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FOTOSSNTESE E METABOLISMO DE
CARBOIDRATOS EM PLANTAS JOVENS DE
CANA-DE-ACAR SOB BAIXA TEMPERATURA E
DEFICINCIA HDRICA
Campinas, SP
Fevereiro 2014
Ficha elaborada pela bibliotecria do Ncleo de Informao e Documentao do
Instituto Agronmico
CDD. 633.61
Aos meus pais
Nelva e Ablio (in memorian),
por todo amor.
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
- A Deus.
- Ps-Graduao e ao Instituto Agronmico pela oportunidade.
- Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela bolsa de
estudos concedida.
- Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (Fapesp) pelo financiamento do
projeto.
- Dra. Ana Maria M. A. Laga pela oportunidade, orientao e ensinamentos.
- Ao Dr. Eduardo Caruso Machado por todo apoio, pacincia e ensinamentos.
- Ao Severino Nogueira por todo auxlio e ideias na montagem dos experimentos.
- minha sogra Celina, por todo amor, carinho, pacincia e dedicao nestes anos cuidando
da Carolina.
- Ao meu marido Ricardo S. Machado por todo auxlio na execuo dos experimentos e acima
de tudo pacincia e compreenso nos momentos de ausncia.
- Aos colegas da Fisiologia: Jos R. Magalhes Filho, Paulo E. R. Marchiori, Fernanda
Castro, Vernica L. Dovis, Guilherme G. Roberto, Cristina R. G. Sales e Karina I. Silva por
todo auxlio durante os experimentos e anlises bioqumicas.
- Dra. Norma de M. Erismann e Dra. Rose M. A. G. Tomaz pelo auxlio e sugestes nas
anlises bioqumicas.
- Aos professores da rea de concentrao Tecnologia da Produo Agrcola da PG-IAC,
pelos ensinamentos transmitidos.
- Ao Prof. Dr. Joaquim Albensio G. Silveira e aos alunos da Universidade Federal do Cear,
Ana Karla M. Lobo, Mrcio O. Martins e Adilton de V. Fontenele por todo auxlio nas
determinaes das atividades enzimticas.
- Ao Prof. Dr. Joaquim Albensio G. Silveira, Prof. Dr. Marcelo de A. Silva e Dra. Norma de
M. Erismann pelas sugestes na pr-banca.
- Enfim, a todos aqueles que de uma forma direta ou indireta contriburam para a realizao
deste trabalho.
v
"Desistir... eu sempre pensei seriamente nisso, mas nunca me
levei realmente a srio; que tem mais cho nos meus olhos
do que o cansao nas minhas pernas, mais esperana nos
meus passos do que tristeza nos meus ombros, mais estrada
no meu corao do que medo na minha cabea."
(Cora Coralina)
vi
SUMRIO
CAPTULO I
1 INTRODUO............................................................................................................ 2
2 REVISO DE LITERATURA.................................................................................... 3
3 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................................ 13
vii
Perodo de recuperao.................................................................................................... 69
5 CONCLUSES........................................................................................................... 70
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................... 72
viii
LISTA DE SMBOLOS E ABREVIATURAS
ix
escuro
Fv'/Fm' Eficincia quntica mxima do fotossistema II em tecidos iluminados
GLU Glicose
Glu-6-P Glicose-6-fosfato
gs Condutncia estomtica, mol m-2 s-1
H2SO4 cido sulfrico
IVA Invertase cida solvel (EC 3.2.1.25)
IVN Invertase neutra (EC 3.2.1.26)
KOH Hidrxido de potssio
LM Limitao metablica, %
MF Massa fresca
MgCl2 Cloreto de magnsio
MOPS cido 3-(N-morfolino)-propanossulfnico
MS Massa seca
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotdeo de piridina fosfato reduzida
NPQ Coeficiente de extino no-fotoqumico da fluorescncia
OAA cido oxaloactico
PEP Fosfoenolpiruvato
PEPcase Fosfoenolpiruvato carboxilase
Pi Fosfato inorgnico
PPDK Piruvato ortofosfato diquinase
PVPP Polivinilpolipirrolidona
Q Radiao fotossinteticamente ativa
QA Quinona A
Rubisco Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/ oxigenase
RuBP Ribulose-1,5-bisfosfato
SAC Sacarose
SPP Fosfatase de sacarose fosfato (EC 3.1.3.24)
SPS Sintase de sacarose fosfato (EC 2.4.1.14)
SuSy Sintase de sacarose (EC 2.4.1.13)
TN Temperatura noturna
UDP-glicose Uridina-5'-difosfoglicose
Vmax Eficincia mxima de carboxilao, mol m-2 s-1
x
Vpmax Eficincia aparente de carboxilao da fosfoenolpiruvato carboxilase, mol m-
2 -1
s
w6h Potencial da gua na folha medido antes do amanhecer, MPa
w14h Potencial da gua na folha medido s 14:00 h, MPa
CO2 Eficincia quntica da fotossntese, mol CO2 (mol ftons)-1
xi
NDICE DE FIGURAS
CAPTULO I
CAPTULO II
xii
irrigada ();TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada () e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada (). Os smbolos
indicam mdia de trs repeties ( erro padro). Perodo de aplicao
dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com retorno da
irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9............... 33
CAPTULO III
xiii
irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa
temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas (estresse mximo); dia
22 medida aps 2 dias de retorno temperatura de 32/20 C e
reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro........................... 56
xiv
plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13
dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20
medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de
recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia de 20 repeties
erro padro.................................................................................................. 60
Figura 7- (A, B) Variao no teor dos acares solveis (AS), da (C, D) sacarose
(SAC) e do amido (AMI) em folhas de cana-de-acar, cultivares
IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida
feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13
dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20
medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de
recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia de quatro repeties
erro padro.................................................................................................. 61
Figura 9- Variao da atividade das (A, B) invertases cidas (IVA) e das (C, D)
invertases neutras (IVN) em folhas de cana-de-acar, cultivares
IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida
feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas e no irrigadas; dia 13 medida feita aps 13 dias de
baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida
aps 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas
(mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno temperatura
de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao
das plantas. Smbolos indicam mdia de quatro repeties erro padro. 63
xv
NDICE DE TABELAS
CAPTULO II
Tabela 1- Teor de acares solveis totais (mol g-1 MS) em folhas de cana-de-
acar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura
noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 C -
no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e DH/TN12,
temperatura noturna de 12 C - no irrigada, no 5 dia de tratamento e 4
dia de recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5;
perodo de recuperao com retorno da irrigao das plantas e
temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.................................................... 36
Tabela 3- Teor de amido (mol de Glu g-1 MS) em folhas de cana-de-acar cv.
IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna
de 20 C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no
irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e DH/TN12,
temperatura noturna de 12 C - no irrigada. No 5 dia de tratamento e 4
dia de recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5;
perodo de recuperao com retorno da irrigao das plantas e
temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.................................................... 38
CAPTULO III
xvi
Fotossntese e metabolismo de carboidratos em plantas jovens de cana-de-acar sob
baixa temperatura e deficincia hdrica
RESUMO
xvii
IACSP95-5000 tem maior capacidade fotossinttica que a cultivar IACSP94-2094. Aps
imposio dos tratamentos, em ambas as cultivares, foram observados decrscimos da
assimilao de CO2 devido a fatores difusivos, metablicos e fotoqumicos. Entretanto, a
cultivar IACSP95-5000 foi mais tolerante ao frio devido menor reduo da assimilao de
CO2 e melhor recuperao. No entanto, sob frio e deficincia hdrica, a cultivar IACSP94-
2094 foi mais tolerante. Com a imposio dos tratamentos, foi observado aumento no teor de
acares solveis e amido foliar em ambas cultivares. Entretanto, na cultivar IACSP94-2094
sob baixa temperatura e deficincia hdrica o aumento dos acares solveis totais foi devido
ao aumento da sacarose, quando h tambm aumento da atividade da sintase de sacarose
fosfato.
xviii
Sugarcane photosynthesis and carbohydrate metabolism in young sugarcane at low
temperature and water deficit
ABSTRACT
Sucrose accumulated in stems is the most important product of sugarcane. The ability
difference to store sucrose among genotypes of sugarcane is related to physiological,
biochemical and environmental factors. The occurrence of low temperatures and water deficit
are common factors affecting the physiology of sugarcane. The aim of this work was to study
the influence of low temperature and water deficit on photosynthesis, carbohydrate
metabolism enzymes activity and leaf carbohydrate profile. Two studies were conducted, first
using IACSP94-2094 cultivar and in the second study we using two sugarcane cultivars,
IACSP94-2094 and IACSP95-5000 which have differences in their hardiness. In the first, it
was verified the photosynthetic responses of sugarcane at low night temperature (TN) and
water deficit (DH) applied isolated and combined. After 128 planting days, IACSP94-2094
plants were treated for five days with the following treatment: 1) control, with night
temperature (TN) 20 C and watered (TN20); 2) TN 20 C and water deficit (TN20/DH); 3) TN
12 C and watered (TN12) and 4) TN 12 C and water deficit (TN12/DH). After the treatment
period, plants were watered and returned to the nighttime temperature of 20 C for four days
for recovery. There was a decrease in the CO2 assimilation in treatments TN20/DH, TN12 e
TN12/DH. The total CO2 assimilation recovery was observed only in low night temperature.
The combined low night temperature and water deficit caused a negative effect on stomatal
conductance, maximum capacity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase, apparent electron
transport, PSII efficiency factor and PSII operating efficiency, causing diffusive, biochemical
and photochemical limitations of photosynthesis. Low night temperature and water deficit
caused decreases in leaf starch content, favoring an increase in sucrose content. In the second
study, it was examined the responses of photosynthesis and carbohydrate metabolism of
sugarcane under low temperature and water deficit. We used two sugarcane cultivars,
IACSP94-2094 and IACSP95-5000. At 87 days after planting, plants were treated with low
temperature (221/121 C) and water deficit for 22 days in a growth chamber. After this
period, plants were rehydrated and the temperature returned to 32 1/20 1 C for 9 days.
Under ideal environmental conditions IACSP95-5000 has a higher photosynthetic capacity
than IACSP94-2094 cultivar. After imposition of the treatments in both cultivars were
observed decreases in CO2 assimilation due to diffusive, metabolic, and photochemical
xix
factors. However the IACSP95-5000 cultivar was more tolerant to chilling, due to lower
reduction in CO2 assimilation and better recovery. While under low temperature and water
deficit, the IACSP94-2094 cultivar was more tolerant. With the imposition of the treatments,
it was observed an increase in soluble sugars and starch in both cultivars. However, the
soluble sugars increase on IACSP94-2094 cultivar under low temperature and water deficit,
was due sucrose increase, when there is an activity increase of sucrose phosphate synthase.
Key Words: Saccharum spp., gas exchange, chlorophyll fluorescence, chilling, sucrose
phosphate synthase
xx
CAPTULO I
1
1 INTRODUO
2
crescimento da cana-de-acar e favorecem o acmulo de sacarose nos vacolos das clulas
do parnquima (RAE et al., 2005). Tais condies causam queda no processo fotossinttico da
cana-de-acar, cujo metabolismo fotossinttico C4 menos eficiente sob frio e seca
(CARMO-SILVA et al., 2008; DU & NOSE, 2002; MACHADO et al., 2009; SAGE, 2007).
Os efeitos da ocorrncia de deficincia hdrica e de baixa temperatura causam vrias
alteraes fisiolgicas, e o grau dessas alteraes decorrente da intensidade do estresse e
depende do gentipo (DU & NOSE, 2002; MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013;
SALES et al., 2012; SMIT & SINGELS, 2006).
O objetivo deste trabalho foi testar a hiptese que cultivares de cana-de-acar
tolerantes deficincia hdrica e/ou baixa temperatura apresentam metabolismo do carbono
menos suscetvel a estes fatores ambientais, estudando seus efeitos sobre a fotossntese,
atividade das enzimas do metabolismo de carboidratos e contedo de carboidratos foliares em
plantas jovens de duas cultivares de cana-de-acar.
Esta tese foi dividida em dois experimentos, sendo o primeiro avaliando o efeito
simultneo da deficincia hdrica e baixa temperatura noturna sobre a fotossntese e contedo
de carboidratos foliares de plantas jovens de cana-de-acar na cultivar IACSP94-2094.
No segundo experimento, foi avaliado o efeito da baixa temperatura diria e da
deficincia hdrica sobre a fotossntese, atividade das enzimas do metabolismo de
carboidratos e contedo de carboidratos foliares em plantas jovens de cana-de-acar, nas
cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000.
2 REVISO DE LITERATURA
3
MARETZKI, 1996). A produo de sacarose em cana-de-acar est relacionada com a
produo de fitomassa, sendo ambos os processos incrementados pela mxima interceptao
de energia solar e/ ou alta eficincia na converso de fitomassa (SINGELS et al., 2005). A
interceptao de radiao est relacionada com a dimenso do aparelho fotossinttico, i.e.,
com o ndice de rea foliar. O acmulo de sacarose nos colmos regulado pela capacidade de
armazenar acar e pelo metabolismo e transporte de acar tanto na fonte como no dreno. H
evidncias que tanto a atividade da fonte como a do dreno so determinantes na produo e
acmulo de sacarose (GROF & CAMPBELL, 2001; MOORE & MARETZKI, 1996;
MOORE, 2005; RAE et al., 2005).
O acmulo de sacarose um processo complexo envolvendo diversas etapas (Figura
1).
4
necessrio compreender os fatores que limitam essas etapas, incluindo: a
fotossntese, as enzimas envolvidas na sntese e partio de sacarose, o carregamento da
sacarose no floema das folhas e o descarregamento nos tecidos dreno, alm da taxa de
armazenamento primrio em clulas do parnquima e vacolos e a taxa de remobilizao de
sacarose para o crescimento vegetativo.
O acmulo de sacarose varia de acordo com o gentipo, estdio de desenvolvimento
da planta e do ambiente em que cultivada. A planta responde ao ambiente atravs da
transduo de sinais que coordenam o seu desenvolvimento, alm do acmulo de sacarose
(GROF & CAMPBELL, 2001; MOORE, 2005).
A fotossntese o principal mecanismo que transforma a energia solar em energia
qumica utilizvel (ATP) e em NADPH, nas membranas dos tilacides no cloroplasto.
A caracterstica de alta produtividade de fotoassimilados em plantas C4 atribuda
cooperao metablica de dois tipos de clulas das folhas fotossinteticamente ativas, que
constituem a anatomia do tipo Kranz, na bainha do feixe vascular (BFV) (HATCH, 1987).
As plantas de metabolismo do tipo C4 esto agrupadas em trs sub-tipos bioqumicos,
que diferem principalmente no cido C4 transportado (malato ou aspartato) e na forma de
descarboxilao. O primeiro grupo, do qual faz parte a cana-de-acar entre outras plantas
cultivadas, o NADP-ME em que a enzima mlica dependente de NADPH e a
descarboxilao do cido C4 ocorre no cloroplasto das clulas da BFV. O segundo grupo o
NAD-ME, no qual a enzima mlica dependente de NADH e a descarboxilao do cido C4
ocorre na mitocndria das clulas da BFV. No terceiro grupo a descarboxilao realizada
pela fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PCK) e ocorre predominantemente no citoplasma das
clulas da BFV (GHANNOUM, 2009; TAIZ & ZEIGER, 2009; VON CAEMMERER &
FURBANK, 2003).
A fixao de CO2 ocorre inicialmente nos cloroplastos das clulas do mesofilo foliar
atravs da enzima fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase (PEPcase), onde produzido cido
oxaloactico (OAA) que convertido em malato, que se difunde para as clulas da BFV. Na
BFV o OAA descarboxilado resultando em CO2 que fixado atravs da ribulose bisfosfato
carboxilase/oxigenase (Rubisco), no ciclo de Calvin. Na BFV a descarboxilao do malato
resulta em CO2 e piruvato em reao catalisada pela enzima citoplasmtica NADP-mlica
(HATCH, 1987). O produto de trs carbonos (piruvato) do ciclo de Calvin retorna ao mesofilo
sendo utilizado na sntese de PEP, receptor inicial de CO2, com utilizao de ATP. A via C4
funciona como uma "bomba" bioqumica que concentra o CO2 nas clulas da BFV de tal
forma a saturar eficazmente o ciclo de Calvin e inibir a fotorrespirao (LUNN &
5
FURBANK, 1999), que em plantas C3 responsvel por uma perda substancial de
fotoassimilados devido oxidao.
Assim, a energia extra envolvida na supresso da fotorrespirao nas plantas C4 lhe
permite um aumento significativo na produtividade potencial sobre as plantas C3,
especialmente em ambientes onde a temperatura e intensidade de luz so altas (SAGE, 2007).
No estroma dos cloroplastos das clulas da BFV, ATP e NADPH so utilizados na reduo do
CO2 triose-P. A partir da triose-P so sintetizados a sacarose e o amido. A sacarose
transportada para todos os rgos da planta (HARTT et al., 1963), e constitui o substrato
primrio para o crescimento e desenvolvimento enquanto o amido um carboidrato de reserva
temporrio nas folhas. Em cana-de-acar supe-se que o amido seja sintetizado no
cloroplasto das clulas da BFV e a sacarose no citoplasma do mesofilo (GROF & CAMPBEL,
2001; LUNN & FURBANK, 1999).
Em cana-de-acar a sacarose alm de principal produto da fotossntese, uma
molcula de transporte envolvida no crescimento, desenvolvimento, armazenamento,
transduo de sinais e aclimatao a estresses ambientais (HARTT et al., 1963; SALERNO &
CURATTI, 2003). A sntese de sacarose pode ser catalisada por duas enzimas: a sintase de
sacarose fosfato (SPS):
A SPS uma protena de baixa abundncia (< 0,1% da protena solvel foliar) e
relativamente instvel (HUBER & HUBER, 1996). considerada uma enzima chave no
processo de sntese de sacarose, porm ambas as enzimas (SPS e SuSy) esto solveis no
citoplasma e catalisam livremente as reaes. Entretanto, a principal via de sntese de sacarose
envolve a ao sequencial da SPS, que catalisa a penltima etapa da rota de sntese e da
enzima fosfatase de sacarose fosfato (SPP;) que remove rapidamente o fosfato inorgnico (Pi)
da sacarose-6-fosfato liberando a sacarose. A liberao da sacarose torna a reao da SPS
irreversvel, proporcionando uma eficiente produo de sacarose, mesmo em condies de
baixa concentrao de substrato (HUBER & HUBER, 1996; SALERNO & CURATTI, 2003).
A SPS exerce controle maior em altas taxas fotossintticas e, como tal, tem grande
controle sobre o fluxo mximo atravs da rota de sntese de sacarose (HUBER & HUBER,
1996). Alm disso, a SPS o passo limitante da velocidade da biossntese da sacarose, e se
6
correlaciona com exportao deste acar (HUBER & HUBER, 1996; STITT et al.,1988).
GROF & CAMPBEL (2001) observaram que a atividade da SPS foliar est correlacionada
com o contedo de sacarose entre cultivares de cana-de-acar, entretanto isso somente no
tecido fonte.
A SPS tambm est presente em outros tecidos que atuam na sntese de sacarose,
como por exemplo, frutos em fase de amadurecimento, e em cana-de-acar (RAE et al.,
2005), tendo importante ao sobre o acmulo e metabolismo da sacarose nos colmos (GROF
et al., 2007). Os mecanismos de controle da SPS so: a expresso gnica, o controle alostrico
pela glicose-6-fosfato (Glu-6-P) (ativador) e Pi (inibidor) e ainda pela fosforilao reversvel
da poro seril da molcula da enzima (HUBER & HUBER, 1996; VERMA et al., 2011).
A sacarose sintetizada nas clulas do mesofilo e tambm como resultado da hidrlise
de amido na BFV (Figura 1). A sacarose sintetizada nas folhas da cana-de-acar
transportada para os outros tecidos, via floema. Duas hipteses de como a sacarose entra no
floema foram postuladas: o carregamento simplstico, atravs do plasmodesmata, e
carregamento apoplstico, mediada por um sistema de transporte ativo (FROMMER &
SONNEWALD, 1995). Em cana-de-acar, as clulas do floema no esto conectadas a
outras clulas da folha por plasmodesmas (ROBINSON-BEERS & EVERT, 1991) sugerindo
que o carregamento do floema ocorra, principalmente, via apoplasto. O carregamento ativo
ocorre no sentido da clula do mesofilo para as clulas do floema, contra um gradiente de
concentrao. O gradiente de prtons, que necessrio para o co-transporte de sacarose e de
prtons (DELROT, 1981), gerado por uma H+-ATPase, localizada na membrana plasmtica
das clulas companheiras (BOUCHE-PILLON et al., 1994).
O transporte da sacarose da fonte para os drenos inicia-se com seu movimento a partir
do citoplasma das clulas do mesofilo para os complexos clulas companheiras-elementos
crivados (cc-ec) do floema. Ou seja, o carregamento do floema, uma interface entre a
produo de fotoassimilados na fonte e o seu consumo nos drenos. O carregamento do floema
regulado tanto pela fonte como pelo dreno (SMITH & STITT, 2007). Em cana-de-acar o
carregamento do floema ocorre possivelmente via apoplasto nas folhas. No floema o
transporte da sacarose a partir das folhas para os outros rgos drenos, ocorre em resposta a
um gradiente de concentrao (VAN BEL, 2003; RAE et al., 2005).
O fluxo de sacarose das clulas do mesofilo para o complexo cc-ec afetado pela
temperatura (DU & NOSE, 2002), deficincia hdrica (DU et al., 1998), e pela atividade de
enzimas relacionadas com o metabolismo da sacarose, como a SPS, SuSy, invertases neutras
(IVN), invertases cidas (IVA) (VERMA et al., 2010) e demanda por fotoassimilados pelo
7
dreno (WARDLAW, 1990). Em condies limitantes na folha, o aumento da fotossntese
lquida acarreta aumentos proporcionais ao fluxo de fotoassimilados. Durante o curso de um
dia h variao no fluxo de radiao e consequentemente, na produo fotossinttica. Sob alta
radiao o excesso de fotoassimilado armazenado como amido no cloroplasto (PAUL &
PELLNY, 2003) e/ou como sacarose nos vacolos (SOUZA, 2011). Conforme ocorre
diminuio da radiao e queda na fotossntese pode ocorrer mobilizao e exportao de
amido acumulado durante o dia (SMITH & STITT, 2007; SOUZA, 2011). Durante a noite o
amido degradado produzindo sacarose, a qual transportada e utilizada metabolicamente. A
intensidade de remobilizao e de exportao durante a noite consistente com o teor de
amido nas folhas no final do dia (HENDRIX & GRANGE 1991).
O fluxo de exportao da sacarose parece ser definido pela atividade da SPS
(GALTIER et al., 1993; HARTT et al., 1963; VERMA et al., 2011) que afetada pela
demanda do dreno e pelo ambiente (DU et al., 1998; DU & NOSE, 2002; YANG et al., 2001).
Por exemplo, a durao do dia tem efeito significativo sobre a partio de fotoassimilados
entre a sacarose e o amido. H forte correlao na proporo de sacarose e de amido em
folhas com a atividade da SPS (GALTIER et al., 1993). Sob condies de dias curtos o
acmulo de amido aumenta e h queda na atividade da SPS. O aumento da sntese de amido
durante o dia possibilita a manuteno da exportao de fotoassimilados durante o perodo da
noite (SMITH & STITT, 2007). A taxa de exportao de sacarose est relacionada com o teor
de amido nas folhas no final do dia. Desta forma, a atividade da SPS nas folhas desempenha
um papel crucial na partio de carbono, a partir do substrato da hidrlise do amido. Alm
disso, os nveis elevados de SPS tm o potencial de aumentar as taxas fotossintticas em
condies favorveis (GALTIER et al., 1993). Ocorre, portanto uma coordenao entre a
produo de fotoassimilados e a utilizao destes produtos para o metabolismo e crescimento
(GRAHAM & MARTIN, 2000).
O movimento da sacarose a partir do floema para o parnquima de armazenamento
inicia-se com o descarregamento do floema. A presena de inmeros plasmodesmas nas
clulas sugere que as clulas sejam conectadas simplasticamente e que o transporte de
sacarose poderia ser potencialmente via simplasto. No entanto, a presena de sacarose no
apoplasto sugere que a sacarose tambm seja descarregada via apoplasto (RAE et al., 2005).
Assim, a sacarose e os produtos da sua hidrlise (hexoses) pelas IVA (GLASZIOU &
GAYLER, 1972) podem ser acumulados nas clulas do parnquima, via transportadores de
membrana. Sugere-se que a atividade das invertases mantm o gradiente de sacarose entre a
fonte e o floema, dando continuidade ao descarregamento do floema.
8
A rota do movimento de sacarose e o local da sua quebra, alm de serem fundamentais
para o mecanismo de importao, tm importncia devido aos sinais gerados pelos acares.
Dependendo da via de entrada de sacarose nos drenos, ou seja, via plasmodesmata ou parede
celular, a sacarose pode ser quebrada pela invertase de parede celular, invertase
citoplasmtica ou invertase vacuolar (produzindo hexoses) ou pela SuSy (gerando frutose e
UDP-glicose) (KOCH, 2004). Entretanto na quebra da sacarose via invertases h duas vezes
mais produo de hexoses que pela SuSy.
Como descrito anteriormente, a SuSy tambm est envolvida com a sntese, assim
como na quebra da sacarose, gerando UDP-glicose e frutose, sendo esta ltima a, sua funo
principal (SALERNO & CURATTI, 2003). A quebra da sacarose vital em plantas, no s na
alocao do carbono, mas na sinalizao a base de hexoses nos drenos. Apenas as reaes das
invertases e da SuSy esto envolvidas na rota da quebra da sacarose in vivo, sendo a regulao
dessas reaes e suas consequncias, importantes no metabolismo de carbono em plantas
(KOCH, 2004). De maneira geral, a SuSy est envolvida em processos de direcionamento da
sacarose a processos anablicos, partio de sacarose entre fonte e dreno, em respostas
anaerobiose e frio, armazenamento e maturao (KOCH, 2004; STURM & TANG, 1999).
As invertases esto relacionadas com a quebra da sacarose em glicose e frutose. As
invertases presentes no citoplasma tem pH timo entre 6,5 e 8,0, sendo chamadas de
invertases neutras (IVN) e as presentes nos vacolos e parede celular, tem um pH timo cido
(pH 5,0), portanto sendo chamadas de invertases cidas (IVA). Geralmente a invertase da
parede celular est envolvida na partio da sacarose entre fonte e dreno, respirao, reduo
do turgor em zonas relacionadas ao carregamento do floema, respostas a ferimentos e
infeces e no controle da diferenciao celular e desenvolvimento da planta. A invertase
vacuolar est envolvida no processo de osmorregulao e expanso celular, respirao,
mxima gerao de hexoses no vacolo, controle da composio de acares em frutas e
rgo de armazenamento e resposta ao frio. A invertase citoplasmtica tem provvel funo
no catabolismo (STURM & TANG, 1999; KOCH, 2004).
Em cana-de-acar, um acmulo significativo de sacarose ocorre no inverno, quando
as baixas temperaturas e a seca so fatores ambientais comuns que afetam a fisiologia da
planta. No inverno, a baixa taxa de crescimento da planta favorece os processos de acmulo
de sacarose nos colmos, ou seja, crescimento ativo e armazenamento so processos
competitivos e determinados pelas condies do ambiente (HATCH & GLASZIOU, 1963).
A baixa temperatura e a deficincia hdrica so fatores que afetam diretamente o
crescimento e produtividade dos cultivos agrcolas (MACHADO et al., 2009; PEARCE,
9
1999; PIMENTEL, 2004). A taxa mxima de crescimento da cana-de-acar ocorre entre 25 e
35 C e quando expostas a temperatura de 15 C j se observa inibio do crescimento
vegetativo (EBRAHIM et al., 1998; SALES et al., 2012).
A mudana de temperatura incide diretamente sobre todo processo cintico e
termodinmico nos aspectos bioqumicos e fisiolgicos da planta (PEARCE, 1999). Sob baixa
temperatura, as plantas so classificadas em trs categorias em relao a sensibilidade: 1)
suscetveis ao frio, ou seja, so danificadas por temperaturas abaixo de 12 C; 2) tolerante ao
frio, mas suscetveis ao congelamento, ou seja, podem aclimatar em temperaturas inferiores a
12 C, mas so incapazes de sobreviver ao congelamento; e 3) tolerantes ao congelamento, ou
seja, capazes de se adaptarem para sobreviver em temperaturas abaixo de zero. A baixa
temperatura tem efeito direto sobre as clulas, enquanto o congelamento, muitas vezes age de
forma indireta e danificando as clulas pela desidratao (PEARCE, 1999). Entretanto, em
espcies tropicais sensveis ao resfriamento podem ocorrer danos mesmo quando expostas a
temperaturas superiores de congelamento do tecido (KAKANI et al., 2008; SAGE, 2007).
Folhas de plantas expostas ao resfriamento mostram inibio da fotossntese,
translocao de sacarose, menor respirao, inibio do metabolismo de protenas, gerao de
espcies reativas de oxignio, crescimento lento e murcha foliar. Estas modificaes so
causadas por disfunes em processos metablicos promovidos por alteraes das
propriedades da membrana, mudanas na estrutura de protenas e nas interaes entre
macromolculas, alm de inibio de reaes enzimticas (CARMO-SILVA et al., 2008;
KAKANI et al., 2008; LIU et al., 2012; SOARES-CORDEIRO et al., 2010).
Entretanto, plantas que permanecem ativas durante o inverno, tm a respirao, a
fotossntese e a sntese de protenas reguladas pelo frio (GUY, 1990). Em geral, essa
regulao do metabolismo primrio essencial para sustentar o crescimento, ainda que este
seja menor que em temperaturas mais elevadas (PEARCE, 1999). Segundo LEVITT (1980) e
SAKAI & LARCHER (1987) citados por PEARCE (1999), durante o crescimento sob baixas
temperaturas ocorre acmulo de solutos como aminocidos livres e, especialmente,
carboidratos. Uma possvel explicao para esse acmulo durante a aclimatao ao frio que
nesse perodo h maior limitao do crescimento do que da fotossntese, sendo assim uma
consequncia direta do menor uso do carboidrato (PEARCE, 1999). A formao de reserva
contribui para o crescimento rpido quando o ambiente torna mais quente (PEARCE, 1999;
POLLOCK & JONES, 1979). H uma variedade de solutos que podem ser acumulados e
correlacionados com a tolerncia ao frio. Em gramneas, por exemplo, foi observado o
acmulo de sacarose e frutanos (POLLOCK & JONES, 1979).
10
Alm das condies trmicas, a deficincia hdrica do solo constitui um dos estresses
mais limitantes da produtividade vegetal (PIMENTEL, 2004). A deficincia hdrica tem
impacto varivel na produtividade agrcola dependendo da fase fenolgica em que ocorre e da
cultivar (INMAN-BAMBER & SMITH, 2005; MACHADO et al., 2009, SALES et al., 2012).
A emergncia da plntula e o perodo compreendido entre a pr e ps-florao so as fases
fenolgicas de maior suscetibilidade seca em termos de produo agrcola de gros
(PIMENTEL, 2004). Contudo, nos cultivos em que os rgos de interesse econmico no so
os frutos ou sementes, como no caso da cana-de-acar (colmo), os efeitos da deficincia
hdrica so prejudiciais quando a mesma ocorre na fase inicial de estabelecimento das plantas
(MACHADO, 2009), bem como na de intenso crescimento (ROBERTSON et al., 1999).
Sob deficincia hdrica, as plantas apresentam alteraes morfofisiolgicas, tais como
enrolamento e alterao do ngulo da folha, reduo da rea foliar, da transpirao, da
condutncia estomtica, da fotossntese (comprometimento das etapas fotoqumica e
bioqumica), da condutividade hidrulica das razes, modificao da atividade de enzimas do
metabolismo do carbono e mudanas nos teores de antioxidantes (GHANNOUM, 2009;
LOPES et al., 2011; MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013). Algumas destas
respostas visam reduzir os efeitos deletrios da baixa disponibilidade hdrica, constituindo,
portanto, mecanismos de tolerncia seca (KRAMER, 1980). No caso da cana-de-acar,
alguns gentipos mostram diferentes capacidades de recuperao no crescimento aps eventos
de seca (LANDELL et al., 2004; MACHADO et al., 2009; SALES et al., 2012).
A fotossntese sob deficincia hdrica decresce inicialmente devido ao fechamento
estomtico e, com o agravamento da seca, tambm se evidenciam limitaes metablicas
(CARMO-SILVA et al., 2008; GHANNOUM et al., 2003; GHANNOUM, 2009; LOPES et
al., 2011). O fechamento estomtico a primeira linha de defesa contra dessecao, pois
mais rpido que as mudanas no crescimento radicular, da rea foliar, da ultraestrutura dos
cloroplastos, dos pigmentos e protenas. Espcies tolerantes seca tem controle estomtico
que permite alguma fixao de carbono durante o estresse, melhorando assim a eficincia do
uso da gua, ou ainda, os estmatos abrem rapidamente aps reidratao (MACHADO et al.,
2009; YORDANOV et al., 2000).
So poucos os estudos envolvendo a atividade das enzimas do metabolismo da
sacarose e amido em folhas (fonte) de cana-de-acar sob deficincia hdrica e/ou baixa
temperatura, assim como as trocas gasosas quando estes fatores ocorrem de forma simultnea
(SALES et al., 2012). A maioria dos trabalhos relaciona as enzimas do metabolismo de
sacarose apenas com o transporte e armazenamento nos colmos (dreno). No entanto, o
11
conhecimento de como estas enzimas atuam nas folhas e os efeitos dos estresses ambientais
sobre suas atividades so fundamentais para a compreenso da partio dos fotoassimilados,
do crescimento e do acmulo de sacarose em cana-de-acar (GROF & CAMPBELL, 2001).
12
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18
CAPTULO II
19
Baixa temperatura noturna e deficincia hdrica na fotossntese de cana-de-acar
RESUMO
20
Low night temperature and water deficit on photosynthesis of sugarcane
ABSTRACT
The objective of this work was to evaluate the photosynthetic responses of sugarcane
to the isolate and simultaneous effects of low night temperature (TN) and water deficit (WD).
After 128 days of planting, plants of the cultivar IACSP94-2094 were subjected to the
following treatments: control, without WD and TN of 20 C (TN20); with WD and TN of 20 C
(DH/TN20); without WD and TN of 12 C (TN12); and with WD and TN of 12 C (DH/TN12).
After five days in each treatment, plants were irrigated and subjected to TN of 20 C for four
days for recovering. There were decreases in leaf CO2 assimilation in all treatments. Total
recovery of CO2 assimilation was noticed only in plants of treatment TN12. The simultaneous
occurrence of low night temperature and water deficit caused a negative effect on stomatal
conductance, on the maximum capacity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase and on
electron transport rate, efficiency factor and operational efficiency of photosystem II, causing
diffusive, biochemical and photochemical limitations of photosynthesis. The occurrence of
low temperature and water deficit causes a decrease in starch content in the leaves, favoring
an increase in sucrose content.
21
1 INTRODUO
22
carbono e mudanas nos teores de antioxidantes (GHANNOUM, 2009; LOPES et al., 2011;
MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013). A fotossntese decresce inicialmente devido
ao fechamento dos estmatos e, com o agravamento da deficincia hdrica, tambm se
evidenciam limitaes metablicas (CARMO-SILVA et al., 2008; GHANNOUM et al., 2003;
GHANNOUM, 2009; LOPES et al., 2011).
Os estudos sobre os danos causados pela baixa temperatura noturna e deficincia
hdrica em espcies C3 so frequentes (ALLEN et al., 2000; BERTAMINI et al., 2005;
FLEXAS et al., 1999; MACHADO et al., 2010) porm, em espcies C4 como cana-de-acar,
so menos estudadas principalmente quando ocorrem simultaneamente (SALES et al., 2012).
O objetivo deste trabalho foi avaliar as respostas fotossintticas e relaes hdricas
ocorrncia de baixa temperatura noturna do ar e de restrio hdrica no solo, isoladamente ou
em conjunto, considerando os processos, bioqumicos, fotoqumicos e estomticos em plantas
jovens de cana-de-acar.
2 MATERIAL E MTODOS
Em bandejas contendo substrato comercial (Carolina Soil, Vera Cruz, RS) composto
de turfa de Sphagno, vermiculita expandida, calcrio dolomtico, gesso agrcola e fertilizante
NPK (traos) foram plantados mini-toletes de cana-de-acar (Saccharum spp.) cv. IACSP94-
2094 (Figura 1A e B).
Aos 35 dias aps o plantio (DAP), as mudas foram transplantadas para vasos plsticos
contendo 8,5 L de uma mistura de terra, areia e substrato comercial na proporo 1:1:1
(v/v/v). Foi plantada uma muda por vaso e conduzidos somente o colmo primrio. As plantas
foram mantidas em casa de vegetao (Figura 1C) e receberam tanto irrigao diria quanto
aplicaes de nutrientes. As aplicaes dos nutrientes foram parceladas em trs vezes,
totalizando, por vaso: 18,21 g de Ca(NO3)2; 5,31 g de fosfato monoamnico; 7,29 g de KCl;
2,12 g de MgSO4; 0,17 g de H3BO3; 0,20 g de MnSO4; 0,02 g de CuSO4; 0,02 g de
(NH4)6Mo7O24 x 4(H2O); 0,09 g de ZnSO4; e 0,212 mg de FeEDTA (6% Fe).
Aos 128 DAP (06/01/2011), as plantas foram submetidas aos seguintes tratamentos: 1)
testemunha, com temperatura noturna (TN) de 20 C irrigada (TN20); 2) TN de 20 C com
deficincia hdrica (TN20/DH); 3) TN de 12 C irrigada (TN12) e 4) TN de 12 C com
deficincia hdrica (TN12/DH).
23
Para imposio da baixa temperatura noturna, as plantas foram transferidas para uma
cmara de crescimento (modelo PGR14, Conviron, Canad) nas seguintes condies
ambientais: temperatura do ar 121 C e umidade relativa de 65% e permaneceram nessa
condio durante 12 h (19:00 s 7:00h).
A B
C
Figura 1 - Fotografias ilustrando (A) bandeja para germinao contendo substrato comercial
e mini-toletes de cana-de-acar, (B) detalhe do mini-tolete contendo a gema, e (C) viso
geral das plantas em casa de vegetao aos 56 dias aps o plantio.
24
Durante o perodo experimental a temperatura do ar e a radiao solar foram
registradas continuamente pelo posto meteorolgico, distante 300 m do experimento, do
Centro Experimental Central (CEC) do Instituto Agronmico (IAC), em Campinas-SP.
Na primeira folha totalmente expandida e com a lgula aparente (folha +1), foram
realizadas simultaneamente as medidas de trocas gasosas e fluorescncia da clorofila a, por
meio de um analisador de gases por infravermelho integrado com cmara de fluorescncia,
modelo Li 6400-40F (Licor, Inc. Nebraska, EUA). Foram realizadas curvas de resposta da
assimilao de CO2 (A) e da fluorescncia da clorofila a pela variao da concentrao
intercelular de CO2 (Ci), nas condies de radiao fotossinteticamente ativa (Q) de 2000
mol m-2 s-1, temperatura foliar de 30 C e dficit de presso de vapor entre a folha e o ar ao
redor de 1,5 kPa. A variao de Ci foi obtida pela variao da concentrao de CO2 do ar (Car)
de entrada da cmara de medida de acordo com LONG & BERNACCHI (2003). Essas curvas
foram realizadas no perodo entre 9:00 h e 12:00 h.
As variveis analisadas em relao fluorescncia da clorofila a foram: fluorescncia
mnima (Fo) e mxima (Fm), medidas aps adaptao ao escuro; fluorescncia no estado de
equilbrio dinmico (F') e mxima (Fm'), medidas aps adaptao luz (MAXWELL &
JOHNSON, 2000). A fluorescncia varivel mxima no escuro e luz foram calculadas,
respectivamente, por Fv=Fm-Fo e Fv'=Fm'-Fo', onde Fo' representa a fluorescncia mnima em
folhas adaptadas luz. O termo Fq' foi calculado por Fq'=Fm'-F', representando a extino
fotoqumica da fluorescncia causada pelos centros oxidados do fotossistema II (FSII)
segundo BAKER (2008). Desta forma, calculou-se a eficincia quntica mxima (Fv/Fm) e a
eficincia operacional do FSII (Fq'/Fm'), o transporte aparente de eltrons (ETR=Fq'/Fm' x Q x
0,4 x 0,85) e o fator de eficincia do FSII (Fq'/Fv') de acordo com MAXWELL & JOHNSON
(2000) e BAKER (2008), respectivamente. Para o clculo de ETR, considerou-se uma
distribuio de eltrons entre o FSI e FSII de 0,4 (EDWARDS et al., 1993) e a absoro de
luz 0,85. Calculou-se tambm a eficincia quntica da fotossntese (CO2) pela relao
A/0,85Q, para cada valor de Ci.
A partir da curva A vs. Ci foram calculadas a eficincia aparente de carboxilao da
fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPcase, Vpmax) e a capacidade mxima da ribulose-1,5-
25
bisfosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco, Vmax) Os dois parmetros bioqumicos foram
calculados partir da soluo analtica das equaes propostas por COLLATZ et al. (1992):
M - M(Vmax + Q) + VmaxQ
onde significa a convexidade da curva A/Q, M a assimilao de CO2 no plat da curva A/Ci,
significa a eficincia quntica aparente da curva A/Q, significa a convexidade da curva
A/Ci, Ag a assimilao bruta de CO2, e P a presso atmosfrica. Ag foi calculada por Ag = A +
Rd, onde Rd a respirao foliar.
Para estimar a convexidade , foi ajustada a curva A/Ci, pela equao proposta por
LIETH & REYNOLDS (1987), respectivamente:
26
foram medidos no incio de cada horrio de avaliao para ajustar a fonte de luz da cmara de
medida em Q constante homogeneizando assim as repeties. As medidas foram realizadas
entre 07:00 h e 17:00 h, em intervalos de trs horas. Calculou-se a assimilao diria de CO2
(Ai) a partir da integrao da assimilao instantnea de CO2 ao longo do dia.
27
SAC foi calculada a partir de uma curva padro de sacarose (0,25 mg/mL) cuja concentrao
variou entre 5 e 50 g. Como branco, colocou-se gua no lugar da amostra.
Teor de amido
O extrato para quantificao de amido foliar foi obtido utilizando o mtodo enzimtico
descrito por AMARAL et al. (2007). Em microtubo contendo 10 mg de amostra realizou-se
uma extrao prvia dos acares solveis, pigmentos e fenis adicionando-se 500 L de
etanol 80%, levando em seguida ao banho-maria a 80 C por 20 minutos e descartando em
seguida o sobrenadante. Este passo foi repetido quatro vezes. Aps secagem do material
restante em temperatura ambiente at completa evaporao do etanol, foram adicionados 500
L de uma soluo contendo 120 U mL-1 da enzima -amilase (EC 3.2.1.1) termoestvel de
Bacillus licheniformis (Megazyme, Irlanda), diluda em tampo MOPS 10 mM e pH 6,5.
Essas amostras foram incubadas a 75 C por 30 minutos. Este procedimento foi repetido mais
uma vez. Em seguida, adicionaram-se 500 L de uma soluo contendo 30 U mL-1 da enzima
amiloglucosidase (EC 3.2.1.3) de Aspergillus niger (Megazyme, Irlanda), diluda em tampo
acetato de sdio 100 mM e pH 4,5. Essas amostras foram incubadas a 50 C por 30 minutos.
Este procedimento foi repetido mais uma vez. Foram acrescentados 100 L de cido
perclrico 0,8 M para parar a reao e precipitar as protenas. O extrato foi centrifugado por
dois minutos a 10.000 g e procedeu-se a dosagem de amido. A glicose liberada foi dosada
adicionando-se em um microtubo 50 L do extrato e 750 L do reagente glicose GOD-PAP
(Laborlab, Brasil), incubados a 37 C por 15 minutos. Fez-se a leitura da absorbncia em
leitor de microplacas de ELISA (modelo EL307C, Bio- Tek Instruments, Winooski, Vermont)
no comprimento de onda de 490 nm. A concentrao de glicose foi calculada a partir de uma
curva padro de glicose (1 mg/mL) cuja concentrao variou entre 2,5 e 30 g de glicose.
Como branco, colocou-se gua no lugar da amostra.
O potencial da gua na folha (w) foi medido em cmara psicromtrica (C-52, Wescor,
Logan, EUA) acoplada a um microvoltmetro (modelo HR-33T, Wescor, Logan, EUA) no
modo higromtrico s 6:00h e 14:00h (BOYER, 1995) em discos retirados da folha +2.
Delineamento experimental
28
O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso com parcelas subdivididas no
tempo, sendo as causas de variao os quatro tratamentos (TN20; TN20/DH; TN12 e TN12/DH)
e o tempo de avaliao. Os resultados foram submetidos anlise de varincia, sendo as
mdias provenientes de trs repeties para as medidas de fotossntese e quatro para as
medidas de teor de carboidrato. Quando encontradas diferenas significativas, as mdias
foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
3 RESULTADOS E DISCUSSO
A
Radiao solar (W m-2)
1000
800
600
400
200
0
28 B
26
Temperatura (oC)
24
22
20
18
16
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Janeiro /2011
29
42% nos tratamentos DH/TN20, TN12 e DH/TN12, respectivamente, em relao testemunha
TN20 (Figura 3). No 5 dia de tratamento, Ai teve um decrscimo mais acentuado com 71%,
50% e 61% nos tratamentos DH/TN20, TN12 e DH/TN12, respectivamente, mostrando efeito
cumulativo conforme o tempo de estresse. Os menores valores observados, nas plantas
testemunha, em Ai no 5 dia em relao ao 3 dia foram devidos menor incidncia de
radiao solar (Figura 2A).
800
A 30 dia 50 dia
Ai (mmol m-2 d-1)
600
400
200
0
TN20 DH/TN20 TN12 DH/TN12
Tratamentos
Figura 3 - Variao da assimilao diria de CO2 (Ai) de cana-de-acar, cv. IACSP94-2094
aos seguintes tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20,
temperatura noturna de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada. As colunas indicam mdia de trs
repeties ( erro padro).
30
decrscimo da permeabilidade do protoplasma (SELLIN & KUPPER, 2007), visto que no
houve variao do potencial da gua na folha (W14) nestes tratamentos (Figura 5A).
0,15
20
0,10
10
0,05
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Dias Dias
31
submetidas a TN12 e DH/TN12 apresentaram Apot menor que as DH/TN20, sugerindo efeito
mais intenso da baixa TN do que do DH no incio do estresse.
Dias
1 4 9
0,0
A B 7
-0,2 6
-0,4 5
4
-0,6
3
-0,8
2
-1,0 1
0
TN20 DH/TN20 1 4 9
TN12 DH/TN12 Dias
32
permitindo sua maior atividade como carboxilase e consequente maior eficincia do uso de
gua e de nitrognio e ausncia de fotorrespirao (SAGE, 2007). Desta forma, a LM da
fotossntese pode estar relacionada a alteraes na atividade enzimtica da PEPcase e da
Rubisco, com a regenerao dos substratos das enzimas e transporte de eltrons (CARMO-
SILVA et al., 2008; GHANNOUM, 2009; RIPLEY et al., 2007; SOARES-CORDEIRO et al.,
2010). A eficincia aparente de carboxilao da PEPcase (Vpmax) foi menor, em relao a
testemunha, no 1 dia, em todos os tratamentos. No entanto, houve aclimatao das plantas no
incio do perodo de recuperao, ou seja, os valores de Vpmax se igualaram aos verificados em
TN20 (Figura 6C). Alguns estudos tambm mostram a reduo na atividade da PEPcase com a
diminuio do contedo de gua no solo (DU et al., 1996; MARKELZ et al., 2011) e com a
baixa temperatura noturna (KAKANI et al., 2008; SOARES-CORDEIRO et al., 2010).
80
40
60
LM (%)
30 40
20 20
0
10
-20
0
0,4 C D 50
40
0,3
30
0,2
20
0,1
10
0,0
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Dias Dias
33
A capacidade mxima da Rubisco (Vmax) in vivo foi menor que a testemunha em todos
os tratamentos no 1 dia, sendo mais acentuada em TN12 e DH/TN12 no 2 dia e DH/TN20 e
DH/TN12 no 4 dia de tratamento. Nas plantas do tratamento TN12 foi observada a aclimatao
de Vmax. Os valores de Vmax foram maiores que dos outros tratamentos e prximos a
testemunha no 4 dia de tratamento e semelhantes testemunha no final do perodo de
recuperao (Figura 6D). As plantas DH/TN12 apresentaram recuperao parcial de Vmax ao
trmino do perodo de recuperao (Figura 6D).
As redues de Vpmax e Vmax indicam limitaes bioqumicas do metabolismo
fotossinttico C4 da cana-de-acar em condies de baixa temperatura noturna e deficincia
hdrica. A atividade da Rubisco foi mais sensvel aos tratamentos, em especial nas plantas
submetidas deficincia hdrica (DH/TN20 e DH/TN12), mesmo aps a reidratao quando
apresentavam LM ao redor de 25%, devido aos baixos valores de Vmax (Figura 6B, D). No 4
dia de recuperao Vmax de DH/TN12 foi menor que DH/TN20 (Figura 6D).
Os tratamentos no causaram variaes significativas na eficincia quntica mxima
do FSII (Fv/Fm), sugerindo que no houve fotoinibio da fotossntese (Figura 7A). No
entanto, o transporte aparente de eltrons (ETR) e a eficincia operacional do FSII (Fq'/Fm')
foram menores no 1 dia dos tratamentos do que no controle (Figura 7B, C).
Apenas as plantas do tratamento DH/TN12 no recuperaram ETR e Fq'/Fm' aps quatro
dias da reidratao. O decrscimo de Fq'/Fm' indica diminuio significativa da dissipao da
energia dos eltrons na etapa fotoqumica, tambm confirmada pela reduo do fator de
eficincia do FSII (Fq'/Fv') (Figura 7D), implicando aumento na dissipao no fotoqumica
de fluorescncia (RIPLEY et al., 2007). Assim, a reduo de Fq'/Fm' pode estar relacionada ao
fechamento (reduo) dos centros de reao do FSII sob condio de baixa temperatura e
deficincia hdrica (BAKER, 2008), refletindo em acmulo de QA em estado reduzido,
indicado pela diminuio de Fq'/Fv', devido significativa reduo da assimilao de CO2 em
DH/TN20, TN12 e DH/TN12.
A diminuio de gs causa menor fluxo de CO2 para o mesofilo foliar podendo causar
reduo na concentrao de CO2 junto Rubisco e assim estimular a atividade da oxigenase,
ou seja, a fotorrespirao (CARMO-SILVA et al., 2008). De fato, no nosso experimento
houve queda de Ci somente em DH/TN20 e no 4 dia de estresse (Ci =11525 mol mol-1 em
DH e Ci =17619 mol mol-1 nos demais tratamentos).
34
TN20 DH/TN20 TN12 DH/TN12
A B 0,25
0,80
0,20
Fq'/Fm'
Fv/Fm
0,75
0,15
0,70 0,10
0,65 0,05
C D
ETR (mol m-2 s-1)
150
0,4
120
Fq'/Fv'
0,3
90
60 0,2
30
0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Dias Dias
35
TN20 DH/TN20 TN12 DH/TN12
0,02
0,01
0,00
Tabela 1 - Teor de acares solveis totais (mol g-1 MS) em folhas de cana-de-acar cv.
IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada;
DH/TN20, temperatura noturna de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C -
irrigada e DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada, no 5 dia de tratamento e 4
dia de recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao
com retorno da irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.
36
Os teores de SAC no 5 dia de tratamento aumentaram com a deficincia hdrica e com
a baixa temperatura noturna, sendo que este aumento foi maior nos tratamentos com baixa
temperatura noturna (Tabela 2).
No 4 dia de recuperao, somente os tratamentos com baixa temperatura noturna
apresentaram decrscimo de SAC (TN12 e DH/TN12) atingindo valores prximos aos do
controle (TN20, Tabela 2).
Tabela 2 - Teor de sacarose (mol g-1 MS) em folhas de cana-de-acar cv. IACSP94-2094
submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20,
temperatura noturna de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada, no 5 dia de tratamento e 4 dia de
recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com
retorno da irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.
37
Tabela 3 - Teor de amido (mol de Glu g-1 MS) em folhas de cana-de-acar cv. IACSP94-
2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 C - irrigada; DH/TN20,
temperatura noturna de 20 C - no irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 C - irrigada e
DH/TN12, temperatura noturna de 12 C - no irrigada. No 5 dia de tratamento e 4 dia de
recuperao. Perodo de aplicao dos tratamentos, dias 1 a 5; perodo de recuperao com
retorno da irrigao das plantas e temperatura noturna de 20 C, dias 5 a 9.
4 CONCLUSES
38
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42
CAPTULO III
43
Metabolismo de carboidratos em duas cultivares de cana-de-acar sob baixa
temperatura e deficincia hdrica
RESUMO
Para sobreviver s condies adversas, as plantas exibem uma srie de respostas aos estresses
ambientais, que frequentemente, ocorrem de forma simultnea. Tais respostas tambm esto
relacionadas com diferentes tolerncias ou sensibilidades aos diversos tipos de estresses. O
objetivo deste trabalho testar a hiptese de que cultivares de cana-de-acar mais tolerantes
deficincia hdrica e/ou baixa temperatura apresentam a fotossntese e o metabolismo de
carboidratos menos suscetvel a estes fatores ambientais. Para tanto, foram utilizadas as
cultivares de cana-de-acar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 plantadas em potes plsticos de
8,5 L. Aos 87 dias aps o plantio, foram submetidas aos tratamentos de baixa temperatura
(221/121 C) e deficincia hdrica, por 22 dias, em cmara de crescimento. Aps este
perodo, as plantas foram reidratadas e a temperatura retornou a 321/201 C, por 9 dias.
Sob condies ambientais ideais, a IACSP95-5000 tem maior eficincia fotossinttica que a
IACSP94-2094. A IACSP95-5000 mostrou ser mais tolerante ao frio, devido a menor reduo
da assimilao de CO2 e maior recuperao, superando as plantas controle. Sob frio e
deficincia hdrica, a IACSP94-2094 mais tolerante por no ter apresentado decrscimo
maior da fotossntese nos estresses simultneos. Com a imposio dos tratamentos, foi
observado aumento no teor de acares solveis e amido em ambas cultivares. Na cultivar
IACSP94-2094 sob baixa temperatura e deficincia hdrica o aumento dos acares solveis
totais foi devido ao aumento da sacarose, quando h tambm aumento da atividade da sintase
de sacarose fosfato.
44
Carbohydrate metabolism in two cultivars of sugarcane under low temperature and
water deficit
ABSTRACT
Key Words: Saccharum spp., environmental stress, gas exchanges, sucrose phosphate
synthase, invertases
45
1 INTRODUO
46
ao estresse. Tais respostas tambm esto relacionadas com diferentes tolerncias ou
sensibilidades aos diversos tipos de estresses.
O metabolismo de carboidratos responde de maneira diferente baixa temperatura e
deficincia hdrica, dependendo da espcie e exposio ao estresse (DU et al. 1998, DU &
NOSE, 2002). Em cana-de-acar so poucos os trabalhos que relatam estas respostas,
principalmente quando a exposio a estas condies ocorrem de forma simultnea (SALES
et al., 2012).
Em plantas submetidas ao resfriamento, h acmulo dos principais acares como
glicose, frutose e sacarose. Alm disso, a atividade da SPS foliar aumenta enquanto a da SuSy
e das invertases no (GUY et al., 1992). Sob baixa temperatura, a sacarose acumulada como
carboidrato de reserva pode ser rapidamente mobilizada conforme as necessidades
metablicas. Dessa forma, a sacarose rapidamente translocada para ser utilizada aps o
retorno a temperaturas favorveis, em reaes como, por exemplo, a respirao. Alm disso,
sob baixa temperatura o crescimento ativo quase sempre reduzido ou paralisado (GUY et
al., 1992; JAVIER et al., 1997; SALES et al., 2012), resultando em diminuio da demanda
por produtos da fotossntese podendo, mesmo sob estresse, acumular reservas na forma de
amido.
DU & NOSE (2002) observaram que em cultivares de cana-de-acar com trs meses
de idade, tolerantes baixa temperatura, aps 52 h de exposio ao frio houve acmulo de
acares solveis (glicose, frutose e sacarose), semelhante ao que ocorre em plantas C3
tolerantes. Alm disso, o contedo de amido se manteve alto durante todo o tratamento. Aps
exposio ao frio, nestas cultivares tolerantes a atividade da enzima SPS foi semelhante das
plantas controle, porm houve aumento do estado de ativao da enzima, sugerindo que o frio
no afetou o contedo de protena. J a cultivar suscetvel, apresentou decrscimo da
atividade da SPS aps exposio ao frio, provavelmente devido a uma reduo desta enzima.
Sob deficincia hdrica moderada, DU et al. (1998) observaram em folha de cana-de-
acar, que os processos bioqumicos de sntese de sacarose e amido, do ciclo de Calvin e da
rota C4 no foram seriamente afetados sendo o fechamento estomtico a causa do declnio da
fotossntese. Esses autores sugerem que sob deficincia hdrica severa, a queda significante da
atividade da PPDK (piruvato ortofosfato diquinase) seja responsvel pela queda da
fotossntese. Foi observado ainda aumento da glicose e frutose, possivelmente, devido ao
aumento da atividade de enzimas de quebra do amido e da sacarose, resultando em aumento
da concentrao osmtica em folhas de cana-de-acar.
47
VANDOORME et al. (2012) observaram em chicria que, sob deficincia hdrica, no
houve impacto sob a concentrao de protena, porm houve aumento da atividade da SPS
foliar, enquanto a atividade da SuSy no foi significativamente afetada. J a atividade da
invertase cida foi maior no incio do tratamento de deficincia hdrica, enquanto a invertase
neutra teve decrscimo no final do tratamento quando comparada s plantas controle. Alm
disso, as plantas sob estresse aumentaram a eficincia do uso da gua e a concentrao de
acares solveis, houve diminuio na proporo raiz-parte area e baixou o potencial
osmtico.
Algumas cultivares de cana-de-acar apresentam diferentes respostas de aclimatao
e de recuperao aps a ocorrncia de deficincia hdrica (LANDELL et al., 2004;
MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013) e de baixa temperatura (DU & NOSE, 2002;
SALES et al., 2012).
Nossa hiptese que cultivares de cana-de-acar mais tolerantes deficincia hdrica
e/ou baixa temperatura apresentam metabolismo do carbono (fotossntese e metabolismo de
carboidratos) menos suscetvel a estes fatores ambientais. Baseado nesta hiptese, nosso
objetivo estudar os efeitos da ocorrncia de baixa temperatura e/ou deficincia hdrica sobre
a fotossntese (trocas gasosas e atividade fotoqumica) e sobre o metabolismo de carboidratos
(acmulo de carboidratos e atividade de enzimas) em duas cultivares de cana-de-acar, com
diferentes caractersticas quanto a sua rusticidade.
2 MATERIAL E MTODOS
Em bandejas contendo substrato comercial (Carolina Soil, Vera Cruz, RS) composto
de turfa de esfagno, vermiculita expandida, calcrio dolomtico, gesso agrcola e fertilizante
NPK (traos) foram plantados mini-toletes de cana-de-acar (Saccharum spp.) cv. IACSP94-
2094 e cv. IACSP95-5000. A IACSP94-2094 apresenta rusticidade sendo indicada para
ambientes desfavorveis e a IACSP95-5000 uma cultivar produtiva e indicada para
ambientes favorveis (LANDELL et al., 2005).
Aos 35 dias aps o plantio (DAP), as mudas foram transplantadas para vasos plsticos
contendo 8,5 L de uma mistura de terra, areia e substrato na proporo 1:1:1 (v:v:v). Foram
plantadas uma muda por vaso e conduzidos somente o colmo primrio. As plantas foram
mantidas em casa de vegetao onde receberam tanto irrigao diria quanto aplicaes de
nutrientes. As aplicaes dos nutrientes foram parceladas em trs vezes, totalizando, por vaso:
48
18,21 g de Ca(NO3)2; 5,31 g de fosfato monoamnico; 7,29 g de KCl; 2,12 g de MgSO4; 0,17
g de H3BO3; 0,20 g de MnSO4; 0,02 g de CuSO4; 0,02 g de (NH4)6Mo7O24 x 4(H2O); 0,09 g
de ZnSO4; e 0,212 mg de FeEDTA (6% Fe).
Aos 87 DAP, as plantas foram transferidas para cmara de crescimento (Instalafrio,
Brasil) onde permaneceram por um perodo de 18 dias, recebendo irrigao diria, nas
seguintes condies ambientais: fotoperodo 14 h/10 h (dia/noite), temperatura do ar
321/201 C (dia/noite), umidade relativa de 65% e Q de 1000 mol m-2 s-1 (14 h). Aps o
18 dia, a temperatura da cmara foi diminuda para 221/121 C (dia/ noite). Metade das
plantas permaneceu irrigada e a outra metade foi submetida deficincia hdrica. A restrio
hdrica foi imposta pela suspenso da rega at 30% da capacidade mxima de reteno de
gua do substrato, medida por pesagem dos vasos. As plantas permaneceram nestas condies
(221/121 C sem ou com restrio hdrica) por 22 dias, aps este perodo, elas foram
reidratadas e a temperatura da cmara de crescimento foi reajustada para 321/201 C
(dia/noite) e permaneceram assim por um perodo de 8 dias.
Durante o perodo experimental, foram realizadas seis medidas/coletas, nos seguintes
dias, contados aps o perodo de aclimatao das plantas: 1 medida/coleta feita no 18 dia na
temperatura 321/201 C em plantas irrigadas (I) (testemunha); 2 medida/coleta feita aps
34 horas de baixa temperatura com e sem deficincia hdrica; 3 medida/coleta feita aps 13
dias de baixa temperatura e deficincia hdrica (estresse intermedirio); 4 medida/coleta feita
aps 20 dias de baixa temperatura e deficincia hdrica (mximo estresse); 5 medida/coleta
feita aps dois dias de retorno temperatura inicial e reidratao; e a 6 (medida/coleta) feita
aps 8 dias de retorno temperatura inicial e reidratao.
Mediu-se a variao diurna das trocas gasosas e fluorescncia da clorofila a por meio
de um analisador de gases por infravermelho integrado com cmara de fluorescncia, modelo
Li 6400-40F (Licor, Inc. Nebraska, EUA). As medidas foram realizadas na primeira folha
totalmente expandida e com lgula aparente (folha +1), no tero mdio do limbo foliar, em
intervalos de trs horas, totalizando cinco medidas, em Q de 1300 mol m-2 s-1 e dficit de
presso de vapor entre a folha e o ar ao redor de 1,5 kPa, as temperatura utilizadas foram as
mesmas indicadas nos tratamentos testemunha (32 C) e baixa temperatura (22 C). As
49
variveis medidas em relao s trocas gasosas foram: assimilao de CO (A, mol m-2 s-1),
2
-2 -1 -2 -1
condutncia estomtica (g , mol m s ), transpirao (E, mmol m s ) e concentrao interna
s
de CO2 (Ci). Calculou-se a eficincia aparente de carboxilao pela razo entre A/Ci (ZHANG
et al., 2001) e a eficincia intrnseca do uso da gua (EUAi) pela razo (A/gs).
As variveis analisadas em relao fluorescncia da clorofila a foram realizadas
como descrito no captulo II.
Para anlise dos dados tanto das trocas gasosas como da fluorescncia da clorofila a,
foram utilizadas as mdias das 20 medidas (quatro medidas por horrio) realizadas em cada
dia do perodo experimental. Calculou-se a assimilao diurna de CO2 (Ai) a partir da
integrao da assimilao instantnea de CO2 ao longo do dia, utilizando a mdia de 4
repeties.
Em cada um dos dias de medidas das trocas gasosas tambm foram realizadas medidas
do potencial da gua na folha (w), antes das lmpadas da cmara de crescimento serem
acesas (pr-manh) e s 14:00 h, como descrito no captulo II.
Teor de carboidratos
Nos dias de medidas, s 9:00 h foram coletadas folhas +1 de quatro plantas por
tratamento, as quais foram imediatamente imersas em nitrognio lquido e mantidas em
freezer (-80 C) at o momento das anlises. Antes da elaborao do extrato para anlise do
teor de carboidratos, as folhas foram submetidas secagem em estufa com circulao forada
de ar temperatura de 60 C, por quatro dias ou at massa constante. Os procedimentos foram
realizados como descrito no captulo II.
Os extratos para anlises de sacarose (SAC) e de acares solveis totais (AST) foram
obtidos pelo mtodo descrito por BIELESK & TURNER (1966).
A determinao do teor de AST foi feita pelo mtodo do fenol-sulfrico, descrito por
DUBOIS et al. (1956), de SAC pelo mtodo descrito por VAN HANDEL (1968) e de amido
pelo mtodo enzimtico descrito por AMARAL et al. (2007).
50
Atividade de enzimas do metabolismo de carboidratos
51
minutos, em banho-maria a 100 C. Em seguida, acrescentou-se 1,5 mL de reagente antrona
preparado da seguinte forma: 76 mL de H2SO4, 30 mL de gua e 150 mg de antrona. A reao
foi incubada a 40 C por 20 minutos e realizada a leitura da absorbncia em
espectrofotmetro (Genesys 10UV Scanning - Thermo Scientific) no comprimento de onda de
620 nm. A concentrao de sacarose foi calculada a partir de uma curva padro obtida com
leituras de solues contendo respectivamente 0,5, 1, 2, 3 e 4 mM de sacarose. Como branco,
colocou-se gua no lugar da amostra.
A atividade da enzima invertase cida solvel (IVA, EC 2.4.1.25) foi obtida pelo
mtodo descrito por ZHU et al. (1997). Em microtubo foram adicionados: 50 L de extrato,
50 L de tampo de reao acetato de sdio 1 M e pH 4,5 e 100 L de uma soluo de
sacarose 120 mM. A reao foi incubada a 37 C por 0, 30 e 60 minutos. A reao foi
interrompida acrescentando-se 30 L de Tris 2,5 M e levada ao banho-maria a 100 C por trs
minutos.
A dosagem de acares redutores foi realizada pelo mtodo de Somogyi-Nelson
(NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945; 1952). Foram colocados em tubos de ensaio 100 L de
reao enzimtica e 400 L de gua, em seguida adicionou-se 500 L de soluo Somogyi
A+B (misturadas na proporo 4:1), os tubos foram agitados, vedados e levados ao banho-
maria 100 C por 10 minutos. Ao trmino do tempo a reao foi colocada em banho de gelo e
em seguida adicionou-se 500 L de soluo de Nelson e 1000 L de gua. Os tubos foram
agitados e foram feitas as leituras de absorbncia em espectrofotmetro (Genesys 10UV
52
Scanning - Thermo Scientific) no comprimento de onda de 560 nm. A concentrao de
acares redutores foi calculada a partir de uma curva padro obtida com leituras de solues
contendo respectivamente 0,5, 1, 2, 3 e 4 mM de glicose. Como branco, colocou-se gua no
lugar da amostra.
Delineamento experimental
3 RESULTADOS
53
Tabela 1 - Resposta do potencial hdrico foliar (w6h) de cana-de-acar cv. IACSP94-2094 e
cv. IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos de baixa temperatura e deficincia hdrica.
Mdias de quatro repeties ( desvio padro).
w6h (MPa)
cv. Controle Mximo estresse
(32/20 C) (22/12C)
IACSP94-2094 I -0,35 0,02 -0,36 0,02
IACSP94-2094 NI -0,35 0,02 -0,69 0,02
IACSP95-5000 I -0,40 0,02 -0,40 0,015
IACSP95-5000 NI -0,40 0,02 -0,68 0,02
54
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
30 A B
20
15
10
1200 C D
1000
Ai (mmol m-2 d-1)
800
600
400
200
0
2
13
20
22
28
0
2
13
20
22
28
Dias de tratamento
Figura 1 - (A, B) Resposta da assimilao de CO2 (A) e (C, D) assimilao diria de CO2 (Ai)
de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha)
medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2
medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e no irrigadas
(NI); dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no
irrigadas (estresse intermedirio); dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas
irrigadas e no irrigadas (estresse mximo); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro para A e 4 repeties erro padro
para Ai.
55
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
0,24
A B
0,20
4,5
3,0
1,5
E F
180
EUAi (mol mol-1)
150
120
90
60
13
20
22
28
13
20
22
28
0
2
0
2
Dias de tratamento
Figura 2 - (A, B) Resposta da condutncia estomtica (gs), (C, D) transpirao (E) e (E, F)
eficincia intrnseca do uso da gua (EUAi) de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e
IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20
C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite)
com plantas irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13 dias (estresse
intermedirio); de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps
20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e no irrigadas (estresse mximo); dia 22
medida aps 2 dias de retorno temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8
dias de recuperao das plantas. Smbolos indicam mdia de 20 repeties erro padro.
56
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
300
A B
250
Ci (mol mol-1)
200
150
100
3,0 C D
A/Ci (mol m-2 s-1 Pa-1)
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
2
13
20
22
28
0
2
13
20
22
28
Dias de tratamento
57
temperatura e deficincia hdrica tendo se recuperado totalmente aps retorno s temperaturas
mais altas e reidratao (Figura 5D).
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
0,28
A B
0,24
0,20
Fq'/Fm'
0,16
0,12
0,08
0
2
13
20
22
28
0
2
13
20
22
28
Dias de tratamento
58
recuperando aos valores do controle aps o perodo de retorno s temperaturas mais altas e
reidratao (Figura 7B).
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
2,1 A B
1,8
NPQ
1,5
1,2
0,9
0,6
C D
Fv/Fm
0,75
0,60
Fv'/Fm'
0,45
0,30
0
2
13
20
22
28
0
2
13
20
22
28
Dias de tratamento
59
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
0,54 A B
0,45
Fq'/Fv'
0,36
0,27
0,18
120
ETR (mol m-2 s-1)
C D
100
80
60
40
0
2
13
20
22
28
0
2
13
20
22
28
Dias de tratamento
60
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
560
A B
480
320
240
250 C D
SAC (mol g-1 MS)
200
150
100
50
420
E F
350
AMI (mol g-1 MS)
280
210
140
70
0
0
2
13
20
22
28
0
2
13
20
22
Dias de tratamento 28
Figura 7 - (A, B) Variao no teor dos acares solveis (AS), da (C, D) sacarose (SAC) e do
amido (AMI) em folhas de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo
o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite) com
plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas (I) e no irrigadas (NI); dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura em
plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas
irrigadas e no irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de quatro repeties erro padro.
61
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
0,60 A B
0,45
0,00
0,75
C D
(mol gMF min-1)
0,60
0,45
SPS
0,30
0,15
0,00
0
2
0
2
13
20
22
28
13
20
22
28
Dias de tratamento
Figura 8 - Variao da atividade das enzimas (A, B) sintase de sacarose (SuSy) e da (C, D)
sintase de sacarose fosfato (SPS) em folhas de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e
IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20
C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite)
com plantas irrigadas e no irrigadas; dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura
em plantas irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em
plantas irrigadas e no irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de quatro repeties erro padro.
62
IACSP94-2094 I IACSP95-5000 I
IACSP94-2094 NI IACSP95-5000 NI
5,4 A B
IVA
2,7
1,8
0,9
0,0
4,5 C D
(mol gMF min-1)
3,6
IVN
2,7
1,8
0,9
0,0
0
2
0
2
13
20
22
28
13
20
22
28
Dias de tratamento
Figura 9 - Variao da atividade das (A, B) invertases cidas (IVA) e das (C, D) invertases
neutras (IVN) em folhas de cana-de-acar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000,
sendo o dia 0 (testemunha) medida feita aps 18 dias de aclimatao a 32/20 C (dia/ noite)
com plantas irrigadas; dia 2 medida feita aps 34 horas a 22/12 C (dia/ noite) com plantas
irrigadas e no irrigadas; dia 13 medida feita aps 13 dias de baixa temperatura em plantas
irrigadas e no irrigadas; dia 20 medida aps 20 dias de baixa temperatura em plantas
irrigadas e no irrigadas (mximo estresse); dia 22 medida aps 2 dias de retorno
temperatura de 32/20 C e reidratao e dia 28 medida aps 8 dias de recuperao das plantas.
Smbolos indicam mdia de quatro repeties erro padro.
4 DISCUSSO
63
esta resposta, ou seja, os maiores valores de gs (Figura 2A, B) permitindo maior fluxo de
difuso do CO2 atravs das aberturas estomticas, combinados com os maiores valores da
razo A/Ci (Figura 3C), que indica maior eficincia de carboxilao. Outras caractersticas se
destacam na IACSP95-5000, como a maior eficincia operacional do fotossistema II (Fq'/Fm',
Figura 4A, B) e consequentemente, maior ETR em relao a IACSP94-2094 (Figura 6C, D).
A IACSP95-5000 destaca-se em relao IACSP94-2094 como sendo uma cultivar menos
rstica e mais produtiva em ambientes favorveis (LANDELL et al., 2005), e neste trabalho
destacou-se tambm como uma cultivar com maior capacidade fotossinttica.
Sob estresse, independente do tratamento, baixa temperatura com e sem deficincia
hdrica, A e Ai da IACSP95-5000 tiveram valores significativamente maiores que o da
IACSP94-2094 (Figura 1). Entretanto, nas duas cultivares ocorreu decrscimo significativo
destes parmetros devido ao estresse. A queda relativa de Ai na IACSP94-2094 sob estresse
mximo de baixa temperatura (48%) e baixa temperatura e deficincia hdrica (38%) foram
estatisticamente semelhantes, no apresentando efeito cumulativo importante. No entanto, na
IACSP95-5000 ocorreu efeito cumulativo dos dois estresses, j que sob baixa temperatura Ai
decaiu 16%, enquanto em baixa temperatura e deficincia hdrica decaiu 35%, ou seja, mais
que o dobro. Outro aspecto a considerar que houve um aumento significativo de NPQ
durante o perodo de baixa temperatura e restrio hdrica na IACSP94-2094 I e NI (Figura
5A). Na IACSP95-5000, o NPQ foi semelhante durante todo o perodo experimental (Figura
5B). Segundo LAWLOR & TEZARA (2009), o NPQ uma forma de dissipao de energia
muito frequente quando h excesso de energia no utilizada. Estes resultados sugerem que a
fotossntese de ambas as cultivares foi sensvel baixa temperatura, porm a IACSP95-5000
com menor intensidade que a IACSP94-2094. Por outro lado, com a ocorrncia simultnea de
baixa temperatura e deficincia hdrica, a IACSP95-5000 foi, possivelmente, mais sensvel ao
efeito cumulativo de frio e seca. Interessante notar que RIBEIRO et al. (2013) observaram
que sob deficincia hdrica mais severa (W6h = -1,8 MPa) a IACSP94-2094 apresentou as
menores quedas em A, quando comparada a outras cultivares, SP87-365 e IACSP96-2042.
Comparativamente, a cv. IACSP95-5000 apresentaram queda maior da razo A/Ci do que a
IACSP94-2094 (Figura 3C e D). MARTINS (2012) tambm sugeriu que a maior tolerncia
deficincia hdrica da IACSP94-2094 em relao a IACSP95-5000 estaria relacionada com a
maior fotoproteo indicada pelo NPQ e maior atividade e expresso de PEPcase.
A queda de A aps 34 h de imposio dos tratamentos pode estar relacionada a fatores
difusivos, metablicos e fotoqumicos (ALLEN & ORT, 2001; DU et al., 1996;
GHANNOUM et al., 2003; GHANNOUM, 2009; MACHADO et al., 2009, 2010). De fato,
64
no presente trabalho a queda em A foi devida tanto a fatores difusivos, relacionados queda
de gs (Figura 2A e B), como metablicos, queda na razo A/Ci (Figura 3C e D) e tambm
fotoqumico, queda em Fq'/Fm', (Figura 4) com consequente queda em ETR (Figura 6C e D).
DU et al. (1996) observaram em cana-de-acar sob deficincia hdrica moderada (W6h = -
0,85 MPa), que o declnio da fotossntese ocorreu devido, principalmente, a fatores
estomticos. Sob deficincia hdrica mais severa (W6h < -0,85 MPa), o declnio de A foi
devido, em parte, queda de gs, acrescido por componentes metablicos, sendo o fator
limitante a enzima PPDK. LOBO (2012) tambm relatou que a deficincia hdrica em cana-
de-acar promoveu decrscimos em gs e da atividade e expresso de Rubisco e PEPcase.
O efeito mximo da baixa temperatura sobre A ocorreu de forma rpida, ou seja, j nas
34 horas iniciais, visto que durante o resto do perodo experimental, at o 20 dia, o
incremento na queda de A foi negligvel em ambas as cultivares. Como j foi descrito, na
IACSP94-2094 no ocorreu maior queda de A, mesmo com a adio do estresse hdrico
(Figura 1A).
Aps o resfriamento, com o declnio de A, foi observado o fechamento estomtico, que
pode ter ocorrido devido a um efeito direto do frio sobre as clulas-guarda ou ainda, uma
resposta indireta ao aumento de Ci, induzido pela diminuio da atividade de carboxilao
(ALLEN & ORT, 2001). De fato, Ci aumentou progressivamente enquanto A/Ci diminuiu em
ambas as cultivares (Figura 3). Alm disso, pode ocorrer sinalizao qumica causada pelo
frio e tambm pela deficincia hdrica o que poderia ainda causar o fechamento estomtico
(LIANG & ZHANG, 1999; VESELOVA et al., 2005; ZHOU et al., 2007). No tratamento com
baixa temperatura, as respostas em ambas as cultivares foram semelhantes, porm mais
acentuadas na IACSP94-2094. Em relao ao efeito conjunto da baixa temperatura e
deficincia hdrica, os mesmos efeitos podem ter ocorrido acrescidos da queda do w6h.
Entretanto, em nenhuma das cultivares ocorreu aumento da fotorrespirao devido aos
estresses, como pode ser verificado pela relao linear entre eficincia operacional (Fq'/Fm') e
eficincia quntica (CO2), dada por CO2 = -0,00312 + 0,09783*Fq/Fm (R2=0,96, p<0,01)
(dados no apresentados). Esta relao indica a utilizao de 10,2 ftons/CO2 fixado,
independente do tratamento.
Quando ambos os estresses ocorreram conjuntamente, com a queda de A tambm
ocorreu queda em gs evitando assim a desidratao. O aumento de Ci s ocorreu no perodo de
seca intermediria e mxima (respectivamente no 13o e 20 dias) (Figura 3A e B). O aumento
de Ci (Figura 3A e B) na IACSP94-2094 NI e na IACSP95-5000 NI coincide com o
decrscimo do w6h (Tabela 1), sugerindo que o declnio de A pode tambm ter ocorrido
65
devido a fatores no estomticos (DU et al., 1996; LOBO 2012), como foi sugerido pela
queda de A/Ci (Figura 3C e D).
Quando as plantas so expostas a estresses biticos e abiticos, so frequentemente
observados decrscimos na eficincia quntica mxima do FSII (Fv/Fm) (BAKER, 2008).
Fv/Fm representa a eficincia mxima com que a luz absorvida pelo FSII usada para a
reduo da QA (BAKER, 2008). Neste experimento, ambas as cultivares apresentaram
decrscimo significativo de Fv/Fm aps o resfriamento (Figura 5C e D), permanecendo baixo
durante todo o perodo de tratamento, porm somente a IACSP94-2094 I e NI apresentaram
valores abaixo de 0,725 caracterizando fotoinibio (CRITCHLEY, 1998). A alterao do
Fv/Fm pode ter ocorrido devido a mudana na eficincia da dissipao no-fotoqumica
(MAXWELL & JOHNSON, 2000). De fato, na IACSP94-2094 I e NI houve aumento de
NPQ acompanhado do decrscimo de Fv'/Fm' durante o perodo de tratamento (Figura 5A e
C).
A taxa de consumo de ATP e NADPH um dos principais fatores que determinam a
eficincia operacional FSII (Fq'/Fm') em muitas situaes. Alteraes na eficincia de
carboxilao, na taxa de regenerao da ribulose 1,5-bisfosfato (RuBP), no fornecimento de
CO2 para os stios de carboxilao via estmatos e na taxa de transporte de carboidratos para
fora da clula podem influenciar a taxa de utilizao de ATP e NADPH e, consequentemente,
Fq'/Fm'. Muitos estresses ambientais alteram a assimilao de CO2, embora os locais da
limitao da fotossntese possam ser muito variados. O estresse induz a reduo da
condutncia estomtica, do metabolismo de carbono e do transporte, podendo diminuir a
eficincia do FSII. Aumentos de NADPH e ATP diminuem o fluxo linear de eltrons e a taxa
de oxidao de QA, que podem ser monitorados por diminuies no fator de eficincia do FSII
(Fq'/Fv'). No entanto, a acidificao do lmen, bem como o aumento dos teores de ATP
tambm resultam num aumento do NPQ (Figura 5A, B) e uma diminuio do Fv'/Fm' (Figura
5C, D) (BAKER, 2008).
A assimilao de CO2 pelas folhas resulta em triose-P, da qual sintetizada sacarose e
amido como produtos finais de duas rotas gliconeognicas: a sacarose no citosol das clulas
do mesofilo e o amido nos cloroplastos da BFV em cana-de-acar (GROF & CAMPBELL,
2001; LUNN & FURBANK 1999). Durante o dia, a sacarose continuamente exportada para
tecidos no fotossintetizantes da planta, enquanto o amido acumulado nos cloroplastos. Os
teores de amido do cloroplasto so mximos durante o dia e mnimos a noite, quando
degradado para sntese de sacarose, mantendo assim, sua exportao durante a noite. Em
condies adequadas, baixos teores de acar estimulam a fotossntese (McCORMICK et al.,
66
2006; LOBO, 2012), a mobilizao de reservas e a exportao, enquanto a alta concentrao
de acar promove o crescimento e o armazenamento de carboidratos (SMITH & STITT,
2007; SOUZA, 2011; TAIZ & ZEIGER, 2009).
Em folhas de cana-de-acar, sob condies normais de crescimento, a glicose e a
frutose apresentam a maior concentrao s 10 h, enquanto o contedo de sacarose comea a
aumentar s 10h, atingindo valores mximos entre 13 e 16 h e o declnio da sacarose ocorre
aps as 19 h. A concentrao de amido comea a aumentar a partir das 10 h e tem um pico
mximo s 16 h. A partir das 19 h, 90% do amido produzido na folha so ento consumidos
no perodo noturno (SOUZA, 2011).
Neste experimento, durante o perodo de estresse, as folhas para anlises bioqumicas
foram coletadas s 9 h e foi observado aumento no teor de AS (composto principalmente por
glicose + frutose + sacarose) em ambas as cultivares (Figura 7A, B, C e D). Na IACSP95-
5000 I e NI este aumento ocorreu aps 34 h de frio, enquanto na IACSP94-2094 I e NI o
aumento de AS ocorreu no perodo de mximo estresse. Houve acmulo de SAC nas folhas na
IACSP94-2094 NI no perodo de estresse mximo. Este aumento provavelmente est
relacionado com a alta atividade da SPS (Figura 7C e 8C). No trabalho apresentado no
captulo II, tambm foi observado aumento da concentrao de SAC nas plantas expostas
baixa temperatura noturna e deficincia hdrica (Tabela 2, Captulo II).
Em ambas as cultivares, independente do status hdrico, foi observado aumento da
concentrao de AMI foliar, porm este aumento foi bem maior na IACSP94-2094,
independente do regime hdrico, em relao testemunha. MACHADO (2009) tambm
observou em citros, aps o tratamento com baixa temperatura noturna, que houve aumento na
concentrao de AMI, provavelmente devido inibio de enzimas de mobilizao do amido,
ou ainda, a queda no crescimento, diminuindo assim a demanda (ALLEN & ORT, 2001). O
acmulo de carboidratos nas folhas aps a imposio dos tratamentos, tambm observado por
LOBO (2012), pode ser devido baixa demanda de carboidratos. Ou seja, possvel que a
queda no crescimento das plantas, que tem temperatura ideal em 35 C (EBRAHIM et al.,
1998; SALES et al., 2012), tenha sido mais afetada do que a queda em A, e portanto,
decorrente disto, ocorreu acmulo de reservas. Esta formao de reserva pode ser
remobilizada para suprir o substrato necessrio ao crescimento rpido, quando o ambiente se
tornar favorvel (PEARCE, 1999; POLLOCK & JONES, 1979).
Na rota de sntese de sacarose, a enzima chave a SPS, exercendo alto controle em
altas taxas fotossintticas e, portanto, tambm sobre o fluxo mximo de sntese (HUBER &
HUBER, 1996). Foi observado que em plantas sob baixas temperaturas houve aumento da
67
atividade da SPS e da SuSy em folhas de espinafre (GUY et al., 1992), ou ainda, aumento no
estado de ativao da enzima em folhas de cana-de-acar de cultivar tolerante (DU & NOSE,
2002). Entretanto, sob deficincia hdrica severa, DU et al. (1998) observaram que a atividade
enzimtica relacionada com a sntese de sacarose e amido diminuram, porm em menor
proporo que as trocas gasosas, indicando baixa possibilidade dos componentes da rota da
sacarose e amido como fatores limitantes das trocas gasosas.
No presente experimento houve respostas diferenciadas entre cultivares (Figura 8).
Houve aumento da atividade da SPS em IACSP94-2094 I e NI durante o perodo de
tratamento, sendo que no perodo de mximo estresse a atividade da SPS foi maior nas plantas
NI. O aumento da SPS indica mudana nas propriedades regulatrias da enzima
(BASCUN-GODOY et al., 2006). Alm disso, sob baixas temperaturas, o aumento da
atividade da SPS associado ao acmulo de SAC sugerem que a resposta no simplesmente
de ajuste deste processo metablico para superar a cintica enzimtica lenta em baixas
temperaturas, mas provavelmente, um processo adaptativo para maximizar a sntese do
composto com propriedades osmticas importantes na tolerncia a esse estresse (GUY, et al.,
1992).
A utilizao da sacarose como fonte de energia depende de sua quebra, gerando
hexoses, e nas plantas duas enzimas catalisam esta reao: a SuSy, gerando FRU + UDP-
glicose, ou as invertases gerando GLU + FRU, que regulam a entrada da sacarose em
diferentes rotas de utilizao (STURM, 1999), incluindo o carregamento de carboidratos no
complexo cc-ec para exportao da sacarose (LALONDE et al., 2003: RAE et al., 2005;
SMITH & STITT, 2007). Em plantas de cana-de-acar, mudanas na atividade do dreno
podem promover ajustes nas taxas de descarregamento pelo floema (LALONDE et al., 2003)
promovendo a manuteno de um gradiente de exportao de sacarose.
A atividade da SuSy (Figura 8A e B) aumentou na IACSP94-2094 com a baixa
temperatura (no mximo estresse) e com a deficincia hdrica (no estresse intermedirio). Na
IACSP95-5000 NI houve aumento significativo da atividade da SuSy no estresse
intermedirio. VANDOORME et al. (2012) observaram em plantas de chicria, que a
deficincia hdrica no influenciou significativamente a atividade da SuSy, indicando a
utilizao de seus produtos em processos anablicos.
Durante o perodo de estresse, a atividade da IVA decresceu na IACSP94-2094 I e NI,
enquanto em ambas as cultivares nas plantas I houve aumento da IVN e nas plantas NI
decrscimo, indicando sensibilidade da IVN aos estresses impostos de forma simultnea
(Figura 9). Em decorrncia do aumento da atividade das invertases, houve um aumento do
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teor de AS (Figura 7A, B). Decrscimo de IVA foi observado por FU et al. (2010) em uma
espcie de gramnea sob deficincia hdrica, sugerindo que a alta concentrao de sacarose
seja uma consequncia do aumento da atividades das enzimas SPS e SuSy e declnio da IVA.
Na IACSP95-5000 o aumento da atividade da IVN nas plantas I pode ter contribudo
para a menor queda de A em relao s plantas NI, devido ao aumento no teor de hexoses, que
pode incrementar o potencial osmtico (Figura 1B, 7B e 9D).
Perodo de recuperao
69
floema (McCORMICK et al., 2008; LOBO, 2012). LOBO (2012) observou que a maior
concentrao de sacarose, frutose ou glicose causa queda acentuada na assimilao de CO2 e
no ETR. Os processos de inibio ou estmulo da fotossntese esto relacionados com o
consumo de intermedirios nos drenos (McCORMICK et al., 2006; 2008; 2009) prevenindo a
falta ou o acmulo de metablitos. Na recuperao tambm houve mudana geral nas
atividades de enzimas relacionadas ao metabolismo de carboidratos, bem como de seus teores
nas folhas. Os teores de carboidratos (AS, SAC e AMI) em todos os tratamentos, exceto na
IACSP94-2094 I, decresceram significativamente durante a recuperao em relao ao
mximo estresse. Este tipo de resposta sugere que ocorreu grande exportao da fonte em
direo aos drenos em crescimento ativo. Ao mesmo tempo, as atividades de SPS e SuSy
decresceram, enquanto as atividades das invertases aumentaram do 2 para 8 dia de
recuperao. Alta atividade de invertases indica alta taxa de catabolismo.
5 CONCLUSES
1. Sob condies ideais, a cv. IACSP95-5000 tem maior fotossntese que a cv. IACSP94-2094
devido maior condutncia estomtica e eficincia aparente de carboxilao.
6. O alto teor de acares solveis totais nas folhas da cv. IACSP94-2094 NI no perodo de
estresse mximo devido, principalmente, ao aumento no teor de sacarose, quando h
tambm aumento da atividade da sintase de sacarose fosfato.
7. O alto teor de acares solveis totais nas folhas da cv. IACSP94-2094 I no perodo de
estresse devido, principalmente, hidrlise do amido. Neste mesmo perodo ocorre tambm
aumento da atividade das invertases neutras.
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