DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA

MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2017

TRABAJO PRÁCTICO
DE LABORATORIO 1

Cinética Enzimática -
Electroforesis
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TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO Nº1

PARTE 1: CINÉTICA ENZIMÁTICA

Objetivos:
• Familiarizarse con el trabajo y el material de laboratorio.
• Entender y practicar los principios de la espectrofotometría.
• Entender el concepto de actividad enzimática.
• Calcular la velocidad inicial de una reacción enzimática.
• Utilizar métodos gráficos para el cálculo de Km y velocidad máxima de una enzima.

Introducción
Las enzimas son los catalizadores de las reacciones bioquímicas. La medida de la
actividad de una enzima y la comprensión de las variables que la afectan es importante no sólo
para entender la biología de la célula sino también para el diagnóstico clínico.
En el presente trabajo práctico se determinarán los parámetros cinéticos de la enzima
UREASA. Esta enzima interviene en el metabolismo de la urea en microorganismos,
invertebrados y plantas. Sin embargo, la ureasa NO se encuentra en ninguna célula humana.
La ureasa se utiliza en los laboratorios de análisis clínicos como herramienta para
determinar la concentración de urea en muestras de sangre (uremia) y orina. La urea
constituye la fracción de nitrógeno no proteico más importante en la mayoría de los líquidos
biológicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico. Se produce en
el hígado y es excretada por la orina a través de los riñones. Una elevación de la concentración
sérica de urea, se interpreta como una posible disfunción renal. Sin embargo, no debe dejarse
de lado el hecho de que los valores séricos de urea se encuentran íntimamente relacionados
con la dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier alteración en estas variables se
traducirá en un cambio de la concentración de urea en suero.
La enzima UREASA hidroliza la urea produciendo CO2 y NH3.

UREASA
+ H 2O CO2 + 2NH3
UREA

En este práctico se determinarán diferentes variables. Por un lado, se calculará la

velocidad inicial (V0) de la enzima para una concentración de sustrato dada (urea). Luego, se

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estimarán los dos principales parámetros cinéticos enzimáticos utilizando el gráfico de las
dobles recíprocas de Lineweaver-Burk: el Km y la velocidad máxima (Vmáx).

Fundamento del método

La ureasa descompone específicamente la urea produciendo dióxido de carbono y
amoníaco. Éste reacciona en medio alcalino con salicilato e hipoclorito para dar indofenol (color
verde).

Materiales
• Pipetas y tubos
• Agua destilada
• Solución de urea de una determinada concentración
• Solución correspondiente a REACTIVO I: ureasa, buffer fosfato, ácido salicílico,
nitroprusiato de sodio y EDTA.
• Solución correspondiente a REACTIVO II: hipoclorito de sodio en hidróxido de sodio.
• Baño termostatizado a 37oC (baño de incubación)
• Reloj o timer
• Espectrofotómetro o colorímetro
• Calculadora, lápiz, regla.

Procedimiento
Cada grupo de trabajo calculará la velocidad inicial (V0) para una concentración
conocida de Sustrato. Para ello se medirá la concentración de producto formado a distintos
tiempos de incubación del sustrato con la enzima. Luego, se realizará el correspondiente
gráfico de producto en función del tiempo y, a partir de éste, se calculará la V0 para la
concentración de Sustrato utilizada.
Entonces, cada grupo de trabajo procesará CINCO TUBOS, con IGUAL cantidad de
sustrato y distintos tiempos de incubación (0, 5, 10, 15 y 20 minutos) como se indica a
continuación:

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TUBO UREA REACTIVO 1 Tiempo de REACTIVO 2 Tiempo de

Nº (ul) (ul) incubación (ul) incubación
(min) (min)
5 500 1000 20 1000 15
4 500 1000 15 1000 15
3 500 1000 10 1000 15
2 500 1000 5 1000 15
1 500 1000 0 1000 15

1. Verificar que todos los tubos se encuentren limpios y vacíos.

2. Pipetear 500 ul de urea (de la concentración correspondiente al grupo) en cada uno de
los tubos.
3. Agregar 1000 ul de Reactivo 1 al tubo 5 (tiempo de incubación 20 min). Mezclar. Incubar
a 37 °C y anotar el tiempo.
4. Pasados 5 minutos, agregar 1000 ul de Reactivo 1 al tubo 4 (tiempo de incubación 15
min). Mezclar. Incubar a 37 °C y continuar controlando el tiempo.
5. Pasados 5 minutos del anterior, agregar 1000 ul de Reactivo 1 al tubo 3 (tiempo de
incubación 10 minutos). Mezclar. Incubar a 37 °C y continuar controlando el tiempo.
6. Pasados 5 minutos del anterior, agregar 1000 ul de Reactivo 1 al tubo 2 (tiempo de
incubación 5 minutos). Mezclar. Incubar a 37 °C y continuar controlando el tiempo.
7. Pasados 5 minutos del anterior, agregar 1000 ul de Reactivo 1 al tubo 1 (tiempo de
incubación 0 minutos).
8. Inmediatamente (sin llevar el tubo 1 a incubar a 37 °C), agregar 1000 ul de Reactivo 2 a
todos los tubos, empezando por el tubo 1 y siguiendo hasta el 5. Mezclar.
9. Incubar 15 minutos a temperatura ambiente para el desarrollo de color.
10. Leer la absorbancia de todos los tubos en el colorímetro con el filtro de 530 nm. El tubo
1 (0 minutos) será utilizado como blanco de reacción. (Blanco de reacción: se utiliza
para calibrar la absorbancia del equipo en cero, el color que pudiera desarrollar es
inespecífico, ya que en este tubo no hubo formación de producto).

TUBO Nº Tiempo de Incubación Absorbancia

(min) 530 nm
1 0
2 5
3 10
4 15
5 20

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Una vez obtenidos los datos de absorbancia para cada tubo, es posible calcular la
concentración de producto (c) utilizando la siguiente ecuación:

c = A / (e x b)

Esta relación proviene de la ecuación A = e.b.c, donde A es la absorbancia, e es el

coeficiente de extinción molar (depende de la naturaleza química del compuesto, en este caso
es provisto por los docentes); b es la longitud atravesada por la luz en el medio (en
centímetros); y c, la concentración de la muestra. (VER ANEXO I. PRINCIPIOS DE
COLORIMETRÍA)

En este caso, b = 1 cm y e = 0,4 mM-1.cm-1. Por lo tanto,

c = A / (0,4 mM-1. cm-1 x 1 cm)

A
c= 0,4 mM-1

Por lo tanto, las concentraciones obtenidas luego de dividir la absorbancia por 0,4
serán concentraciones milimolares (mM).

TUBO Nº Tiempo de Incubación Concentración de

(min) producto (mM)
1 0
2 5
3 10
4 15
5 20

Luego de calcular la concentración de producto en cada tiempo de incubación, realizar

el gráfico [PRODUCTO] en función del tiempo y calcular la V0. (GRÁFICO 1).

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En el TP se habrán procesado seis concentraciones distintas de UREA. Por lo tanto,

con los datos obtenidos por todos grupos, se obtendrán los promedios de las velocidades
iniciales para cada concentración. Con estos datos, cada alumno deberá realizar el gráfico
Velocidad inicial (V0) en función de la concentración de sustrato (GRÁFICO 2). Estimar en
este gráfico los valores de velocidad máxima y Km.
Finalmente, realizar el gráfico de las dobles recíprocas de Lineweaver-Burk (GRÁFICO
3). Calcular el Km y la velocidad máxima correspondientes a la ureasa.

[UREA] V0 1/[UREA] 1/V0

mM mM/min 1/mM min/mM

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GRÁFICO 1: [PRODUCTO] vs TIEMPO

[UREA] =
V0 =

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GRÁFICO 2: V0 vs [UREA]

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GRÁFICO 3: 1/V0 vs 1/[UREA]

Km =
Vmáx =
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PARTE 2: ELECTROFORESIS
Objetivos:
• Familiarizarse con el trabajo y el material de laboratorio.
• Entender los principios de la electroforesis de proteínas.

Procedimiento
Se dispondrán de geles de poliacrilamida-SDS al 10% ya preparados para realizar una
corrida electroforética en condiciones desnaturalizantes.
• Sembrar muestras de proteínas previamente preparadas con Buffer de siembra (glicerol,
SDS, β-mercaptoetanol en agua) y calentadas por 15 minutos a 95 ºC.
• Largar la corrida electroforética. Con el paso del tiempo, se puede observar como
avanza el frente de corrida. Mediante este método, las proteínas se separan por sus
diferencias en el peso molecular, ya que todas están cargadas negativamente en forma
proporcional a su tamaño mediante el uso de SDS.

En el laboratorio, se dispondrá de geles y membranas teñidas y autorradiografías para

observar los distintos pasos del Western Blot.

Más información: http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-wb-webinar.pdf

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ANEXO 1
PRINCIPIOS DE COLORIMETRÍA

Una medición fotocolorimétrica consiste en la determinación de la concentración de una

sustancia por la cantidad de color que posee naturalmente o que puede producir luego de una
reacción cromática, convenientemente elegida. Este procedimiento está basado en el hecho
que toda sustancia coloreada absorbe luz de una determinada longitud de onda (λ).
La absorción de la energía radiante por una solución puede describirse por medio de
una gráfica de absorbancia en función de la longitud de onda. Esta gráfica se denomina
espectro de absorción. Por ejemplo, para el caso de la hemoglobina:
Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Caracterización espectrofotométrica de la Hemoglobina

El espectro de absorción frecuentemente se utiliza para propósitos de identificación cualitativa.

Espectroscopía de absorción
Considérese un haz de energía radiante con una intensidad inicial, I0, que incide sobre
una celda cuadrada y pasa a través de ella. La celda contiene una solución de un compuesto
que absorbe energía radiante de una cierta longitud de onda (λ). La intensidad de la energía
radiante transmitida, Is, será menor que I0. Parte de la energía radiante será reflejada por la
superficie de la celda o absorbida por la pared de la celda o el solvente. Por lo tanto, estos
factores deben ser eliminados si se desea considerar sólo la absorción del compuesto de

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interés. Esto se hace usando un blanco que contiene todo menos el compuesto a ser
determinado.

celda
Intensidad Intensidad
Incial Transmitida
(I0) (Is)

Absorbancia
(A)
La transmitancia óptica de un compuesto en solución se define como la fracción de luz
incidente, a una longitud de onda especificada, que pasa a través de la muestra.

Transmitancia = T = Is /I0

Usualmente esta razón se describe como un porcentaje (%T). El concepto de

transmitancia es importante porque sólo puede medirse la luz transmitida (no se puede medir la
luz que absorbe el compuesto en la cubeta).
Cuando la concentración de un compuesto en solución aumenta, más luz es absorbida
por la solución y menos es transmitida. El porcentaje de T varía inversamente y
logarítmicamente con la concentración. Sin embargo, es más conveniente usar la
absorbancia, A, la cual es directamente proporcional a la concentración.
Por lo tanto:
A = –log Is/I0 = – log T = log (1/T)

Si se grafica A o %T en función de la concentración de la solución con el compuesto

que absorbe energía, se obtienen los siguientes gráficos:
Transmitancia (%T)
Absorbancia (A)

Concentración Concentración

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Ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert-Beer (ley de Beer), establecida en 1852 por Beer, postuló que “la
reducción de la energía radiante de un haz de radiación monocromática es proporcional a la
intensidad del haz y a la cantidad de sustancia absorbente situada en su trayectoria”. O sea
que establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la
cantidad de energía radiante absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la
energía radiante transmitida. La absorbancia también es directamente proporcional a la
longitud de la trayectoria que atraviesa la energía radiante a través de la celda.
La relación matemática entre la absorción de energía radiante, la concentración de la
solución, y la longitud del paso óptico se demuestra por la ley de Beer:

A = a.b.c

Donde: A es la absorbancia
a, absortividad (constante relacionada con la naturaleza química del soluto)
b, longitud atravesada por la luz en el medio (centímetros);
c, concentración de la sustancia de interés.

Esta ecuación es la base del análisis cuantitativo por fotometría o espectroscopía de

absorción. Los valores de absorbancia no tienen unidades. La absortividad es una constante de
proporcionalidad relacionada con la naturaleza química del soluto y tiene unidades que son
recíprocas con las de b y c. Cuando c se expresa en moles por litro y b en centímetros, el
símbolo e, llamado absortividad molar (o coeficiente de extinción molar), se usa en lugar de a
y es una constante para un compuesto dado a una determinada longitud de onda, bajo
condiciones específicas de solvente, pH, temperatura, etc. Tiene unidades de L/mol.cm (o sea:
M-1.cm-1). Mientras mayor es la absortividad molar, mayor es la absorbancia para la misma
concentración en términos de masa de dos compuestos.
Si una sustancia sigue la ley de Beer a una longitud de onda específica (es decir, una
gráfica lineal de A contra c conteniendo el punto 0;0), la concentración de una solución de
dicha sustancia puede ser determinada midiendo su absorbancia e interpolando su
concentración en la gráfica de calibración. Por el contrario, cuando el %T se grafica frente a la
concentración, se obtiene una relación curva (similares a las mostradas previamente).
La ley de Lambert-Beer es una relación matemática ideal que contiene varias
limitaciones. Existen desviaciones de esta ley que implican variaciones en la linealidad de la
absorbancia contra la concentración. Una de estas causas es la medición de concentraciones
muy elevadas de una sustancia. Por lo tanto, la ley de Beer es aplicable sólo a soluciones
diluidas. También es sabido que, si dos o más compuestos absorben a la longitud de onda de

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la energía radiante incidente, cada uno con diferente absortividad, no se cumplirá la ley de
Beer.
Los instrumentos que miden la absorbancia de soluciones contienen siete componentes
básicos:

1. una fuente estable de energía radiante;

2. entrada para el enfoque de la luz (colimador);
3. un selector de longitud de onda;
4. una hendidura de salida para el enfoque de la luz;
5. un dispositivo para colocar la cubeta que contiene la solución a ser medida;
6. un detector de energía radiante;
7. un dispositivo para leer la señal eléctrica generada por el detector.

Si se utiliza un filtro como selector de longitud de onda, se dispone solo de luz

monocromática a longitudes de onda discretas y el instrumento es llamado fotómetro. Si se usa
un monocromador (esto es, un prisma o una red de difracción) como selector de longitud de
onda, el equipo puede proporcionar luz monocromática sobre un intervalo continuo de
longitudes de onda y es llamado espectrómetro o espectrofotómetro.
En la fotocolorimetría se determina la cantidad de luz absorbida en un determinado
intervalo espectral por una determinada concentración de sustancia. En otras palabras, en los
métodos fotocolorimétricos, se comparan intensidades luminosas para un determinado
intervalo de longitud de onda.

Curva de calibración
La curva de calibración se utiliza para determinar la concentración de una sustancia en
una muestra desconocida. Este método requiere la existencia de una relación proporcional
entre la concentración de esa sustancia y una determinada señal analítica que se mide
(como la absorbancia). Conociendo esta relación, será posible conocer la concentración en

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una muestra dada mediante la medida de esa señal. La relación concentración – señal se suele
representar en un gráfico conocido como curva de calibración.

Para elaborar una curva de calibración se necesitan varias diluciones con una
concentración conocida de la sustancia a medir. Estas diluciones se conocen como soluciones
testigo. Las concentraciones utilizadas como testigo deben estar dentro del rango válido para
la técnica que se va a utilizar (donde se cumple la ley de Beer). Es decir, por encima del
mínimo de concentración cuantificable y por debajo del límite de linealidad. La relación lineal
entre concentración y la absorbancia no se suele mantener a altas concentraciones y el límite
de linealidad marca la concentración máxima para la cual la curva de calibración sería fiable.

Límite de linealidad
Absorbancia (A)

Concentración

La curva de calibración se construye midiendo la absorbancia de cada una de las

diluciones testigo previamente elaboradas. En el eje de ordenadas se asigna el valor de la
señal medida y en el eje de abscisas la concentración del testigo. Para cada testigo le
corresponderá una determinada absorbancia. De esta forma podemos realizar un gráfico de
Absorbancia (eje y) en función de la concentración del testigo (eje x). Teniendo una muestra de
concentración desconocida (Muestra x), se puede medir la absorbancia y estimar la
concentración por extrapolación sobre la curva de calibración, como se ejemplifica a
continuación:

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0,4

Absorbancia (A)
0,3

0,2

0,1

0
Concentración
0 1 2 3 4
Muestra X

Si la absorbancia de la muestra estuviera por encima del límite de linealidad (es decir, si
fuera mayor que la absorbancia del último punto de la recta), se debe realizar nuevamente el
ensayo con una cantidad de muestra menor y así poder calcular la concentración de la
sustancia en estudio.

Resumiendo:

Para calcular la concentración de una determinada sustancia en una muestra se debe

realizar previamente una curva de calibración. Para ello se utilizan distintas concentraciones
conocidas de esa misma sustancia (solución testigo) y se lee en el espectrofotómetro la
absorbancia correspondiente a cada una. Luego, se realiza el gráfico de Absorbancia en
función de la concentración de la sustancia. Finalmente, se puede calcular la concentración de
la muestra X, interpolando el valor de absorbancia leído para dicha muestra en la región lineal
de la gráfica (donde se cumple la ley de Beer)

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ANEXO 2
USO DE MICROPIPETAS

La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir

pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas.
Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más
habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 µl,
respectivamente. El uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar
el aparato: para ello, se emplean puntas desechables de plástico (tips). En el laboratorio se
emplearán micropipetas de tipo p1000, las cuales pipetean entre 100 y 1000 µl .

Técnica de pipeteo
1. Seleccionar el volumen que se desea pipetear.
2. Colocar el tip correspondiente en la pipeta. (El tip no debe quedar flojo y no debe haber
ningún tipo de residuos entre el tip y el cuerpo de la pipeta).
3. Presionar el botón superior suavemente hasta el primer tope.
4. Sumergir el tip en la solución que se necesita pipetear.
5. Mantener la pipeta en forma vertical mientras toma la solución.
6. Descartar la solución del tip en el tubo correspondiente presionando suavemente el botón
superior hasta el segundo tope.
7. Usar diferentes tips para pipetar diferentes soluciones (sino se contaminan los
reactivos).

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