminio, además dentro de la olla se colocó
cartón para evitar que se rompan los materiales de vidrio, se controló 15
minutos a partir de la primera burbuja.
Luego de enfriar, se vació el contenido de los tubos al matraz, en torno al

mechero, así se tuvo preparado el medio de activación con todas las
indicaciones de asepsia. Luego se inoculó (en el medio de activación) y se
llevó el matraz al Shaker por 10h a 35°C y 200rpm.

Después de las 10 horas se sacaron los matraces del Shaker, para tener el mismo
medio de activación para los 3 subgrupos, se procedió a vaciar el contenido en un
solo matraz.
Luego se sacaron 4 muestras de 5 ml del matraz y se les midió absorbancia en el
espectrofotómetro a 640 nm. De aquí se obtiene un promedio de absorbancia para el
valor de 1:1 (sin dilución)
Luego se centrifugó los 4 tubos por 15 minutos, seguido se eliminó el sobrenadante y

se quedó con el pellet (sólido); luego se agregó tampón citrato (aprox. 5ml).

Se agitó y se volvió a centrifugar en el Vortex (centrifuga) por 20 minutos, luego se

volvió a botar el sobrenadante, nuevamente se agregó solución tampón y se
centrifugó, al final se quedó el pellets en los tubos. Luego se colocó los pellets en los
capachos, que previamente habían sido rotulados y colocados en la estufa. Se colocó
los capachos con pellets en la estufa, por 12 horas a 80 °C.
Después que se retiró los capachos de la estufa (día siguiente), se colocaron en el

desecador por media hora. Luego se procedió a pesar cada capacho. Así se obtuvo el
peso seco de cada capacho, el promedio de este sirvió para saber la concentración de
biomasa en el medio de activación (g/ml).

Con lo que quedó en el matraz de medio de activación se hizo diluciones según la tabla
siguiente. A los cuales se les medió absorbancia en el espectrofotómetro a 640nm.
CON LO CUAL SE OBTUVO LA CURVA DE CALIBRADO DE
Diluciones Biomasa Agua destilada Absorbancia

(ml) (ml) 640nm
01:03 01 0 0.970
01:04 01 01 0.790
01:05 01 02 0.712
01:06 01 04 0.607
01:07 01 06 0.530
01:8 01 09 0.453

6.5 Preparación Del Medio De Activación para la Cinética.
Se pesó todos los componentes descritos en la tabla N°02 en la balanza

analítica para un medio de activación de 25 ml. Previo a esto se elaboró un
tapón hecho de gaza y algodón, para colocarlo en el matraz para evitar la
contaminación del medio.
En un tubo de ensayo se colocó el extracto de levadura y malta y se le agregó

5ml de agua destilada, en otro tubo se agregó la solución de 9 sales y
agregamos 5ml de agua destilada. En un matraz de 125ml se adicionó la
glucosa y se agregó 15ml de agua destilada.

Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz en la olla a presión, se

cubrió los tapones con papel aluminio, además dentro de la olla se colocó
cartón para evitar que se rompan los materiales de vidrio, se controló 15
minutos a partir de la primera burbuja.
Luego de enfriar, se vació el contenido de los tubos al matraz, en torno al

mechero, así se tuvo preparado el medio de activación con todas las
indicaciones de asepsia. Luego se inoculó (en el medio de activación) y se
llevó el matraz al Shaker por 10h a 35°C y 200rpm.

6.6 Preparación Del Medio De Fermentación para la Cinética.
De acuerdo con la tabla N° 03, se pesó las cantidades requeridas en la

balanza analítica, sobre capachos de papel aluminio.
Se disolvió el compuesto con agua destilada de la siguiente manera:

 Sacarosa en un matraz de 500ml con 76 ml de agua destilada.
 (NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + 10 ml tampón citrato +
1ml de solución de sales.
 Extracto de levadura en un tubo con 10 ml de agua destilada.
Dentro de los 76 ml de H2O destilada se consideró 2ml por las pérdidas
en evaporación durante la esterilización.

Se esterilizó las diluciones en la olla a presión por 15min. (a partir de la

primera burbuja).
Terminada la esterilización, se dejó enfriar y luego se envolvió con

papel para ser guardado en la refrigeradora.

6.7 Determinación De La Cinética De Crecimiento De La Biomasa
Debido a que la preparación del Medio de Activación y las diluciones del

medio de Fermentación se preparó la semana anterior, se retiraron del
congelador. Seguido se colocó en la estufa el medio de activación (debió
estar 1 hora pero solo se colocó por 40 minutos). Y se dejó que las
diluciones del medio de fermentación se descongelen.
Cerca al mechero se preparó el medio de fermentación. Se vaciaron las

mezclas de los tubos en el matraz (con su debido flameado). El medio de
fermentación era un medio traslúcido. Se sacó los 3 matraces de medio
de activación de la incubadora y se mezclaron frente al mechero.
Seguido se agitó el medio de activación y se tomó de él 5ml los cuales se
colocaron en el medio de fermentación.

Con una pipeta limpia y estéril se procedió a sacar 5 ml del medio de

activación. Los 5 ml de muestra se agregaron en una celda del
espectrofotómetro, y se realizó la lectura a 640 nm. Se colocó el
matraz en el Shaker, para las próximas lecturas.
Todas las lecturas registradas a través de las horas de fermentación

se anotaron en una hoja de registro para ir evaluando el crecimiento
de las levaduras durante 11 horas.

Una vez realizada la lectura en el espectrofotómetro, la muestra de la

celda se colocó en un tubo de ensayo, y este se centrifugó por 15
minutos.
Terminado la centrifugación, se retiró el tubo de ensayo, y se colocó

el sobrenadante en un vial, el cual se tapó. Se tuvo cuidado de que
las levaduras no se combinen con el sobrenadante.
El sobrenadante depositado en los viales se colocaron en un recipiente (taper),

y este se colocó en la refrigeradora, para su posterior análisis de azucares
reductores. – DNS.

6.8 Determinación De Azúcares Reductores: Método Del Dns

(Ácido Dinitrosalicílico)
Hidrólisis acida de la muestra
Se colocó las muestras de los viales en tubos de ensayo, 2 ml y se les agregó a

cada uno 0.5 ml de HCl concentrado luego se agitó bien en el agitador de tubos.
Seguido de la agitación se llevó los 5 tubos de ensayo a Baño María a 60°C por
10 minutos.

Después se colocó en baño con hielo por 3 minutos, a continuación se

le adicionó a cada tubo 3.5ml de NaOH 1.70M y se agitó en el agitador
de tubos.
Reactivo DNS
De las muestras de la Hidrólisis Acida, se cogió con una micropipeta

500 µl de cada una de ella y se vacío a estos tubos. Seguido se
adicionó 500 µl de DNS a cada tubo.

Se llevó los tubos a ebullición por 5, luego se llevó a agua con hielo por 3
minutos.
Luego con una pipeta se agregó 5 ml de agua destilada a cada tubo, y luego dejar
reposar durante 15 minutos.
Después de reposar los tubos, se agitó en el agitador de tubos - Maxi mix. Luego
se procedió a leer a 540 nm en el espectrofotómetro.

LECTURA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO A 540nm:
Se calibró el espectrofotómetro con DNS (blanco). Después se realizó la

lectura de cada tubo (5 tubos), para ello se vació la muestra en el tubo o
celda del espectrofotómetro, se leyó la absorbancia a 540 nm, y seguido se
lavó el tubo (3 veces con agua destilada), simultáneamente se había
colocado en el equipo otro tubo con agua destilada. Seguido se vació la
muestra del segundo tubo en el tubo que se lavó, se retiró el tubo con agua
destilada, se colocó el tubo con la muestra en el equipo y se leyó su
absorbancia. De la misma forma se leyó las absorbancias de las muestras
de los tubos restantes.

VII. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES O TAREAS:

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE
Pichia stipitis NRRL Y-7124
DÍA ACTIVIDAD
12/06/17  Presentación del preinforme.
 Preparación del medio de mantención.

13/06/17  Preparación del DNS.
 Curva de calibrado para DNS.
14/06/17  Resiembra en medio de mantención.

 Preparación del medio de activación.
16/06/17  Activación del microorganismo.

 Curva de calibrado para peso seco de biomasa.
 Esterilización de pipetas y preparación de viales.
20/06/17  Preparación del inoculo.

 Seguimiento de cinética en cultivo por lote.
 Seguimiento de cinética microbiana por CLA.
21/06/17  Análisis DNS
03/07/17  Presentación del informe final

Plan de Muestreos y Registro de Datos
Grupo: C-2
Día de la experiencia: 21/06/17
Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126
Fuente Carbono: Sacarosa pH 4.2 T °C: 35°C N rpm: 220 rpm
V∘=1L Vf=2L Tcla= 6h
TIEMPO Absorbancia Nombre del

Nº HORA Observaciones
(horas) (640 nm) alumno
01 0 Todos
02
03
04
05
06
CLA TIEMPO Absorbancia Nombre del

HORA Observaciones
(horas) (640 nm) alumno
01
02
03
04
05
06
07

VIII. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Volumen de muestra 8 ml diluido 1:8, de un caldo de medio de activación de 20

mL de volumen fermentado en matraz de 125 mL
N° CAPACHO PESO (g) PESO+CELULAS g CELULAS X (g/L)

1 0.1907 0.1958 0.0051 0.6375
2 0.1817 0.1879 0.0062 0.775
3 0.2424 0.2487 0.0063 0.7875
X prom (g/L) 0.73333333
La concentración del caldo es:
C=8*X promedio =5.866666667g/L
[X] ABS
0.73 0.962
0.65 0.854
0.47 0.613
0.36 0.475
0.15 0.2
0.12 0.157

1.2
1
y = 1.3178x + 3*10^(-16)
R² = 1
0.8
ABS
0.6
0.4
0.2
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
[X]
Se obtuvieron los resultados finales de absorbancia de cada muestra:
N° MUESTRA ABS
1 0.376
2 0.521
3 0.762
4 0.723
5 0.882
6 0.646
7 0.685
8 0.709
9 0.774
10 0.827
11 0.816
12 0.856
13 0.912
14 0.951

Reemplazando en la curva de calibrado mis datos de las nuevas

absorbancias para asi hallar la curva de t vs [X]
t (horas: min) [X]

0:00:00 0.285
1:00:00 0.395
2:00:00 0.578
3:00:00 1.097
3:30:00 1.339
4:30:00 1.961
5:00:00 2.079
5:30:00 2.152
6:30:00 2.349
7:00:00 2.51
7:30:00 2.477
8:00:00 2.598
9:00:00 2.768
9:30:00 2.887
3.5
CLA
CL
3
2.5
BIOMASA [X]
1.5
0.5
0
0:00:00 1:12:00 2:24:00 3:36:00 4:48:00 6:00:00 7:12:00 8:24:00 9:36:00 10:48:00
TIEMPO (horas : minutos)
En la imagen se observa que el crecimiento por lote nos da un crecimiento inferior que un alimentado de biomasa,
el crecimiento de biomasa en fase alimentada comienza en el punto de inicio de la fase estacionaria del cultivo
por lote, este crecimiento que se figura en la gráfica es producto de que la biomasa como tiene más medio para
vivir sigue reproduciéndose.

En el proceso de DNS obtuvimos las concentraciones de sustrato

durante el periodo de lote y alimentación:
t (horas:min) [X] [S]

0:00:00 0.285 4.36
1:00:00 0.395 3.849
2:00:00 0.578 3.095
3:00:00 1.097 0.526
3:30:00 1.339 0.111
4:30:00 1.961 0.228
5:00:00 2.079 0.231
5:30:00 2.152 0.289
6:30:00 2.349 0.219
7:00:00 2.51 0.278
7:30:00 2.477 0.202
8:00:00 2.598 0.196
9:00:00 2.768 0.289
9:30:00 2.887 0.441
4 6
CLA
Concentración de sacarosa (g/L)

Concentración de biomasa (g/L)
3.5 CL
5
3
4
2.5
2 3
1.5
2
1
1
0.5
0 0
0:00:00 1:12:00 2:24:00 3:36:00 4:48:00 6:00:00 7:12:00 8:24:00 9:36:00 10:48:00
Tiempo (horas : minutos)
[X] [S]
En la gráfica se nota que el crecimiento de biomasa esta en relación a la disminución de sustrato, pero se
recalca que en el medio alimentado la disminución de sustrato se hace casi constante pues la alimentación es
pequeña y cada vez que se consume el sustrato lo compensa la alimentación.

IX. CONCLUSIONES
Se logró diseñar el medio de cultivo con los componentes necesarios para lograr
crecimiento óptimo de Saccaharomyces cerevisiae ATCC 4126.
El medio adecuado para la mantención de un cultivo debe poseer una fuente de

carbono, nitrógeno y sales en cantidades adecuadas para así satisfacer los
requerimientos nutricionales del microbio y favorecer la reproducción celular y la
producción de etanol.
La activación celular permitió el reinicio de las actividades metabólicas de la

Saccaharomyces cerevisiae con el desarrollo del inóculo se alcanzó una cantidad
inicial de………. g/L de biomasa para iniciar la fermentación.
En el desarrollo de la fermentación notamos que el consumo del nutriente es más

acelerado que el crecimiento de la biomasa.
El diseño de los diferentes medios tanto activación como fermentación debe tener la
adecuada cantidad de fuente de N, fuente de carbono, vitaminas (extracto de
levadura) y otros (las demás sales usadas) para que Saccharomyces cerevisiae
pueda desarrollarse.

Se determinó que para el medio de cultivo mínimo utilizado de la Saccharomyces

cerevisiae los valores cinéticos experimentales de µmáx = ……. h-1 , un td= …… hr,
YX/S = ……….g de Biomasa/g de Fructosa.
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
 Y. Li et al./ Enzyme and Microbial Technology 41 (2007) 312-317
 A. Karapatsia et al./ Biomass and Bioenergy 90 (2016) 32-41
 Microbiologia, Pelczar J. M.; Reid D. R. y Chan E.C.S. 2da Edición, 1982.
Editorial McGraw-Hill de México, S. A. De C. V.
 Leveau, J. Y. y Bouix, M. (2000). Microbiología Industrial. Los
Microorganismos de Interés Industrial. Editorial Acribia S. A. Zaragoza.
 QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería Bioquímica
 http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap4_mi.pdf
 http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-
Medios-de-Cultivo
 http://biorreactores.tripod.com/C3CBCL.htm
 http://www.acenologia.com/ciencia64_02.htm
 http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-
Medios-de-Cultivo
 http://biorreactores.tripod.com/C3CBCL.htm
 http://www.acenologia.com/ciencia64_02.htm
 http://www.google.com.pe/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=7&ve
d=0CEUQFjAG&url=http%3A%2F%2Ffcq-
microdealimentos.wikispaces.com%2Ffile%2Fview%2FCientica%2Bde%2BS.c
erevisiae.docx&ei=6HOPUKrEE5L69gTD9IDYCQ&usg=AFQjCNGJvUWxc23QunI
lWBgir0IGA2YqGw&cad=rja

ANEXO


DISEÑO DEL MEDIO DE MANTENCIÓN (50 ML)
Extracto de Levadura 3
Peptona 5
Extracto de Malta 3
Agar 20
Glucosa 10
Cálculos:
𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎 ∶
3𝑔 → 1000𝑚𝑙
𝑥 → 50𝑚𝑙
𝑥 = 0.15𝑔
𝑝𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛𝑎 ∶
5𝑔 → 1000𝑚𝑙
𝑥 → 50𝑚𝑙
𝑥 = 0.25𝑔
𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑎 ∶
3𝑔 → 1000𝑚𝑙
𝑥 → 50𝑚𝑙
𝑥 = 0.15𝑔

𝐴𝑔𝑎𝑟 ∶
20𝑔 → 1000𝑚𝑙
𝑥 → 50𝑚𝑙
𝑥 = 1𝑔
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 ∶
10𝑔 → 1000𝑚𝑙
𝑥 → 50𝑚𝑙
𝑥 = 0.5𝑔
DISEÑO DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN (15 ML)
5
Sacarosa
3
Extracto de levadura
5
Extracto de malta
5 ml/L
Solución de sales
𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 ∶
5𝑔 → 1000𝑚𝑙
𝑥 → 15𝑚𝑙
𝑥 = 0.075𝑔

𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎 ∶
3𝑔 → 1000𝑚𝑙
𝑥 → 15𝑚𝑙
𝑥 = 0.045𝑔
𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑎 ∶
5𝑔 → 1000𝑚𝑙
𝑥 → 15𝑚𝑙
𝑥 = 0.075𝑔
𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑙𝑒𝑠 (𝑙𝑖𝑞𝑢𝑖𝑑𝑜) ∶
5𝑚𝑙 → 1000𝑚𝑙
𝑥 → 15𝑚𝑙
𝑥 = 0.075𝑚
DISEÑO DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN
Hallamos porcentaje de nutrientes:
𝐶12 𝐻22 𝑂11
PM = 342 gr/mol

HALLAMOS EL % NUTRIENTE
𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑
%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑥100
𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜
12𝑥12
%𝐶 = 𝑥100
342
%𝐶 = 42.11%
% Elemento
Nutriente Fuente
Nutriente
C12H22O11 C 42.11%
(NH4)2SO4 N 21.21%
(NH4)2SO4 S 24.24%
KH2PO4 P 22.79%
KH2PO4 K 28.68%
MgSO4.7H2O Mg 19.86%

PORCENTAJE DE BIOMASA:
Composición elemental de la Saccharomyce.
VF= 1L; XF=3.39 gr/l
C 45%
N 9%
Mg 0.4%
K 0.5%
P 2.0%
Hallamos para el C: 𝑌 𝑥⁄𝑠 . 𝑓 = 0.5
%𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
𝑌 𝑥⁄𝑠 = 𝑥𝑓
%𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
42.11
𝑌 𝑥⁄𝑠 = 𝑥0.5
45
𝑌 𝑥⁄𝑠 = 0.468𝑔𝑟/𝑔𝑟
Hallamos el So
∆𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎
𝑆0 =
𝑌𝑥/𝑠
2
𝑆0 =
0.468
𝑆0 = 4.273𝑔𝑟/𝑙

Sulfato de amonio:
(𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4
𝑃𝑀 = 132.06 𝑔𝑟/𝑚𝑜𝑙
Hallamos el % nutriente
14𝑥2
132.06
%𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 21.2%
Hallamos 𝒀 𝒙⁄𝒔 𝒙
𝑌 𝑥⁄𝑠 =
21.2
𝑌 𝑥⁄𝑠 =
2
𝑌 𝑥⁄𝑠 = 2.36𝑔𝑟/𝑔𝑟
Hallamos el So
𝑆0 =
𝑌𝑥/𝑠
3.39
𝑆0 =
2.36
𝑆0 = 1.436 𝑔𝑟 /𝑙

BiFosfato diacido de potasio
𝐾𝐻2 𝑃𝑂4
𝑃𝑀 = 136
39𝑥1
136
𝑌 𝑥⁄𝑠 =
28.68
𝑌 𝑥⁄𝑠 =
2.5
𝑌 𝑥⁄𝑠 = 11.47 𝑔𝑟/𝑔𝑟
Hallamos el so
𝑆0 =
𝑌𝑥/𝑠
3.39
𝑆0 =
11.47
𝑆0 = 0.296 𝑔𝑟/𝑙

Sulfato de magnesio heptahidratado:
Hallamos:
𝑀𝑔𝑆𝑂4 . 7𝐻2 𝑂
Pm= 246.47 gr/mol
24.3
246.47
𝑌 𝑥⁄𝑠 =
9.86
𝑌 𝑥⁄𝑠 =
0.4
𝑌 𝑥⁄𝑠 = 24.65𝑔𝑟/𝑔𝑟
Hallamos el so
𝑆0 =
𝑌𝑥/𝑠
3.39
𝑆0 =
24.65
𝑆0 = 0.138 𝑔𝑟/𝑙

% Elemento
Nutriente Fuente
Nutriente
C12H22O11 C 42.11%
(NH4)2SO4 N 21.21%
(NH4)2SO4 S 24.24%
KH2PO4 P 22.79%
KH2PO4 K 28.68%
MgSO4.7H2O Mg 19.86%
INSTRUMENTOS
Autoclave Mechero Bunsen Incubadora

pHmetro Balanza analítica Shaker
Espectrofotómetro Biorreactor

Informe 2 Cultivo Lote Alimentado Aireado

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

Ing. AUGUSTO CASTILLO CALDERON

 OSORIO DURAN ALEXANDER

TÍTULO: CULTIVO CELULAR POR LOTES ALIMENTADO (CLA) CON AIREACION

Para este trabajo se contó con cepas de Saccharomyces cerevisiae ATCC

La experiencia consistió en obtener la cinética de crecimiento de

El monitoreo de la cinética de crecimiento de microorganismos es de gran

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2.1 OBJETIVOS GENERALES:

1. Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lote

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1. Diseño del medio de cultivo.

2. Activación celular y desarrollo del inóculo.

3. Identificar y describir las partes, accesorios y geometría,

conocimiento de la operación del fermentador, esterilización,

carga, descarga y toma de muestras.

4. Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y

control automatico, asi como la calibración de los sensores.

5. Puesta en marcha del CLA. En el cultivo por lote determinar

6. Obtener los perfiles de masa celular, fuente de C y O2 disuelto

a través del tiempo total de fermentación en el bioreactor.

7. Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitado.

8. Determinar Yx/s y Qx del CLA.

LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 4

III. MARCO TEORICO

Para la obtención de datos confiables, la evaluación del crecimiento microbial

El desarrollo de un cultivo por lotes bajo condiciones fisicoquímicas adecuadas

Curva de crecimiento microbial

El período de latencia (lag) (A), es el período de adaptación de la célula a los

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En el período de crecimiento acelerado (B), la velocidad aumenta desde cero

En el período de crecimiento exponencial (C), las células se reproducen, en un

En el período de desaceleración (D), la velocidad disminuye al limitarse la

El período estacionario (E) se produce cuando se agota una sustancia nutritiva.

El período de muerte o decaimiento (F) ocurre en aquellos cultivos, en

VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO

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