Estudo da Purificao de Amiloglicosidase de Aspergillus

niger NRRL 3122 Usando Resina de Troca Inica DEAE-

Celulose em Coluna de Leito Fixo

Simone Meinhardt, Ana Paula Manera, Denyson Zidko, Luciana M. Brites, Jorge A. V.
Costa, Carlos Andr V. Burkert e Susana Juliano Kalil

Fundao Universidade Federal do Rio Grande Depto. de Qumica

Rua Eng. Alfredo Huch - 475, 96201-900 Rio Grande/RS, Brasil
dqmsjk@super.furg.br

RESUMO

Neste trabalho foram realizados testes para determinao das condies de purificao da
enzima amiloglicosidase, produzida por Aspergillus niger NRRL 3122, usando resina de troca
inica em coluna de leito fixo. Os testes de purificao foram conduzidos em um sistema de
cromatografia de troca inica em coluna C 10/20 da Pharmacia contendo resina aninica
DEAE-celulose. A eluio foi realizada com NaCl em tampo Tris-HCl 0,025M, pH ajustado
para o valor desejado, alimentado na forma de gradiente linear crescente. Em busca de
melhores condies de purificao foram testadas as variveis velocidade linear de
alimentao, temperatura de operao e volume de alimentao. O melhor rendimento e o
melhor fator de purificao foram observados quando empregou-se velocidade linear de
alimentao de 8 cm/h, temperatura de 10C e volume de alimentao de 6mL.

INTRODUO

O aproveitamento integral e racional dos recursos agrcolas disponveis tem importncia

fundamental para se alcanar a auto-suficincia alimentcia e tecnolgica (Gutierrez-Rojas &
Torres, 1992). Os resduos agroindustriais so excelentes substratos para fermentaes em
estado slido na produo de enzimas. Neste aspecto, o farelo de arroz, subproduto gerado
durante o beneficiamento do arroz, constitui um substrato adequado para utilizao nestes
processos fermentativos.
A partir do processamento do arroz, obtm-se em mdia 72% de gros limpos, 19% de
cascas e 9% de farelo. Do farelo extrado o leo comestvel, gerando o farelo de arroz
desengordurado, que apresenta baixo valor comercial em funo do seu baixo teor protico,
porm apresenta cerca de 50% de carboidratos (Moraes, 1999), sendo este um componente
nutritivo apropriado para que microrganismos possam crescer e excretar enzimas (Reguly,
2000).
A amiloglicosidase (-1,4 D-glucan-glocohidrolase) uma enzima extracelular, que cinde
as ligaes do amido at glicose, sendo importante para indstrias de alimentos e bebidas
(Reguly, 1996). Esta enzima representa aproximadamente 30% da produo mundial de
enzimas (Maarel, et alii, 2002). Apesar de outras culturas de microrganismos tambm
produzirem esta enzima, a amiloglicosidase produzida por Aspergillus preferida por sua
maior termoestabilidade, alm de se encontrar no produto final baixa atividade de
transglicosidase.
 As etapas de recuperao, concentrao e purificao constituem uma parte importante do
processo biotecnolgico para obteno de produtos de alta pureza. Na produo comercial de
enzimas microbianas, os custos das operaes de recuperao podem alcanar at 80 % do
custo final do produto (Castilho et alii, 1999). Para minimizar estes custos importante a
escolha de mtodos de separao e purificao adequados, e o estudo de sua otimizao, de
modo a se obter um bioproduto comercialmente vivel.
A indstria biotecnolgica tem utilizado o fenmeno da adsoro de protenas em matrizes
slidas como princpio para a separao e purificao de bioprodutos. Os grupos ionizveis
dos aminocidos, de que so compostas as protenas, conferem s mesmas uma natureza
polinica responsvel pelas interaes eletrostticas sobre resinas adsorventes e apropriadas.
As molculas ligam-se ao adsorvente ao deslocarem os contra-ons que se situam nos pores da
resina. Em conseqncia, na regio de adsoro a resina se torna eletricamente neutra, sendo o
saldo de cargas da protena do mesmo sinal que os contra-ons deslocados. Este mecanismo de
adsoro recebe o nome de troca de ons (Quadri et alii, 2000).
Estima-se que a cromatografia de troca inica utilizada em cerca de 75% dos esquemas
preparativos. As razes para tal sucesso e ampla ampliao, so o elevado poder de resoluo,
a elevada capacidade e o custo relativamente baixo (Chang e Chase, 1996).
Considerando-se a importncia industrial da amiloglicosidase na produo de xaropes de
glicose, o crescente interesse pela fermentao em estado slido, particularmente atravs de
um aproveitamento nobre do farelo de arroz desengordurado, e a necessidade de um estudo
mais detalhado da etapa de purificao, desenvolveu-se o presente trabalho. O objetivo
principal foi avaliar a influncia da velocidade linear de alimentao, temperatura de operao
e volume de alimentao na purificao da enzima pela resina DEAE-celulose, tendo como
resposta o rendimento e fator de purificao.

MATERIAL E MTODOS

Amiloglicosidase
A enzima amiloglicosidase foi obtida por fermentao em estado slido, em frascos
erlenmeyers, utilizando a cepa de Aspergillus niger NRRL 3122. Foi utilizado como substrato
85% de farelo de arroz desengordurado modo em moinho de facas e peneirado, para obter
uma granulometria entre 0,354 e 0,595 mm, e para diminuir o problema de compactao do
meio acrescentou-se 15% de casca de arroz de tamanho mdio entre 0,841 e 1,680 nm. Ao
substrato foi acrescido os sais, apresentados na tabela 1, ficando o meio com umidade final de
50% (Sanzo et alii, 2001).

Tabela 1: Composio da soluo salina

Sais Concentrao (g.L-1)
KH2PO4 2,0
MgSO4 1,0
NH2CONH2 1,8

As condies de produo da enzima foram 30C, pH 3,5 por 72 horas.

Extrao da enzima
A extrao foi realizada atravs da diluio de 1g de farelo fermentado em 9mL de gua em
frascos erlenmeyer e posterior agitao por 3 horas a 200 rpm a 20C (Costa, 1996). Em
seguida a suspenso foi filtrada em papel de filtro Whatman no 1, para remover os slidos e
obter um extrato claro, utilizado para medir a atividade enzimtica.
Resina adsorvente
Em todos os ensaios foi utilizada a resina aninica DEAEcelulose (Sigma ). Ao incio de
cada teste a resina era lavada no tampo adequado at atingir o equilbrio.

Purificao da enzima
Os ensaios foram conduzidos utilizando uma coluna de leito fixo C 10/20 da Pharmacia
com leito de adsorvente de 10 cm. Para cada ensaio, a coluna contendo a resina foi lavada
com tampo Tris-HCl 0,025M pH 8,0 at zerar o espectrofotmetro (280 nm). A seguir foi
feita a alimentao de extrato enzimtico com o mesmo pH do tampo. Novamente lavou-se a
coluna com tampo para retornar linha base, eliminando-se as protenas no adsorvidas. A
eluio foi realizada com NaCl em tampo, alimentado em gradiente linear. Foram coletadas
na sada da coluna fraes de 2,6mL determinando-se a absorbncia (280 nm), atividade
enzimtica e protena. Ao final foi determinado o rendimento e o fator de purificao.
A tabela 2 apresenta as condies utilizadas em cada experimento. O critrio para a escolha
da melhor condio operacional foi o fator de sensibilidade.

Tabela 2:
Condies utilizadas nos testes de purificao
da amiloglicosidase em coluna de leito fixo.
Teste Temperatura de Velocidade de Volume de
operao (C) alimentao (cm/h) alimentao (mL)
1 25 8 6
2 25 8 3
3 25 46 6
4 10 8 6

Medida da atividade da amiloglicosidase

Foi utilizada a tcnica descrita por Park (1969) e modificada por Schmidell (1986) para
determinar a atividade enzimtica da amiloglicosidase no farelo. Utilizou-se como substrato
25 mL de uma soluo de amido p.a. a 4%, dissolvido em soluo tampo acetato (pH 4,2) e
1,0 mL de extrato enzimtico na diluio adequada. O branco foi feito com 1 mL de gua
destilada no lugar da enzima. A mistura foi mantida em banho a 60 oC, por 60 minutos. Aps, a
reao foi paralisada, colocando-se a soluo em banho de gua fervente por 5 minutos. Os
acares redutores liberados foram quantificados pelo mtodo do reagente cido 3,5-
dinitrosaliclico (DNS), usando-se glicose como padro (Miller,1959).
Uma unidade de amiloglicosidase, IU (International Unit), foi definida como a quantidade
de micromoles de acares redutores, expressos como glicose, liberados por minuto pela
enzima extrada de um grama de farelo fermentado sob as condies de ensaio descritas
(Pandey e Radhakrishnan, 1992).

Dosagem de protena
A concentrao de protenas foi determinada pelo mtodo de Lowry et alii (1951),
utilizando albumina de soro bovino (BSA) como protena padro.

RESULTADOS E DISCUSSO
 Atravs da medida da atividade enzimtica e da dosagem de protena foram obtidos a
atividade especfica, o fator de purificao e a recuperao para cada ensaio de
purificao da enzima amiloglicosidase pela resina de troca inica DEAE celulose
(Tabela 3).
O estudo da influncia dos parmetros operacionais na recuperao e no fator de purificao
foi feito atravs do clculo do fator de sensibilidade.
O fator de sensibilidade (S) definido como:

Valor obtido na varivel de sada Valor de referncia da varivel de sada

Valor de referncia da varivel de sada
S= (1)
Valor alterado da varivel de entrada Valor de referncia da varivel de entrada
Valor de referncia da varivel de entrada

O fator de sensibilidade representa a porcentagem de alterao na varivel de sada

(recuperao, R, e fator de purificao, FP) por unidade de porcentagem alterada na varivel
de entrada (temperatura, velocidade de alimentao e volume de alimentao). Valores
positivos representam ganho e valores negativos representam queda.

Tabela 3: Purificao da amiloglicosidase em coluna de leito fixo contendo resina DEAE-

celulose
Volume Atividade Protena Atividade FP* Recuperao
Ensaio (mL) total total especfica (%)
(U) (mg) (U/mg)
1 Extrato 6 10,3566 16,8600 0,6143 1 100
enzimtico
DEAE- 7,8 2,1727 0,3614 6,0111 9,78 20,98
celulose

2 Extrato 3 5,0533 7,2878 0,6934 1 100

enzimtico
DEAE- 18,2 1,2706 0,7790 1,6311 2,35 25,14
celulose

3 Extrato 6 40,1646 13,5363 2,9672 1 100

enzimtico
DEAE- 7,8 1,6158 0,0945 17,0984 5,76 4,02
celulose

4 Extrato 6 12,1209 11,4576 1,0579 1 100

enzimtico
DEAE- 20,8 5,5455 0,5313 10,4376 9,87 45,75
celulose
*FP- Fator de purificao

Para os clculos dos fatores de sensibilidade foi utilizado como ensaio de referncia o
ensaio 1, tendo como condies operacionais temperatura de 25C, velocidade de
alimentao de 8cm/h e volume de alimentao de 6mL. Os valores obtidos so apresentados
na tabela 4.
 Tabela 4: Fator de sensibilidade dos parmetros operacionais da coluna
Parmetro Fator de alterao* SR** SFP**
Temperatura - 2,50 + 1,9677 + 0,0153

Velocidade de alimentao 5,75 - 0,1701 - 0,0860

Volume de alimentao - 2,00 + 0,3965 - 1,5194

* Em relao ao valor de referncia
** O ndice corresponde varivel de sada

Observa-se que a recuperao apresentou um substancial ganho com a diminuio da

temperatura de 25 para 10C e em menor proporo com a diminuio do volume de
alimentao (de 6 para 3mL). J o aumento da velocidade de alimentao (de 8cm/h para
46cm/h) resultou em reduo da recuperao da enzima.
O fator de purificao foi pouco influenciado pela reduo da temperatura de operao,
ocorrendo um pequeno incremento. Todavia, foi fortemente influenciado com a diminuio do
volume de alimentao e, em menor grau, com o uso de uma maior velocidade de
alimentao, havendo em ambos os casos reduo de seu valor.
Portanto, conveniente trabalhar com temperatura e velocidade de alimentao menores.
Quanto ao volume injetado, apesar de o menor volume incrementar a recuperao, a queda
acentuada do FP no recomenda esta reduo.
Pode-se observar, entre os ensaios testados, que os melhores resultados foram obtidos no
ensaio 4, quando usado temperatura de operao de 10C, 8cm/h como velocidade de
alimentao e volume de extrato enzimtico de 6mL. Neste ensaio, a recuperao foi de
45,75% e o fator de purificao foi de 9,87 vezes, considerando todos os picos que
apresentaram atividade enzimtica.
Bonnerjea et alii (1986) apresentam uma reviso com cerca de 100 artigos onde o fator
mdio de purificao para cromatografia de troca inica est ao redor de 10, o que condiz com
os resultados aqui apresentados.
Figura 1: Cromatografia em coluna de leito fixo DEAE-celulose, com leito de 10cm de
altura, utilizando 8cm/h como velocidade de alimentao, 6mL como volume de
alimentao e trabalhando temperatura de 10C.

A figura 1 apresenta a purificao da enzima amiloglicosidase pela resina DEAE celulose

em coluna de leito fixo, utilizando as condies estabelecidas no ensaio 4. Foram alimentados
6mL de extrato enzimtico. Aps foi feito lavagem da coluna para retirada das protenas no
adsorvidas com 32mL de tampo Tris HCl 0,025M pH 8,0. A eluio iniciou-se aps 38mL
de volume coletado. Ocorreram trs picos de atividade enzimtica nas concentraes salinas
de 0,2M, 0,35M - 0,4M e 0,5 - 0,55M denominados amiloglicosidase I, amiloglicosidase II e
amiloglicosidase III. Considerando a recuperao de cada pico, obteve-se 19,71%, 14,15% e
11,89%, respectivamente.

Stamford et alii (2002) trabalhando com purificao de amiloglicosidase de

Streptosporangium sp tambm observaram sada de trs picos com atividade de
amiloglicosidase ao realizar cromatografia por permeao em gel.

CONCLUSES

A temperatura apresentou-se, dentre os parmetros estudados, como o que mais influenciou

no fator de purificao e na recuperao da enzima amiloglicosidase pela resina DEAE
celulose em coluna de leito fixo, tendo sua diminuio levado a uma melhoria do processo.
Atravs da anlise dos resultados conclui-se que as condies mais favorveis de
purificao foram temperatura de 10C, 8cm/h como velocidade de alimentao e 6mL de
volume de extrato. A adoo destas condies proporcionou uma recuperao de 45,75% e um
fator de purificao de 9,87.

AGRADECIMENTOS

Ao apoio financeiro: CNPq e FAPERGS.

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