LABORATORIO DE BIOQUIMICA

LABORATORIO N 1

Objetivos: entender el fundamento de la separacin de clulas mononucleares de sangre

perifrica (PBMC) humana, usando la tcnica de centrifugacin de barrera con Ficoll-histopaque.

I. MARCO TERICO
Centrifugacin:
Es una tcnica de sedimentacin, acelerada gracias al uso de la fuerza centrfuga. Se aplica
al anlisis o a la separacin de mezclas de partculas, clulas, orgnulos o molculas.

Modalidades segn el medio en el que se centrifuga y la forma como se aplica la

muestra:
1. Centrifugacin diferencial
2. Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin
3. Centrifugacin isopcnica o de equilibrio de sedimentacin
4. Mtodo de barrera
Mtodo rpido, tpico por ejemplo en la obtencin de leucocitos de sangre circulante
libres del resto de clulas sanguneas. Se trata de una centrifugacin a travs de un
medio de densidad constante. La densidad de este lecho debe ser intermedia entre la
de los tipos celulares que se quieren separar. Se emplean para ello medios
comerciales como Ficoll-Paque y otros ms.

Ficoll Histopaque

El ficol es un polisacrido hidroflico altamente ramificado, y es soluble en soluciones

acuosas. Este forma parte del Ficoll-Paque, el cual es un reactivo que tiene una
densidad de 1.077g/dl, el cual es utilizado muy comnmente en laboratorios de biologa
molecular con el fin de separar los componentes de la sangre tales como los eritrocitos,
granulocitos y leucocitos entre otros. El Ficol luego de ser centrifugado con la sangre,
revelara en capas de arriba para abajo: Plasma, capa leucocitica, Ficol-paque, eritrocitos
y granulocitos.

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 PBMC

Una Clula mononuclear de sangre perifrica (PBMC) es una clula sangunea

caracterizada por poseer un nico ncleo redondo, como los linfocitos o los monocitos.
Estas clulas sanguneas son un componente crtico en el sistema inmune,
concretamente para combatir las infecciones.

Estas clulas se obtienen a menudo de la sangre usando ficol, un polisacrido hidroflico

que separa capas de la sangre, con monocitos y linfocitos formando un buffy coat bajo la
capa del plasma. Este buffy contiene las PBMCs.

Las PBMCs tienen vastos usos clnicos y en investigacin. Por ejemplo, se emplean en la
investigacin del virus HIV porque las PBMCs incluyen los linfocitos T4, que el HIV infecta.

Sangre perifrica

La sangre es un derivado del tejido conjuntivo modificado que est formada por una
matriz de fase lquida (plasma) y clulas sanguneas. Representa el 6% del peso corporal.

Plasma

Ms del 90% es agua que sirve de solvente para protenas como fibringeno
(coaguladora), albmina, o inmunoglobulinas , y encargadas de las reacciones
antgeno-anticuerpo (la ms abundante es la ). Se denomina suero al plasma centrifugado
y por lo tanto sin fibringeno o protenas coagulantes

Elementos formes (clulas)

Las clulas que circulan por la sangre son eritrocitos, leucocitos y trombocitos o plaquetas.
En ocasiones, pueden circular bacterias (bacteriemia), bacterias de forma masiva
(septicemia), o clulas cancergenas (metstasis). No obstante, existen 3 series celulares
en condiciones fisiolgicas, que son:

Serie roja o eritroide: formada por los eritrocitos

Serie mieloide: se divide en clulas granulares cuyo mximo representante son los
leucocitos granulocitos; y en clulas agranulares

Serie plaquetaria: cuyo mximo representante son las plaquetas, que, aunque
carezcan de ncleo, siguen siendo clulas

Eritrocitos/Hemates: representan el 45-50% de la sangre, y en conjunto forman el

hematocrito. Llevan a cabo muchos procesos de xido-reduccin, y se encargan del
transporte de O2 y CO2 mediante la hemoglobina. La hemoglobina es una globina asociada
a un grupo hemo, y su volumen es de 13-15 ml/sangre. Los eritrocitos son clulas
anucleadas con forma bicncava de 7-8 m de dimetro y 0,9-1,2 m de espesor.
Glbulos blancos: son elementos defensivos que se dividen en dos grupos segn
contengan grnulos intracitoplasmticos o no: granulares y agranularesrespectivamente.
Esta clasificacin se refiere a si tienen grnulos primarios, que son inespecficos. Los
grnulos primarios son lisosomas y cuerpos residuales que se tien intensamente de azul,

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 y por lo tanto tambin se les llama grnulos azurfilos. Los grnulos especficos ya
distinguen los distintos tipos de leucocitos granulares
o Granulares: son los verdaderos leucocitos. Se dividen en Neutrfilos o
leucocitos polimorfo nucleares (PMN), eosinfilos y basfilos.
o Agranulares: se dividen en Monocitos/macrfagos y linfocitos.

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II. MATERIALES:
Muestra de sangre con EDTA (10 ml)
Ficoll Histopaque
Tubo de ensayo
Gradilla para tubo de ensayo
Micropipeta
III. PROCEDIMIENTO:
1. Preparar un tubo ependorf con 400 de Ficoll histopaque.

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2. Agregar cuidadosamente la muestra de sangre diluida (800) al tubo falcon que contiene
los 400 de Ficoll-histopaque.

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3. Centrifugar a 1800 rpm por 20 minutos a T.A. sin utilizar freno.

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 4. Observar e identificar los componentes que se encuentran en el tubo falcon.

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IV. CUESTIONARIO:

1.- De qu tipo de clulas estn compuestas las PBMC y en qu porcentajes aproximadamente?

Al estratificar una muestra de sangre sobre el Ficoll-histopaque y centrifugar, las clulas

mononucleares se separan de las dems debido a diferencias de densidad. Como se mencion, el
Ficoll aglutina los eritrocitos, por lo que estos pasan a travs del medio y sedimentan al fondo. Los
granulocitos tambin sedimentan por su tamao y densidad, y por su tendencia a formar
agregados. Los mononucleares (linfocitos y monocitos), por su menor densidad, se quedan en la
interfase entre el plasma y el medio, con una contaminacin relativamente baja de plaquetas y
otros tipos celulares. Al final de la centrifugacin, los leucocitos mononucleares se recogen del
anillo blanco que se forma en la interfase entre el plasma y el Ficoll. Este procedimiento permite
recuperar alrededor de un 50% de los linfocitos presentes en la muestra, con una viabilidad mayor
del 90%. Por ejemplo, el fabricante del Ficoll describe los resultados obtenidos con su medio de la
siguiente manera:

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2.- Qu es el Ficoll-histopaque y cmo funciona en este protocolo?

- El Ficoll es un polisacrido hidroflico altamente ramificado, y es soluble en

soluciones acuosas.
- Ficoll hace parte de Ficoll-histopaque. Este es utilizado muy comnmente en
laboratorios de biologa molecular con el fin de separar los componentes de la
sangre tales como los eritrocitos, granulocitos y leucocitos entre otros.
El ficoll en este protocolo acta como un medio de densidad constante, y la densidad de este
lecho debe ser intermedia entre la de los tipos celulares que se quieren separar.

3.- Mencione 3 ejemplos de uso de los PBMC en investigacin en humanos

Se emplean en la investigacin del virus HIV porque las PBMCs incluyen los linfocitos T4,
que el HIV infecta.
Se ha identificado que las PBMC son capaces de reflejar el desarrollo de un perfil de
expresin gnica caracterstico del estado obeso asociado a la ingesta de dietas ricas en
grasa desde etapas iniciales del desarrollo de la patologa, por lo que pueden ser utilizadas
como fuentes de biomarcadores primerizos de obesidad.

La presencia de granulocitos inmaduros entre las clulas mononucleares de sangre

perifrica (PBMC, de sus siglas en ingls) de un paciente indica que este padece lupus
eritematoso sistmico (comnmente conocido como lupus), segn revela una
investigacin del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC). Este tipo de
clulas sanguneas slo suelen aparecer en la mdula sea y tras una infeccin bacteriana.

El hallazgo, publicado en la revista Journal of Proteomics, se ha realizado mediante la

comparacin del conjunto de protenas (proteoma) de los PBMC de pacientes con lupus e
individuos control. Los resultados indican que la protena S100A9 se sobreexpresa en
casos de lupus y su actividad est correlacionada con el nivel de granulocitos inmaduros
en la PBMC.

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4.- Cul es el fundamento de la centrifugacin diferencial y mencione 5 aplicaciones en
investigacin?

La centrifugacin diferencial se basa en la existencia de diferentes partculas en la suspensin que

difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poca
fuerza de aceleracin) sedimentarn las partculas mayores y/o ms densas. Cuando el
sobrenadante de la primera centrifugacin es centrifugado de nuevo en condiciones de ms
tiempo y ms fuerza de aceleracin sedimenta de nuevo las partculas ms densas presentes y as
sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugacin y
obtener una coleccin de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partculas
de diferente tamao y/o densidad.

- Separacin de partculas grandes como clulas o precipitados de sales insolubles.

- Separacin de ribosomas, virus o macromolculas en general.
- Aislar partculas de bajo coeficiente de sedimentacin (microsomas, virus,
macromolculas).
- En la industria lechera, se centrifuga la leche, para la obtencin de crema, ya que
separa las partculas ms pesadas (quesaina) del lquido (suero) por accin de la
fuerza centrfuga.
- En las plantas de extraccin de aceite de palma (las cuales hay principalmente en
Malasia y en Colombia) hay una seccin de separacin que est basada en la
centrifugacin.
5.- Qu es el ETDA y cul es su reaccin con la sangre?
EDTA (cido etilendiaminotetractico):
Sal disdica o tripotsica del cido etilendaimintetractico, siendo esta ltima ms
soluble.
Este anticoagulante acta como agente quelante del Calcio, lo que impide su
activacin y no deja producir la coagulacin sangunea, dado que al PH que se lo
trabaja, el EDTA tiene una accin complejante muy potente.
Es uno de los anticoagulantes exgenos por excelencia, ya que cumple con varios
parmetros para ser un buen anticoagulante -no alterar la morfologa eritrocitaria
ni leucocitaria, inhibe la aglutinacin de plaquetas, asegura la conservacin de
elementos formes durante 24 horas si las muestras son conservadas a 4C-.

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V. RECOMENDACIONES
- Evitar mezclar el Ficoll-histopaque y la muestra por mucho tiempo.
- Evitar la contaminacin con glbulos rojos.
- Verificar el vencimiento de los reactivos.
- Tener en cuenta las medidas de seguridad para evitar incidentes dentro del rea de
trabajo.
- Usar los equipos necesarios de proteccin para evitar contaminaciones (guantes,
lentes, etc)
VI. CONCLUSIONES
NO TENGO
IDEAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAA

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VII. BIBLIOGRAFIA
1. Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, et al.
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