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GUA PRCTICA
1 Laboratorio de Fertilidad Masculina, Departamento de Bioqumica Clnica, Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad
Abstract Semen analysis is an essential laboratory test in the evaluation of infertility for the study of male
genital diseases and other diseases such as those caused by exposure to chemicals, environmental
factors and drugs. Semen analysis includes assessing sperm, seminal plasma and the presence of
other cells such as leukocytes and germ line cells. This analysis provides important information on
the process of spermatogenesis, sperm function and function of annex glands. This analysis includes
both a macroscopic examination (color, appearance, viscosity, liquefaction and volume of semen) and
ISSN 1515-6761 Ed. Impresa a microscopic examination (sperm count, motility, morphology and vitality). A rigorous quality control
ISSN 2250-5903 Ed. CD-ROM
Cdigo Bibliogrfico: RByPC should also be made to ensure the reproducibility of the results and minimize inter- and intra-observer
Fecha de Recepcin: errors. This guide provides the essential guidelines to conduct a proper assessment of human semen
24/02/2015
Fecha de Aceptacin: according to the regulations of the World Health Organization.
19/04/2016 Key words: spermatic, infertility, morphology, recommendations
trasladada al laboratorio antes de transcurrida una completa o incompleta despus de este tiempo.
hora de la recoleccin y se la proteger de las tempe-
raturas extremas (no menor de 20C ni mayor de 37C) D. Volumen
durante el traslado al laboratorio. Las glndulas accesorias que ms contribuyen al volumen
3- La muestra deber obtenerse mediante masturbacin del eyaculado son las vesculas seminales y la prstata,
y eyacularse dentro de un recipiente pequeo, limpio, mientras que las glndulas bulbouretrales de Cowper, las
de vidrio o plstico y de boca ancha. El mismo, de ser glndulas uretrales de Litre y el epiddimo aportan una pe-
posible, deber estar tibio para reducir el riesgo de quea fraccin.
shock por fro. La OMS recomienda informar los parmetros del semen en
4- Cuando por circunstancias especiales no sea posible el total del eyaculado por lo que la medida precisa del volu-
obtener el semen mediante masturbacin, se podr men es esencial.
utilizar un condn de plstico inerte especfico para Los mtodos recomendados para la medicin del volumen
este fin (colector seminal). El coitus interruptus no es son:
aceptable para hacer la recoleccin del semen porque Por pesada: se debe recoger el semen en un frasco pre pe-
puede perderse la primera porcin del eyaculado que sado y luego se lo vuelve a pesar con el semen, dado que
contiene la mayor concentracin de espermatozoides. la densidad del semen es aproximadamente 1g/ml, el peso
Adems, puede existir contaminacin vaginal (clulas, obtenido ser igual al volumen de semen en ml.
bacterias) y el pH cido vaginal ejerce un efecto adver- El valor de de referencia es 1.5 m.
so sobre la motilidad de los espermatozoides.
5- Las muestras incompletas no se deben analizar, pero E. Viscosidad
en aquellos casos tales como: dificultades psicolgi- Para su estimacin se pueden utilizar dos mtodos:
cas, imposibilidad de repetir el estudio, problemas fsi- El ms sencillo y recomendable consiste en recoger la
cos, y otras circunstancias que as lo ameriten, se pro- muestra con pipeta Pasteur de plstico y dejar caer gota
cesar la muestra y se informar al mdico lo ocurrido. a gota.
Las muestras de semen se deben analizar dentro de la pri- Tambin puede hacerse introduciendo una varilla de vi-
mera hora despus de su recoleccin. drio en la muestra y observar el filamento que forma al
retirarla.
Etapa analtica En cualquiera de los dos mtodos se considera anormal
cuando se forma un filamento de ms de 2 cm, mientras que
Evaluacin macroscpica: en una muestra normal, la cada debe ser gota a gota.
A. Color No hay que confundir una muestra viscosa con una mues-
El color normal del semen licuado es gris claro (blanqueci- tra no licuada. El aspecto de la muestra puede ser lquido,
no), pudiendo presentar otros colores debido a situaciones homogneo y luego hacer un gran filamento cuando la reco-
patolgicas: leucocitospermia (amarillento), hemospermia gemos con pipeta Pasteur, en este caso nos encontramos
(rojizo/amarronado) o colores varios por la ingesta de dro- frente a una muestra muy viscosa. El resultado es normal o
gas o vitaminas. aumentada.
B. Aspecto F. pH
El aspecto del semen da idea de la cantidad de clulas que El pH del semen refleja el equilibrio entre los valores de pH
tiene en suspensin, y se relaciona directamente con el vo- de las diferentes secreciones de las glndulas accesorias,
lumen de eyaculado, por lo que frente a grandes volmenes principalmente la secrecin de vescula seminal alcalina y
podr presentar un aspecto menos opaco o viceversa. la secrecin cida prosttica. El pH debe medirse cuando
Normalmente el semen tiene aspecto opalescente u opaco. el semen est licuado en un tiempo estandarizado, prefe-
rentemente despus de 30 minutos de obtenido, de no ser
C. Licuefaccin posible se medir dentro de la hora de la eyaculacin.
El semen coagula casi inmediatamente despus de su eya- El pH del semen aumenta normalmente con el tiempo por la
culacin para nuevamente licuarse entre 5 y 40 minutos prdida de CO2 que se produce luego de la eyaculacin, por
despus, por la accin del antgeno prstata-especfico, lo que los valores altos de pH proporcionan poca informa-
pero dado que su traslado puede demorarse hasta 1 hora, cin de utilidad clnica si no fue determinado rpidamente.
la OMS sugiere que todas las muestras sean evaluadas a los Si el pH es inferior a 7,0 en una muestra de semen con un vo-
60 minutos post obtencin. lumen bajo y bajo nmero de espermatozoides, puede haber
En caso de no licuar a los 60 min se observarn en la mues- obstruccin del conducto eyaculador o frente a muestras
tra, cogulos gelatinosos de diversos tamaos en los que azoosprmicas tratarse de ausencia bilateral congnita de
los espermatozoides se encontrarn inmviles. El resulta- los conductos deferentes, condicin en la que las vesculas
do puede ser normal o anormal, o expresado de otra forma seminales tampoco estn presentes.
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evaluar varios campos y promediar las observaciones. miento de cada sistema y platina termostatizada a 37 C.
Como se describi previamente la observacin microscpi- - Software: programa informtico compuesto por distintos
ca inicial se realiza en una cmara cuya altura es 20m y a mdulos: movilidad, concentracin, morfologa, base de
400x, lo que determina que el volumen de cada campo sea datos e informes. Sin embargo, el uso de sistemas CASA pre-
aproximadamente de 4nl (dimetro aproximado del campo senta algunos inconvenientes:
microscpico: 500m)2, por lo cual al contar la cantidad de Se puede tender a una sobreestimacin de la concentracin
espermatozoides presentes por campo se tendr una idea espermtica, debido a que el software puede contabilizar el
aproximada de la concentracin espermtica de la muestra. mismo espermatozoide dos veces por las colisiones esper-
mticas. Esta sobrestimacin se produce en menor medida
CASA (Computer Assisted Semen Anlisis) cuanto ms diluida este la muestra, ya que disminuyen las
El mtodo estndar para evaluar la motilidad espermtica colisiones.
ha sido y sigue siendo la clasificacin subjetiva de los esper- Algunos equipos como el SCA (Sperm Class Analyzer, Mi-
matozoides en el semen. Este mtodo sin embargo, es obje- croptic S.L., Barcelona, Espaa), permiten al operador cam-
to de gran variacin inter-laboratorios. La introduccin del biar las condiciones de medida y otorgar validez a las im-
anlisis de semen asistido por computadora (CASA= Compu- genes digitales.
ter Assisted Semen Analysis) ha permitido una ms objetiva No existe una estandarizacin y optimizacin de los equi-
y sofisticada evaluacin de la movilidad. La tcnica CASA tie- pos y de los procedimientos utilizados en los anlisis.
ne la ventaja de aumentar la precisin y reproduccin de las Cada laboratorio utiliza un equipo diferente, con diferentes
mediciones de movilidad espermtica y permite conservar caractersticas tcnicas que dan lugar a resultados muy
la video-documentacin de las muestras analizadas. dispares entre centros.
Los sistemas CASA estn integrados por los siguientes com- A los resultados les afectan diferentes factores como la
ponentes: temperatura de la muestra, volumen, tipo de cmara, con-
- Hardware: ordenador (PC), cmara de video, microscopio p- centracin de la muestra como as tambin cuestiones vin-
tico de contraste de fase positivo o negativo segn el requeri- culadas al suministro elctrico que condicionan la tensin
que llega al equipo. Por ello, es necesario que cada equipo
Tabla 1: Diferencias aceptables entre dos porcentajes estandarice un protocolo, sabiendo que los resultados se-
segn el promedio entre ambos para intervalos de rnnicamenteaplicables a muestras evaluadas con el
confianza del 95% equipo en cuestin.
Promedio (%) Diferencia aceptable Salvando los inconvenientes, el CASA es el mejor sistema
para un anlisis preciso y rpido de una muestra de semen4.
0 1
1 2 Test de vitalidad
2 3 La OMS indica que el test de vitalidad debe realizarse de for-
ma rutinaria a todas las muestras y considera que es parti-
3-4 4 cularmente importante cuando la movilidad progresiva de la
5-7 5 muestra es menor de 40%.
8 - 11 6 El estudio de vitalidad se realizar empleando colorantes su-
pra vitales denominados as, porque penetran en las clu-
12 16 7 las cuya membrana plasmtica est daada, por lo que los
17 23 8 espermatozoides muertos estarn coloreados y los vivos se
vern sin colorante sean mviles o inmviles.
24 34 9
Se basa en que los colorantes no pueden atravesar una
35 65 10 membrana plasmtica estructuralmente intacta, de tal for-
66 76 9 ma que un espermatozoide vivo ser aquel cuyo ncleo no
est teido de rojo; y en el caso de que la membrana est
77 83 8
estructuralmente daada ser atravesada por los coloran-
84 88 7 tes, por lo que un espermatozoide muerto ser aquel cuyo
89 - 92 6 ncleo se tia de rojo.
93 95 5
Tcnicas sugeridas
96 97 4 Eosina-nigrosina (permite la conservacin de los extendi-
98 3 dos secos para su evaluacin diferida o para emplear como
CCI de la determinacin).
99 2 Esosina (se determina en fresco luego de 30 seg. de mez-
100 1 clar el colorante con la muestra y no se puede conservar el
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obtenidos con los de la cmara de Neubauer mejorada y a Si la muestra tiene baja concentracin se debe:
travs de un Control de Calidad Externo peridico evaluar 1- Centrifugar a 600g durante 10 mnutos.
el desempeo para asegurar la fiabilidad y exactitud de los 2- Posteriormente re suspender el pellet.
resultados. 3- Se hace la extensin de la manera antes descripta.
4- Secar la muestra al aire
Morfologa espermtica 5- Fijar
El estudio clsico de morfologa espermtica se caracteriza 6- Colorear (Tcnicas de coloracin recomendadas: Papa-
por la utilizacin de espermatozoides fijados y coloreados, nicolaou o Diff-Quick)
lo que tiene como limitacin no poder definir las caracters- 7- Evaluacin de la morfologa espermtica por duplicado
ticas cinticas de los espermatozoides clasificados como (% de formas normales) con microscopio ptico con in-
normales o anormales. Si bien los manuales de estandari- mersin con objetivo 100x.
zacin definen cuali y cuantitativamente los parmetros de 8- Si los porcentajes son promediables (ver tabla 1) se in-
una clula espermtica, la experiencia del observador es forma el promedio de los porcentajes, sino se realizan
extremadamente importante para dar resultados consis- otras dos evaluaciones.
tentes y reales, sumado a la calidad de preparacin de los El valor de referencia es 4% (formas normales)
extendidos espermticos y la tincin de los mismos. Es importante seguir las instrucciones ya que un volumen
El mtodo microscpico subjetivo tiene grandes variaciones de muestra mayor producira una extensin con los esper-
entre laboratorios e incluso intra y entre tcnicos de un mis- matozoides menos dispersos dificultando la visualizacin
mo laboratorio, debido a que la veracidad y la precisin es- de todas las partes del espermatozoide.
tn limitadas por el sistema de medida y por la destreza del El desarrollo de mtodos objetivos para la evaluacin de la
observador. Para reducir estos errores atribuibles al mto- morfologa espermtica constituye la mayor promesa para
do de valoracin visual, se deben estandarizar los procedi- mejorar el valor predictivo del parmetro, siendo el ideal la
mientos, utilizar criterios universales e introducir controles observacin en fresco y en simultneo con la determinacin
de calidad internos y externos. de la movilidad, para evitar de ese modo cambios en la es-
La clasificacin de normalidad de la OMS se basa en consi- tructura del espermatozoide provocados por la metodologa
derar un espermatozoide normal al integrante de una sub- empleada, y posibilitar as la clasificacin de cada esperma-
poblacin de espermatozoides potencialmente fertilizado- tozoide segn su movilidad y morfologa al mismo tiempo..
res seleccionados naturalmente en el moco cervical. Actualmente la implementacin de estos mtodos, no han
dado resultados favorables, por lo que la sugerencia es se-
El procedimiento para evaluar la morfologa espermtica es guir un entrenamiento continuo, y mediante el control de
el siguiente: calidad interno del laboratorio y los Programas de Evalua-
1- Se debe realizar por duplicado. cin Externa, mantener un adecuado coeficiente de varia-
2- Depositar de 5-10l de muestra bien homogenizada en cin intra, inter-operador y entre-laboratorios5,6.
el extremo del portaobjetos.
3- Extender la gota suavemente con otro portaobjetos. Clulas no espermatozoides:
El eyaculado adems de poseer espermatozoides, posee
Tabla 3: Diferencias aceptables entre duplicados de contajes correspondientes a la suma entre los mismos
Diferencia Diferencia Diferencia
Suma Suma Suma
aceptable aceptable aceptable
35-40 12 144 156 24 329 346 36
41-47 13 157 169 25 347 366 37
48-54 14 170 182 26 367 385 38
55-62 15 183 196 27 386 406 39
63-70 16 197 211 28 407 426 40
71-79 17 212 226 29 427 448 41
80-89 18 227 242 30 449 470 42
90-98 19 243 258 31 471 492 43
99-109 20 259 274 32 493 515 44
110-120 21 275 292 33 516 538 45
121-131 22 293 309 34 539 562 46
132-143 23 310 - 328 35 563 - 587 47
Manual OMS 2010.
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otros elementos y clulas que pueden tener importancia cunstancias, generalmente relacionadas a fenmenos que
clnica7. Esto incluye clulas epiteliales del tracto genitou- involucren la ruptura de la barrera hematotesticular, la exis-
rinario, leucocitos y clulas inmaduras de la espermatog- tencia de anticuerpos anti espermticos puede hallarse en
nesis. Estas clulas llamadas en general clulas redondas el screening bsico seminal propuesto en la evaluacin ini-
pueden ser identificadas en el frotis teido de la muestra cial del varn infrtil.
y/o tambin con ayuda de la determinacin de la enzima Estos anticuerpos pueden producir fenmenos de autoaglu-
peroxidasa presente en los neutrfilos en fresco. Su con- tinacin, como as tambin de inmovilizacin de los esper-
centracin se determina de la misma forma en que se reali- matozoides, siendo en muchos casos causa de astenozoos-
za el recuento espermtico en cmara pero empleando una permia.
dilucin apropiada (en general menor) segn la estimacin Si bien, la incidencia del factor inmunolgico en infertilidad
de su concentracin, realizada en fresco del mismo modo no supera el 10 %, en casos de infertilidad idioptica, en
como se estima la concentracin espermtica. pacientes con varicocele, en aquellos con antecedentes de
El manual de la OMS propone que las concentraciones de los infeccin del tracto reproductivo masculino y previo a tcni-
distintos tipos celulares pueden ser indirectamente cuanti- cas de fertilizacin asistida, es importante descartar al fac-
ficados, determinando la tasa entre espermatozoides y c- tor inmune como responsable de alteraciones seminales.
lulas redondas que se encuentren en el frotis teido y luego Se sugiere como screening para la evaluacin de autoinmu-
correlacionando esta tasa con la concentracin espermti- nidad seminal, la tcnica conocida como Mar Test (Mixed
ca, sin embargo en la experiencia este mtodo result ms Antiglobulin Reaction Test), en la que de manera sencilla
impreciso y dificultoso de realizar que el recuento en cma pueden detectarse anticuerpos (Ac) anti-espermticos del
tipo IgG sobre la superficie espermtica. La tcnica directa
Tcnica de peroxidasa para leucocitos polimorfonucleares utiliza semen fresco del paciente, que debe tener una con-
en semen centracin mnima de espermatozoides y un % de formas
Solucin A: mviles mnimo del 10%, glbulos rojos (GR) o partculas
-25 ml de etanol 96% de ltex cubiertas con anticuerpos incompletos, isotipo IgG,
-25 ml de agua destilada que mezclados con los Ez sin lavar y con el agregado de anti
-0,0625 g de bencidina inmunoglobulina humana (anti-IgG cadena gamma) en ex-
Solucin B: ceso, formaran aglutinados, que sern mixtos (GR-Ez), en el
H2O2 al 3% (dura preparada 30 das) caso de haber Ac anti-espermticos presentes o solo de GR
Solucin C: de no haber Ac. Se cuentan como positivos los espermato-
Buffer PBS (pH: 7) zoides mviles unidos a GR.
Solucin de trabajo Es importante remarcar que este test tambin puede ser
- 4 ml de(A) + 50 l de H2O2 (B), prepararla en el momento realizado en forma indirecta (mtodo indirecto) en suero,
de uso. lquido folicular, plasma seminal y moco cervical pre-incu-
bando el fluido a investigar con semen sin anticuerpos anti-
Tcnica espermticos.
-En tubo de Khan: 40 l de solucin de trabajo + 20 l de PBS El valor de referencia es: < 50 % de espermatozoides unidos
(C) a temperatura ambiente + 20 l de semen entero. Dejar a glbulos rojos o partculas.
5 minutos a temperatura ambiente.
- Cargar la cmara de Neubauer Recomendaciones:
- Contar en el retculo de rojos los 25 cuadraditos. 1. Adherir a estandarizaciones internacionales. El Manual
n x 4 x 10.000 = peroxidasa (+) / ml de semen OMS (2010) 5 edicin puede descargarse en forma
10000= factor de la cmara para llevar a ml gratuita de internet: http://whqlibdoc.who.int/publica-
tions/2010/9789241547789_eng.pdf
Factor inmunolgico: 2. Implementar Controles de Calidad Internos. Sugerimos
Se conoce desde mucho tiempo atrs, la antigenicidad del tener un set de extendidos y realizar peridicamente su
semen como fluido y la presencia de sustancias potencial- re-evaluacin, determinar el CV intra e interoperador del
mente antignicas en el plasma seminal y la clula esper- laboratorio e implementar el uso de cartas de control de
mtica, todo esto ampliamente descripto en la literatura. las Medias Mensuales de los parmetros del semen
El organismo afortunadamente dispone de mecanismos (descripto en el Manual de la OMS) para determinar erro-
que contribuyen a que la aparicin del fenmeno autoinmu- res sistemticos8.
ne a nivel seminal, pueda controlarse ya sea por la existen- 3. Adherir a Programas de Evaluacin Externa de la Calidad
cia de la barrera hematotesticular, como as tambin, por nacionales y/o internacionales para evaluar el desem-
la presencia de sustancias inmunosupresoras tanto en la peo de los analitos9. El elevado Error de Medida publi-
gameta masculina como en el plasma seminal. cado por estos programas para morfologa y movilidad
Pese a lo anteriormente descripto, en determinadas cir- progresiva rpida, evidenciaron la necesidad de estan-
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