USP 30

118 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biolgicas

placas con la dilucin de prueba media (S,) del Estndar y cada uno PRUEBA DE ENDOTOXINAS
de los nueve cilindros restantes con una de las otras cuatTo diluciones (85) BACTERIANAS
del Estndar. Repetir el proceso para las rres diluciones del Estndar.
Para cada Muestra Desconocida, llenar cilindros aliemos en cada una
de las tres placas con la dilucin de prueba media del Estndar (S3) Y
cada uno de los nueve cilindros restantes con la dilucin de prueba
correspondiente ( U, ) de la Muestra Desconocida. 1 h an sido arrnonizadas con los
Partes de este cap,'tulo generafarmacopea E uropea o de la
1
textos correspondientes de a partes que no estn unificadas
Mtodo Turbidimtrico Fannacopea Japonesa.
Aque 11 as
mbolos e.) fi
para espec, car 1cha
d.
estn marcadas con los s
El da de la valoracin, preparar las dosis necesarias diluyendo las situacin. . rueba para detectar o cuantificar las
soluciones madre del Estndar y de cada Muestra Desconocida Este captulo descnbe una ~eden estar presentes en la muestra de
segn se define en Preparacin del Estndar y Preparacin de la endotoxinas bactenanas que P aplica la prueba. Se usa Lisado de
Muestra. Agregar 1,0 mL de cada dosis, excepto en el caso de un artculo o artcul_os a losL~) obtenido a partir de extractos
Gramicidina, Tiostreptn y Ti losina (utilizar O, 1O mL) a cada uno de Amebocitos de L11nulus ( )antes del cangrejo herradura (Limulus
tres tubos de ensayo preparados y colocar los tres tubos rep licados en acuosos de amebocitos circu identatus), preparado y caracterizado
una posicin, elegida al azar, en una gradilla u otro soporte. Incluir Polyphemus o dTachypleus h . LAL i
orno Reactivo . .
de manera similar en cada gradilla uno o dos tubos de control que para ser ut1 1z~ o c . . para esta prueba: las tecrucas de
contengan I mL del diluyente de prueba (ver la Tabla 1) pero no Hay d~s llpos de tecm~a~asan en la formacin de u.n gel y las
antibitico. Una vez completada la gradilla de soluciones de prueba c?agulac,on (gel~c 1?1) qu~ \as ltimas comprenden . un mtodo
(con Candicidina dentro de los 30 minutos del momento en que se tecmcas. fotometncas. bas! en la produccin de turbidez despus
aade el agua a la solucin madre de dimetil sulfxido), agregar 9,0 111rb1d1metnco, que se de un sustrato endgeno y un mtodo
mL de inculo a cada tubo de la gradilla y colocar de inmediato la de la rup~ura de urn~ne! en el desarrollo de color despus de la
gradilla completada en una incubadora o en un bao de agua cromognd1co que se 1e.~o sinttico pptido-cromgeno. Proceder
mantenidos a una temperatura de 36 a 37 ,5 , excepto en el caso de ruptura e un comp , , .
em leando cualquiera de estas tecmc_as, a_ men_os que en 1a
la Candicidina (incubar a una temperatura de 27 a 29). lncubar los p f dque algo diferente
tubos durante 4 a 5 horas, excepto en el caso de Capreomicina, monogra ia se JO 1 S1 hubiera d1screpanc1as
, . en
11 d la de ci sin final se basa en las tecmcas de
Cloranfenicol, Cicloserina. Dih.idroestreplomicina, Espectinomicina, 1os resu a o , S d. l d fi
Estreptomicina y Troleandomicina (incubar durante 3 a 4 horas), coagulacin, salvo que en la m~nografa se rn tque a go 1 er7ote.
Ti losina (incubar durante 3 a 5 horas) y Candicidina (incubar durante En las tcnicas de coagulac,on, e l punt_o final d~ _la reacc100 . se
16 a 18 horas). Despus de la incubacin, agregar a cada tubo 0,5 determina a partir de diluciones del matenal en anahs1s com~aran-
mL de formaldehido diluido, excep!O en el caso de la Tilosina dolas directamente con diluciones en paralelo de una endotoxma de
(calentar la gradilla e n un bao de agua a una temperatura de 80 referencia, y las cantidades de endotoxina se expresan como
a 90 durante 2 a 6 minutos o en un bao de vapor durante 5 a 1O Unidades USP de Endotoxinas (LJE-USP). [NOTA- Una UE-USP es
igual a una Ul (Unidad Internac ional) de endotoxinas.]
minutos y llevar a temperatura ambiente), tomando una gradilla a la
Debido a que los Reactivos LAL han sido formulados para ser
Pre
vez, leer su trans mitancia o absorbaocia en u.o espectrofotmetro
adecuado equipado con un filtro de 530 nm o 580 nm (ver utilizados tambin en pruebas turbidimtricas o colorimtricas,
Preparar s
Espectroformeno en Aparara). dichas pruebas se pueden emplear para cumplir con los requisitos.
Para la valoracin de un nivel con una curva estndar, preparar Estas pruebas requieren que se establezca una curva de regresin 1atrayendc
diluciones que representen cinco niveles de prueba del Estndar (S, estndar; el contenido de endotoxina del material de prueba se L\L. Algun,
a S,) y un nivel de prueba nico ( U3) de cada una de hasta detennina por interpolacin de la curva. Los procedimientos oamrde
20 Muestras Desconocidas correspondiente a S3 del Estndar. incluyen la incubacin durante un perodo predeterminado de la fumnecesai
Preparar tambin un S3 adicional como prueba de crecimiento. endotoxina de reaccin y de soluciones de control con Reactivo LAL l"llexamin:
Agregar I mL de cada dilucin de prueba, excepto en el caso de la y la lectura de la absorbancia de la luz espectrofotomtrica bIDUt:.1ra St
Gram.icidina, Tiostreptn y Ti losina (utilizar O, 1O mL), a tres tubos y a longitudes de onda adecuadas. En e l procedimiento turbidimtrico ri fabricante
1 mL de diluyente sin antibitico a seis tubos como controles. de ~unto fi~~I la lectura se hace inmediatamente al final del perodo Jltducto cor
Distribuir un conjunto completo, incluyendo dos tubos de controles, de mc~bac1on. _En el procedimiento colorimtrico de punto final la l;l..itar con
a una gradilla, intercalndolos al azar. Agregar 9,0 mL de inculo, reacc,on se detiene al final del perodo preseleccionado mediante el
excepto en el caso de Tiostreptn (utilizar 10,0 mL de inculo), agregado de un agente que detiene la reaccin enzimtica antes de
~se,
incubar, agregar 0,5 rnL de formaldehido diluido y completar la
tidis'
reah_zar !as_ lecturas. En los ensayos cinticos colorimtricos Y ~ la
valoracin como se indic anteriormente. Determinar la duracin turb1d1_metr1cos la absorbancia se mide durante el periodo de lt4,~ . co
exacta de la incubacin observando el crecimiento en la concentra- reaccion Y los valores de velocidad se determinan a partir de esas
cin de referencia (dosis media) de las diluciones del estndar (S1). 1ectu.ras.
~llnal
~~
CLCULO APARATOS y MATERIAL DE VIDRIO
Para calcular la potencia a partir de los datos obtenidos con el Eliminar los pirgenos de tO d O . . .
mtodo de cilindro-placa o el mtodo turbidimtrico, proceder en materiales termoestabl el matenal de v1dno y otros
cada caso segn se indica en Potencias Interpoladas a partir de una es
proceso validado. + 2 El .en una estufa de 1
aire ca 1ente med 1.an te un
Curva Estndar (ver Diseo y Anlisis de Va/oraciones Biolgicas usan habitualmente :on 3gempo Y la temperatura mnimos que se
( 111 ) ), utilizando un mtodo de regresin lineal por mnimos de plstico, tales com mi~utos a 250 . S1 se emplean aparatos
cuadrados y una prueba de linealidad. En aquellos casos en los que automticas, usar slo los microplacas y puntas para pipetas
se realiza un nmero de valoraciones del mismo material con la de endotoxinas detectable~ue se han de~ostrado que estn exentos
misma curva estndar, calcular el coeficiente de variacin en los [NOTA-En este captulo ~ q~e no mterfieren con la prueba.
resultados de todas las valoraciones del material. En aquellos casos , 1o, como por ' ee
recept~cu e 1 tennino "tubo ". me
. 1uye cualquier. otro
en los que se realiza ms de una valoracin del mismo material con m1crotttulacin.) J mplo los poc1llos de las placas de
diferentes curvas estndar, promediar los dos o ms valores de la
potencia.
1 El Reactivo LAL reaccio .-
con las endotoxioas. AJgun~ ~~n al~os /J-glucaoos adems de reaccionar
con /J-glucanos y se deben usp parac,ones que estn tratadas no reaccionan
2 p . ar para mue tr
ara .realizar una prueba de . s as que contengan glucanos.
endotoxmas, ver Esterilizacin o~ahdez del procedimiento para inactivar
de Estenl,dad d~ Articulas Fa~ Calor Seco en Esterilizacin \' Gara11110
con una seos1b1hdad no m ' , AL
nacope1cos ( 1211 ) . Usar un R eact1vo
eoor de o l S U . ..
' nidades de Endotoxinas por inL-
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Pruebas Biolgicas / (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas
11 9

PREPARA,CIN DE LA SOLUCIN MADRE DEL

por A, que representa la sensibilidad declarada en la etiqueta (en UE
ESTANDAR DE ENDOTOXINA Y LAS por mL) del _Reac_llvo LAL, para obtener el factor MDV. Si en la
SOLUCIONES ESTNDAR m~nografa md~v1d_ual se especifica la concentracin limite de
en otoxma en termm os de peso_o Un idades de frmaco activo (en
Cor 1 1 El ER Endo toxina USP _tiene una potencia definida de o 000 UE por ~~ o en UE por Unidad), multiplicar e l lmite por la
) d s Umda~es USP d~ Endotoxrna (VE) por vial. Reconstitu ir todo el concentr~c1on (en _mg por mL o en Unidades por mL) del frmaco en
llific~~
contenido de I v 1al de ERE (Estndar de referencia de endotox.ina) !solucion somellda _a prueba o del frmaco reconstituido segn las
con ~ mL de Agua _Reactivo para LALJ . , mezclar intennitente- mstrucc1on_es _d e 1~ etiqueta, segn corresponda, y dividir el producto
r dicha mentc durante 30 mmuto~ con un mezclador por vrti ce y usar este de la m~lt1plicac16n por A, para obtener e l factor MDV. El factor
concentrado para hacer ?1luciones en serie adecuadas. Conservar e l MDV as1 obtenido es el factor de dilucin lmite de la preparacin
Car concentrado en un refrigerador durante no ms de 14 d' para que la pnieba sea vlida.
estta as d'I . ias para
preparar I uc10nes postenores. Mezclar vigorosamente con un
isad de mezclado r por vrtice durante no menos de 3 minutos antes de usar
de
Xtrac1o Mezclar cada dilucin durante no menos de 30 segundos antes d~ DETERMJNACIN DE LOS LMITES DE
Liinu
. 11 prepar~ la s1gu1ente dilucin. Debido a la prdida de actividad por
ENDOTOXINA
terizado adsorc1on, no almacenar las diluciones en ausencia de datos que
respalden lo contrano.
El lmite de endotoxina para frmacos de administracin
icas de parenteral, definido en base a la dosis, es igual a K/M, H en
el Ylas 1 donde K es el umbral de la dosis pirognica de endotox ina por kg de
tntodo Pruebas Preparatorias peso corporal en seres humanos, y M es igual a la dosis mxima
despus recomendada para seres humanos de un producto por kg de peso
Usar un Reactivo LAL cuya sens ibilidad declarada en la etiqueta corporal durante un perodo de una hora.
,mtodo haya sido confi.nnada. El lmite de endotoxina para frmacos de administracin
es de la La . validez ~e los resultados de la pnieba de endotoxinas parenteral se especifica en las monografias individuales en unidades
roceder bactenanas reqmere una adecuada demostracin de que las muestras como por ejemplo UE/mL, UE/mg, o VE/Unidad de actividad
e en la de_l artc ulo o de las soluciones, los lavados o los extractos de los biolgica.
_cias en nusmos, _a los que se les realizar la prueba, no inhiben ni potencian
teas de por s m ismos la reacci n, ni interfieren con la prueba de ninguna
rerente. otra manera. La validacin se lleva a cabo realizando la prueba de TCNICAS DE COAGULACIN
ccin se inhibicin o po tenciaci n descrita en cada una de las tres tcnicas
mparn. indicadas. Se incluyen controles negativos adecuados. La validacin Las tcnicas de coagulacin detectan o cuantifican las endotoxmas
oxina dt debe repetirse s i se cambia la fuente de Reactivo LAL o el mtodo de basndose en la coagulacin del Reactivo LAL en presencia de la
n como fabri cacin o formulacin del articulo. endotoxina. La concentracin de endotoxina necesaria para que el
-USPes lisado se aglutine en condiciones estndar, es la sensibilidad
declarada en la etiqueta del Reactivo LAL. Para asegurar tanto la
Preparacin de las Soluciones de Prueba precisin como la validez de la prueba, en Pniebas Preparatorias
para Set para las Tcnicas de Coagulacin se describen las pruebas para
tricas. confirmar la sensibilidad declarada en la etiqueta del Reactivo LAL y
Preparar soluciones de prueba disolviendo o diluyendo frmacos
quisitos. o extrayendo dispositivos mdicos utilizando Agua Reactivo para para los factores de interferencia.
egresin LAL. Algunas sustancias o preparaciones se pueden disolver, diluir
rueba se o extraer de un modo m s adecuado en otras soluciones acuosas. Si
iroientos fuera necesario, ajustar el pH de la solucin (o de la dilucin) que se Pruebas Preparatorias para las Tcnicas de
do de la va a examinar de modo que el pH de la mezcla del Reactivo LAL y Coagulacin
vo LAL la muestra se e ncuentre dentro del intervalo de pH especificado por
0rntrica el fabricante del Reactivo LAL. Esto se apl ica habitualmente a un Prueba de Confirmacin de la Sensibilidad Declarada en la
rotriCO producto con un pH comprendido entre 6,0 y 8,0. El pH se puede Etiqueta del Reactivo LAL--Confinnar la sensibilidad declarada
1 periodo ajustar con un cido, una base o una solucin amortiguadora en la etiqueta utilizando por lo menos 1 vial del lote de Reactivo
o final la adecuada segn lo recomiende el fabricante de l ~eactivo LAL. Los LAL. Preparar una serie de diluciones dobles de ER Endotoxina
dianteel cidos y las bases se pueden preparar a partir . de concentTados USP en Agua Reactivo para LAL para obtener concentraciones de
antes di o slidos con Agua Reactivo para _LAL en rec_1p1entes exentos de
endotoxinas detectables. Las solucwnes amortiguadoras se deben
n, A, 0,5A y 0,25A, en donde A corresponde a lo definido
tricOS y anteriormente. Efectuar la prueba por cuadruplicado sobre cada una
odo de validar para garantizar que estn libres de endotoxinas detectables y de las cuatro concentraciones estndar e incluir controles negativos.
n de esas otros factores de interferencia. La prueba de confim1acin de sensibilidad del lisado se debe llevar
a cabo cuando se usa una partida nueva de Reactivo LAL o cuando
hay algn cambio en las condiciones experimentales que puedan
DETERMINACIN DE LA MXIMA DILUCIN afectar el res u liado de la prueba.
VLIDA (MDV) Mezclar un volumen del Reactivo LAL con un volumen iguaI
(como por ejemplo alcuotas de O, 1 mL) de una de las solucionc:s
La Mxima Dilucin Vlida es la di lucin mxima permitida de estndar en cada tubo de ensayo. Cuando se usen viales o ampollas
una muestra a la que se le puede determinar_ el lmite de end_otoxina. de prueba individuales que contengan Reactivo LAL liofilizado,
Se ap lica a soluciones inyectables o s_oluc1ones de ?mm 1si:~c1n agregar directamente las soluciones al vial o a la ampolla. lnc~bar la
parenteral en la forma reconstituida o d1lu1da para admm1strac1on, o, mezcla de reaccin durante un perodo constante segun las
cuando corresponda, a la cantidad de ~~ac? ,en pes? si el v?lume n instrucciones del fabricante de l Reactivo LAL (habitualmente
de la forma farmacutica para admm1stracwn pudiera vanar. La a 37 + 1 durante 60 + 2 minutos), evitando vibraciones. Para
ecuacin general para determinar la MDV es: analizar la integridad del- gel, sacar uno a uno los tubos di~ ctarn_ente
de la incubadora y con un nico movimiento suave, mvemrlos
MDV = (Lmite de endotoxina x ConcentTacin de la soluci n de aproxi madamente 180. Si se ha fonnado un gel firme_~
muestra) / (A) 4 K es 5 UE-USP/kg parn cualquier va de administrncin que no ~ea la
intra1ecnl (para la cual K es 0,2 UE-USP/kg de_p~so corporal). En el caso de
donde la concentracin de la so lucin de muestra Y A se productos radiofam1acu1icos que no se a~un1s1ren p~r ".1 1~tra1cc.al. el
corresponden con las definiciones dadas a continuacin:, Cu?? lmite de endotoxina se calcula como t 75U, donde V es_la J o,1s max1ma
en una monografia indiv idual se especifique la conce~tra~1on l~m1te recomendada en mL. En el caso de radio frmacos adm1~1s1rados ~r 'la
d.e_endotoxjna por volumen (en UE por mL), se debe d1v1d1r el hmite intratecal el limite de endoloxina se obtiene mediante la tonnula 14, 1 Pan,
3
Agua Es1ril para fnyeccin u otro tipo de agua que no presente ~i~guna
fo~ulac'ones (hnbirualmcnte productos oncolgicos) que se admm1stran por
reaccin con el Reacti vo LAL especifico con el que se va a usar, al limite de metro cuadrado de superficie corporal, la frmula e, K,'M. en donde K =
sensibilidad de dicho reactivo . 5 UE/kg y M es la (dosis mx ima/m'/horJ x 1,80 m')/70 Kg
 USP 3,1
120 (85} Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruehas Biol~ica\
..
te de Coagulacin
Prueba de Lm
pem1anece en su lugar despus de mvcr11r los tubos. registrnr el __ , una monografia conticn~ ur,
resultado como positivo. Un resultado es negativo si no se forma un .a cuJnuO ,
gel con esas caractersncas. La prueba no es vlida a menos que la 1.- ,ia prucha ~e u.11 17 de CTJdotoJCll'l3
concentracin ms baja de las soluciones estndar mueslre un rcqus110 rc<,pccto al l11r11tc I' Soluc1onc; A. H. C )' D como ~
resultado negati, o en lodas la~ pruebas repetidas. Proc<'dlmicnto-Prcparar a$ 00 la pn1c:ba rn C"ll.a.S wluclOflc<
El punto final es la ltima prueba positiva en la serie de indica en la Tuhlo 2 Y llcvard~ ~: Pmeba de Confirmac,ilr, ,ir .,
concentraciones decrecientes de endotoxina. Calcular el va lor medio siguiendo el procc<l 1m1cn10, E . clo del Rcac.u vo LAL en P~ba,
de los logaritmos de la concentracin en el punto final y luego el . . d d DecIa,a
Se11s1bd1 o de Coagu La:CllJfl
. da en. a . ! f/((11
antilogaritmo del valor medio usando la ecuacin siguiente: Preparatorias para las Tecnicas .

Media Geomuica de la Concentracin del Punto Final =

antilogaritmo ('f,e //),
donde 'f,e es la suma de los logaritmos de las concentTaciones de
punto final de la serie de di lucin utilizada, yfes el nmero de tubos
de ensayo repetidos. La media geomtrica de la concentracin del
punto fi nal es la sensibilidad medida del Reactivo LAL (en UE/mL).
Si no es menor de 0,5), y no es mayor de 2),, se confirma la
sensibilidad declarada en la etiqueta y se usa en pruebas realizadas
con este lisado.
Prueba de Factores de loterfereocia para las Tcnicas de
Coagulaci n-Preparar soluciones A, B, C y D corno se muestra en
la Tabla 1 y realizar la prueba de inhibicin o potenciacin en las
soluciones de muestra a una diJucin menor que la MDV, que no
contenga endotoxinas detectables, siguiendo el procedimiento
indicado antes en la Prueba de Co11firmacin de la Sensibilidad
Declarada en la Etiqueta del Reactivo LAL. La media geomtrica de
las concentraciones del punto final de las soluciones B y C se
determina empleando la ecuacin de esa prueba.
Esta prueba se debe repetir cuando cambia cualquier condicin
que pueda influir sobre los resultados de la misma. Esta prueba no es
vlida a menos que las Soluciones A y D no muestTen ninguna
reaccin y el resultado de la Solucin C confirme la sensibilidad
declarada en la etiqueta.
Si la sensibilidad del lisado determinada en presencia de la
solucin de muestra en anlisis de la Solucin B no es menor de 0,511.
y no es mayor de 2),, la solucin de muestra no contiene factores que
interfieran en las condiciones experimentales utilizadas. En caso
contrario, la solucin de muestra que se va a examinar interfiere con
la prueba.
Si la muestra en anlisis no cumple con la prueba a una dilucin
menor que la MDV, repetir la prueba empleando una dilucin mayor
que no exceda la MDV. El uso de un lisado de mayor sensibilidad
permite una di.lucin mayor de la muestra que se va a examinar y
esto puede contribuir a la eliminacin de la interferencia.
La interferencia se puede solucionar mediante un tratamiento
adecuado, como fi ltracin, neutralizacin, dilisis o calentamiento.
Para establecer que el tTatamiento elegido elimina eficazmente la
interferencia sin prdida de endotoxinas, realizar la valoracin que se
describe a continuacin utilizando la preparacin a examinar, a la
que se ba agregado ER Endotoxina USP y ha sido sometida al
tratamiento seleccionado.
. S do nes para la Prueba de Lmitt dt
Ta bla 2 Prepar ac16n de. o Iu 1 'n
Coagu ac1
Nmero de
Concen(Tacin de Endotoxina/So!u-
c1.on a 1a que se Agrega Endotoxina Repeu-
cionee.
Solucin
. a/solucin de muestra 2
A mngun . .ddiluida 2
B 2)Jsolucin de muestra d1 1u1 a
2
e 2,J Agua Reactivo para LAL 2
D ninguna/Agua Reactivo para LAL
Preparar la Solucin A y la Solucin B de control positivo del p'.~
ulilizando una dilucin no mayor que la MDV y tratam.1e_ntos como se md1ca
en la Prueba de Fac/ores de /111eifere11cia para las Tecn,c! d e Coagu/ocll)II
en Pruebas Preparatorias para las Tcnicas de Co_agulac1on. Las Soluc!llC'I
B y e de control positivo contienen la preparac1on de _endoto;una estndar
a una concentracin que corresponde al doble de la sens1bil1dad declaraaa en
la etiqueta del Reactivo LAL. La Solucin D de control negativo es Agm
Reactivo para LA L.
Inter pretacin-La prueba no es vlida a menos que amb:i)
determinaciones repetidas de las So luciones 8 y C de control
positivo sean positivas y la Solucin D de control negativo >tJ
negativa. La preparacin en anlisis cumple con la prueba s1 ,e
obtiene un resultado negativo en ambos tubos que contiem:n la
Solucin A. La preparacin en anlisis no cumple con la prueba s1,,.:
obtiene un resultado pos itivo en ambos rubos que contienen la
Solucin A .
Repetir la prueba cuando se obtenga un resultado pos1u,o ct1
tubo que c_on lenga la So lucin A y un resultado negativo en el otro
La preparacin en _a nlisis cumple con la prueba cuando se obacni:
un resultado negativo en ambos tubos que contienen la Soluc1o A
en el res~ltado d<; _la repeticin . Si la prueba es posiuva p3r'J b
preparac ion en analis1s a una dilucin menor que la MDV se pu.:dt:
repetir la prueba a una dilucin que no sea mayor que la I\IDV

Tabla 1. Preparacin de Solu ciones para la Prueba de I nhibicinfPotenciac . .

ion para Tecntcas de Coagulacin
Concentracin de Endotoxina/
Solucin a la que se Agrega
Endotoxina Factor de
Solucin Dilu ente Concentracin Inicial Nmero de
Di lucin
A ninguna/solucin de muestra de Endotoxina Re 't1c1ones
2)Jsolucin de muestra solucin de muestra 4
2 2A 4
4 D.. 4
8 0,5).. 4
2A.lagua para BET Agua Reac ti vo para 1 0,25A 4 .,
LAL
2 n ,_") r
4 11-. 2
8 0,51-. 2
Dd ning una/Agua Reac tivo para 0,251-. ~

LAL
2
'j
' Solucin A- nnn ~oluci6n de muestra de la prcparnci6n en an61isis que est e~e1113 d . d
Soluc16n B. prneba de inierfcrencia. e en otoxina\ detectables
' Solunn (' conirol de la ~ensibilidod declarada rn lo etiqueta cid Rcac1ivo LAL
Soluc16n D control negu11vo de /\gu11 Reoc11vo parn LAL. '
 USP 30 Pruebas Biolgicas I (85) Prueba de Eodotoxina.s Bacteriarun 121

Ensayo de Coagulaci n
Este ensayo cuantifica endotoxinas bacterianas en soluciones de
muestras po r titulacin hasta punto final.
Procedimiento- Preparar Soluc iones A, B. C y O c om o se indica
en la Tabla 3 y a nalizar siguiendo el procedimiento en la Prueba de
Confirmacin de la Sensibilidad Declarada e11 la Etiqueta del
Reactil'o LAL e n Pruebas Preparatorias para las Tcnicas de
Coagulacin.
Clculo e Interpretacin- La prueba no es vlida a menos que
se cumplan las s iguientes condiciones: ( 1) ambas determjnacion es
repetidas de la Solucin D de contro l negati vo son negati vas; (2)
ambas dete nninaciones repetidas de la So lucin B de contro l
positivo de l producto son positiv as; y (3) la media geomtrica de la
concen traci n de punto fina l de la Solucin C est compre ndida en el
interva lo de 0 ,5A a 2A.
Para detenninar la con centracin de endo toxinas de la Solu cin A,
calcular la concentracin del punto final para cada serie de
determinaciones repetidas de las di luciones multiplicando cad a
factor de di lucin de l punto final por A. La concentracin d e
endotoxina en la muestra es la media geomtrica de la concentrac in
de punto final de las detenninaciones repetidas (ver la frmu la
proporcionada en la Prueba de Confinnacin de la Sensibilidad
Declarada en la Etiqueta del Reactivo LAL en Pmebas Prepara-
torias para las Tcnicas de Coagulacin). Si la prueba se realiza con
una solucin de muestra diluida, c alcular la concentraci n d e
endotoxinas en la s oluc i n de muestra o rig inal mult iplicando por e l
factor de di lucin. S i ningu na de las dil uc iones de la solu cin de
muestra es positiva en un ensayo vlido, informar la concentracin
de endotoxina com o m enor que A (si se analiz la muestra diluida,
menor que ), por e l facto r de d ilucin ms baj o de la muestra). Si
todas las diluc iones son positivas, la concentracin de endotoxina se
informa como igual o mayor que e l factor de diluc in mayor
multiplicado p or A (por ejemplo, el factor de di luc in inicia l
multiplicado por 8 veces A en la Tabla 3).
El artculo cumpl e con lo s requisitos de la prueba si la
concentracin de endoto x inas es m enor que la que se esp ecific a en
la monografia individual.
TCNICAS FOTOMTRICAS
El mtodo turb idim trico mide e l a umento en la turbidez.
Dependiendo del principio de prue ba empleado, esta tcnica se
clasifica como turbidim trica de punto fi na l o turbidimtrica cintica.
La tcnica turbidmtrica d e punto fin al se basa en la relacin
cuantitativa en tre la concentracin de endotoxinas y la turbidez
(absorbancia o tran smisin) de la m ezcla de reaccin a l trmino d e
un perodo de incubacin. La tcnica turbidimtrica cintica es un
mtodo para med ir e l tiempo de mic1acin que se n~tla par-.
a lcanw r una absorbanc1a predeterminada de la mezcla de reacc100
o la velocidad de produccin de turbidez.
. El_mtodo crom?gnico m ide el cromforo liberado a partir de un
peplldo cromog nico adecuado por medio de la reaccin de tas
endo tox inas con e l Reactivo LAL. Segn e l princ1p10 de prueba
empleado . esta tcnica se clasifica como cromognica de punto final
o cromognica c intica. La tcn ica cromogn1ca de punto final se
basa en la re laci n cuantitativa entre la concentracin de endoto1JJnas
y la liberacin de l cromforo a l trmino de un perodo de
incubacin. La tcnica cromognica c intica es un mtodo para
m edir e l tiempo de iniciacin q ue se necesi ta para alcanzar una
absorbanc ia predeterminada de la mezcla de reacc i n o la velocidad
de aparic in de color.
Todas las pruebas fotom tricas se llevan a cabo a la tem peratura
de incubacin recomendad a por e l fabricante del Reactrvo LAL. que
generalmente es 37 1.
Pruebas Preparatorias para las Tcnicas
Fotomtricas
Para asegurar la precisin o validez de las tcn icas turbid1mtricas
y c romognicas, se re alizan las pruebas preparatorias para verificar
que los criterios para la curva estndar son vlido s y que la solucin
de muestra no inhibe ni potenc ia la re accin. C uando cambian las
condic iones que pued en influir en e l resu ltado de la prueba es
necesaria la reva lidacin del mtodo.
Verificacin de los Criterios para la Curva Estndar-
Utilizando la Solucin de Endo tox ina E stndar, prep arar por lo
men os tres conce ntracion es de endotoxinas para generar la curva
estnd ar. Realjzar la prueba usan do por lo men os tres determina-
cion es rep etidas de cad a concentracin de e ndotoxina estndar
siguiendo las instrucciones de l fabricante de l R eactivo LAL (con
respecto a relac iones d e volumen , tiempo de incubacin, tempera-
tura, pH , etc.). Si e l intervalo d eseado en los m todos emticos es
mayor de dos logaritmos, se deben incluir estndares adicionales
para enmarcar cada a umento logartmjco dentro del intervalo de la
curva estndar. E l va lor absoluto del coeficiente d e correlacin.. Ir!,
deb e ser m ayor o igua l a 0,980 para el intervalo de concentraciones
de endo tox ina indicado por e l fabricante de l R eactivo LAL.
Prueba de Factores de Interferencia para las Tcnicas
Fotom tr icas- Seleccion ar una concentrac i n de endo toxjna en
o cerca de la mitad de la c urva estndar de endotoxina. Preparar las
Soluc iones A, B, C y O como se indica en la Tabla 4. Llevar a cabo
la prueba en las So luciones A , B, C y D por lo m enos en duplicado
segn las instrucciones de l Re ac tivo LAL utilizado (con respecto al
vo lume n de la muestra y del Reac tivo LAL, la relacin entre e l
vo lume n d e la m uestra y e l d el Reacti vo LAL, e l tiempo de
inc ubacin, etc.).

Tabla 3. Preparacin de Soluciones para el Ensayo de Coagulacin

Con centrac in de E ndotoxina/ Concentrac i n lnic ia l

Soluc in a la que se le Agrega Facto r d e Dilu- de Nmero de
Solucin Endotoxina D iluyente c in Endo tox ina Re peticiones
A ninguna/solucin de muestra Ag ua R eacti vo p a ra l 2
LAL 2 2
4 2
8 2
Bb 2Alsolucin de muestra 1 2A 2
ce 2A./Agua Reactivo para LAL Agua R e a c tiv o p ara l 2A 2
LA L 2 D.. 2
4 0,5A 2
8 0 ,25A 2
Qd ninguna/Agua Reacti vo para LAL 2

~ lucin A: una solucin de la muestra en anlisis a la dilucin, que no exceda la MDV, con la que se complet la Prueba Je Factort'~ de /nct-rj,fl'n1 U1 ptrn, ids
Ten11cas de Coagulacin. Las diluciones subsiguientes de la so lucin de muestra no debco exceder la MDV. Usar Agua Rcacti\'o parn LAL para ha.:cr \ Cn ts de
drluc1ones de cuatro tubos que contengan la solucin de muestra en anlisis a concentraciones de 1, , y l con respecto a la dilucin ,on la que ..e complet la
Prueba de Faclores Je /11le,fere11da para Tcnicas de Cong11laci11. Se pueden utilizar otr.is diluc iones, s~gn corresponda
' Solucin B: Solucin A que contenga endotox ina estndar a una concentracin de 2)._ (control positivo del producto)
' Solucin C: dos series de 4 tubos de Agua Reacti vo para LAL que contenga la cndotoxina cstotlar a una concentracin de 2A., >.., 0,5>.. y 0,25).., rcspcchvlUllffltc.
' Solucin D: Agua Reactivo para LAL. (control negativo).
 USP 3()
b Biolgicas
122 (87) Pruebas de Reactividad Biolgica, 1n Vitro / Prue as

T nicas fotomtricas
'b' ' /l'otcnclacn para e
Tabla 4. Prepa racin de Soluciones para In Prueba de 10111 1c1 n
Solucin a la que se Agrega la Nm ero de Re eticiones
Solucin Concentracin de Endotoxinas Endotoxina no menos de 2
ninguna
A' solucin de mueS tr no menos de 2
s~
concentracin media de la curva estndar solucin de mueSlra cada una no menos de 2
C< al menos 3 concentraciones (In concentracin ms Agua Reacti vo para LAL
baja se denomina A) AL no menos de 2
- -~[)d~--~n~io~g~uo~a----~--------- -----A~g~u~a~R~e~a~c~li~v~o~p~a~ra~L::'.:~---------------

Soluci~o A: la solucin__de mues_tra _se pued~ diluir pe~? no debe exceder la MDV. . . e ada a una concentracin igual O cercana a la mitad
' Soluc1on B: la preparnc,on en anahs1s a la misma d1luc1on que la Solucin A, que contiene endotox ma agr g .
de la curva estndar. . V. ifi "n de Criterios para la Curva Estandar en
' Solucin C: la endotoxina estndar a las concentraciones utilizadas en la validacin del mtodo dcscnto en eri cae,
Pnieb~ Preparatorias para Tcnicas Foromtricas (serie de control pos itivo).
'Soluc,on D: Agua Reactivo para LAL (control negativo).

Calcular la recuperacin media de la endotoxina agregada

restand? la concentracin media de endotoxina en la solucin (si (87 ) PRUEBAS DE REACTIVIDAD
la h~b1era) de la que contenga la eodotoxina agregada. Para
considerar que no presenta factores de interferencia en las BIOLGICA, IN VITRO
condiciones de la prueba, la concentracin medida de la endotoxina
agregada a la solucin de muestra debe estar dentro de l 50% al 200%
de la co ncentracin conocida de endotoxina agregada despus de
restar la endotoxina detectada en la solucin sin la endotoxina L ebas que se describen a continuacin ~an sido diseadas
agregada. para~t~nninar la reactividad biolgica de cu,1t1vos de clul'.15 de
Cuando la recuperacin de endotoxina se encuentra fera de los mamferos despus de entrar en contacto con plastJco~ e lastomencos
intervalos especificados, se deben e liminar los factores de inter- y otros materiales polimricos gue, a su vez, estan en con.tacto
ferencia como se describe en la P111eba de Factores de Jnte,jerencia directo O indirecto con e l pa~1ente, o ?e . extractos ~spec.ficos
para las Tcnicas de Coagulacin en P111ebas Preparatorias para preparados a partir de los matenales en a1;1ahs1s. Es esenc1~l que las
las Tcnicas de Coagulacin. La repeticin de la Pn.teba de Factores pruebas se realicen en la superficie espec~cada. Cuando esta se ~-
de Interferencia para las Tcnicas de Coagulacin valida el puede determinar, utilizar O, 1 g_ d~ elasto~ero o 0,2 g de pl~nco
tratamiento. u otro material por cada mL de hqu1do extra1do. Tomar p~ecau~1ones
en la preparac in de los materiales para evitar la contammac1on con
microorganismos y otra materia extraa.
Procedimiento para las Tcnicas Fotomtricas Se describen tres pruebas (es decir, la Prueba de Difusin en Agar,
la Prueba de Contac/o Directo y la Prueba de Elucin): La decisin
Seguir el procedimiento descrito en la Prueba de Factores de acerca del tipo de prueba o el nmero de pruebas a realizar para la
Interferencia para las Tcnicas Fotomtricas en Pruebas Prepara- evaluacin de la posible respuesta bio lgica de una muestra
torias para Tcnicas Fotomtricas. o extracto especificos depende del material, el producto final y el
uso previsto. Otros factores que tambin pueden a fectar la aptitud de
la muestra para un uso especfico son la composicin polimrica; los
Clculos para las Tcnicas Fotomtricas proc~d1m1entos de prncesamiento y limpieza; el medio de contacto;
l~s tintas; los adhesivos; la absorcin, la adsorcin y la permeabi-
Calcular la concentracin de endotoxina de cada una de las lidad de los conservantes; las condiciones de almacenamiento. La
de tennioaciones repetidas de la Solucin de Prueba A utilizando la evaluacin de tales factores se debe realizar con pruebas especficas
curva estndar generada por la serie de control positivo C. La prueba ad1c1o_nales adecuadas antes ~e determinar si un producto fabricado
no es vlida a menos que se cumplan las siguientes condiciones: ( 1) a part1~ de un matenal especifico es apto para el uso previsto.
los resu ltados de la serie de control C cumplen con los requisitos de
Estandares de referencia USP ( 11 )-ER Polieti/eno de Alta
validacin definidos en Verificacin de Criterios para la Curva Densidad USP. ER 810rreaccin Positiva USP.
Estndar en Pruebas Preparatorias para Tcnicas Fo!omtricas; (2)
la recuperacin de endo toxina, calculada a partir de la concentracin Preparacin del Cultivo de Clulas- Preparar mltiples cultivos
encontrada en la Soluc in 8 despus de restar la concentracin de de fibroblastos de mamfero L-929 (ATCC 1 1 1 CCL 1
NCTC clo 929 ) . mea ce u ar ,
endotoxina encontrada en la Solu cin A est entre 50% y 200%; y ~ en un medio de cultivo esencial mnimo
1
sup ementa O con sue ro, con un a densidad d e s iembra de
(3) el resultado de la serie de control negati vo D no excede el lmite
aproximadamente Ios clulas por mL I
del va lor blanco requerido en la descripcin del Reacti vo LAL + 1 . . nc u b ar 1os c u 1ti.vos a 37
utilizado. - en un~ l~cubadora humidificada durante no menos de 24 horas
en una atmos ,era de 5 + o/c d d. . .
una monocapa con - .ft e . ioxido d e carbono hasta obtener
. una J 80' E en e1
microscopio los culti vocon uenc1a supe nora , o. xamrnar
Iaterpretadn de Resultados a partir de las Tcnicas capas sean uniforme s pr~parad s para asegurar que las mono-
Fotomtricas reproduc ibilidad de la! /,.,,, t ie
nd
" a la . c?nfluen ci~. [NOTA- La
depende de la obte . debas de React1v1dad 810/ogica In Vitro
nc1on e una d 'd d . .
En los ensayos fo tomtricos, la preparacin en anlisis cumple celular.) enst a umfonne de l cultivo
con la prueba si la concentracin media de endotoxinas de las
Solventes de Extraccin ..
determinaciones repetidas de la Solucin A, despus de la correccin monografia- usar una In -:-:1nyecc,on de Cloruro de Sodio (ver
por dilucin y concentracin, es menor que e l lmite de endotoxina NaCI al 0 ,9% ). De modoec;i1 on d~ C loruro de Sodio que contenga
para e l producto. 1
cultivo de clulas de ma r, em~tivo, se pued e n usar medios de
clulas de mamfero suplemi e~o stn suero o medios de cultivo de
de suero cuando la extrae:~" ados c?n suero. Se usa el suplemento
, ion se realiza a 37 durante 24 horas.
Para ms detalles, consulte las . . . . .-
Soc1cty for Tes1ing and Mate . siguientes publicaciones de la Amenc3ll
1
"Standard Test Method for ~ s, 191.6 Race St., Philadelphia, PA 19103:
Cytoloxicity," designacin de A/;~ Diffusion Cell Culture Screeoing for
Cootac1 Cell Culture Evalu 1. F 895-84; " Standard Practice for Oired
de ASTM F 81 _a 1_
gnac1on
des1 0n of Ma t ena
1s fo r Medical Oevices."
3 83