SEMINARIO: CITOMETRA DE FLUJO

ALUMNO(A): MEI CHANG POBLETE

PROFESOR: VCTOR SOTO
FECHA:21-11-2017

OBJETIVOS:
Conocer las caractersticas fundamentales de la citometra de flujo:
-Historia
-Estructura/Funcin
-Aplicaciones
-Ventajas de su uso

INTRODUCCIN
Es un proceso en el cual mltiples caractersticas fsicas y/o qumicas de clulas aisladas (5000 -10000 clulas) o de
otras partculas biolgicas y no biolgicas son medidas y Nace como la sumatoria de mltiples hallazgos y aplicaciones
de diversas tcnicas fsicas, qumicas, durante por lo menos 250 aos.

HISTORIA
1920: Conteo de clulas sanguneas a travs del Hemocitmetro o cmara de Neubauer: un portaobjetos con dos
depresiones en el centro para colocar muestras de fluidos corporales y que estaba adaptado para ser observado al
microscopio de contraste de fases. Posteriormente se establecen los primeros ndices de clulas rojas.

1934: Primeras concepciones sobre la Citometra de flujo: documento de la poca introduce en un estudio el concepto
de conteo celular, en este caso eritrocitos, hacindolos fluir a travs de un tubo capilar y usando un sensor
fotoelctrico para hacer medidas de acuerdo con cunto demoraba la luz emitida en extinguirse al pasar a travs de
la sustancia en estudio. Dicho experimento nunca pudo llevarse a cabo por defectos tcnicos.

1940: Se estudia la dispersin de luz a travs de bacterias suspendidas en un medio gaseoso o aerosol y no en un
lquido. Esto fue realizado por la armada de los Estados Unidos durante la Segunda Guerra Mundial, utilizando
ultramicroscopios que haban sido diseados con anterioridad para el anlisis de suspensiones coloidales y para la
deteccin de partculas en aerosoles.

1940: Orgenes de la citologa del cncer a travs del frotis PAP. George Papanicolau desarroll la primera de las
mezclas de tincin para su uso en el estudio del ciclo menstrual en primates, observando que las caractersticas de
tincin de los frotis variaban de acuerdo con la etapa del ciclo. Luego aplic estos estudios en humanos, observando
que las clulas exfoliadas provenientes de pacientes con displasias cervicales podan ser distinguidas de las clulas
normales.
En el contexto de buscar nuevas alternativas diagnsticas , inspirados por Papanicolau, Friedman desarroll una
combinacin de fucsina acida, amarillo de acridina y sulfato de berberina para la deteccin de cncer uterino a travs
de microscopia de fluorescencia y encontr que los ncleos de clulas malignas se tean ms intensamente con
berberina que los de las clulas normales. A partir de esto, se desarrolla un microfluorometro escner capaz de
realizar mediciones de la fluorescencia de la berberina. Se comenz a utilizar este instrumento en el citodiagnstico.

1940: Albert Coons marca anticuerpos anti neumococo con antraceno pudiendo detectar el organismo, y ms
importante an el anticuerpo unido al antgeno en el tejido del espcimen a analizar esto, gracias a la fluorescencia
azul que emite el antraceno al ser estimulado por luz UV. En 1950 Coons introdujo el uso de la Fluorescena conjugada
con Isocianato.

-1950: Caspersson estableci las bases de lo que es la citologa analtica moderna. En su libro el crecimiento celular
y funcionamiento celular describe detalladamente estudios sobre los cidos nucleicos y el metabolismo de protenas
tanto en clulas con crecimiento normal como anormal. Estos estudios fueron realizados mediante tcnicas de
espectrofotometra de absorcin de clulas no coloreadas, en el espectro UV y visible de radiacin.

-1954: Coulter estudia la conductividad elctrica de las clulas, la cual era menor que la de las soluciones salinas
(estudiado desde 1890). Razonaron que si se hacan pasar las clulas sanguneas (ej.) a travs de un orificio pequeo
en una solucin salina, al momento de pasar por el orificio las clulas no conductoras generara un cambio en la
conductancia elctrica o resistencia del orificio (impedancia), desplazando a la solucin salina.

1956: Van Bertalanffy demuestra que el Naranja de Acridina poda ser utilizado para identificar y cuantificar el
contenido de ARN en los tejidos y que permita una correcta discriminacin visual entre clulas malignas de normales
en frotis.

1960-1964: Nacen los cito analizadores y Automatizacin.

-Marylou Ingram propone que personas expuesta a radiacin presentaban leucocitos binucleados en sangre perifrica.
-Kendall Preston disea Cito analizador para analizar las clulas identificadas por Marylou Ingram. Se podan obtener
imgenes digitalizadas de leucocitos teidos con Azur-Eosina. Posteriormente se tien con Galocianina cromo
alumbre y Amarillo Naftol S.

1960: Hallerman establece diferencia entre clulas sanguneas utilizando Naranja de Acridina.
-Leucocitos: se marcaban con NA y emitan pulsos de fluorescencia que eran registrados por detectores.
-Eritrocitos: no se marcaban con NA y slo eran detectados sus pulsos de dispersin en el cito-analizador.
-Granulocitos: emitan fluorescencia citoplasmtica roja metacromtica de gran intensidad.
Con esto se hace la primera aproximacin ms significativa a la citometra de flujo que conocemos hoy.

1963:Kamentsky desarrolla citmetro de flujo construido en base a un microscopio de transmisin y una lmpara de
arco.

1970 : Nuevos Modelos y Citometra de Flujo

-1970,Citgrafo: Incluye por primera vez como fuente de luz el lser.
-1974,Hemalog D: Primer Clitmetro de flujo que incorpora lser ms detectores de diferentes longitudes de onda
emitidas por fluorocromos.
-1978, Desarrollo de anticuerpos monoclonales por Kohler y Milstein

ESTRUCTURA DEL CITMETRO Y FUNCIONAMIENT O

Se analizarn las partes funcionales bsicas del citmetro de flujo.

LSER
Es un tubo hueco, cerrado, que contiene un gas inerte, como argn, helio o nen. Con el paso de una corriente
elctrica a travs del tubo lleno de gas se produce una luz lser intensa, monocromtica, que exita las molculas
gaseosas inertes en un nivel de energa ms alto. La luz en el tubo laser se intensifica con una serie de espejos y por
ltimo se emite como un haz de luz estrecho de una sola longitud de onda especifica. Los citmetros de investigacin
suelen equipar varios lseres, sin embargo, los de rutina trabajan con longitud de onda del fija (casi siempre 488 nm).

FLUDICA
Su objetivo es transportar las partculas a travs de una cmara de flujo hacia el punto en donde el fluido se encontrar
con la luz lser o punto de interrogacin. Para esto se aspira una muestra dentro de la cmara mediante una bomba
de vaco, dicha tubera contiene una corriente de lquido que se mueve hacia la periferia (cubierta de la cmara de
flujo) y una corriente central de lquido (la muestra con las clulas). La corriente de la muestra se centra en forma
hidrodinmica en una sola lnea (Flujo laminar, enfoque hidrodinmico) de partculas o clulas mediante el ajuste de la
presin externa sobre la cubierta(disminucin) y la velocidad de la corriente central(aumento). Esto hace que las
clulas se muevan en una sola hilera delante del haz del lser. Ambas corrientes no se mezclan.

PUNTO DE INTERROGACIN
En este punto es donde los lseres impactan con la muestra y se genera la luz resultante de este impacto, que es la
que en realidad ser analizada. El anlisis se centra en tres conceptos fundamentales:
 FORWARD SCATTER (DISPERSIN FRONTAL)
Corresponde a aquella parte de luz resultante del impacto que se dispersa en la direccin del haz de luz incidente
(Lser). La magnitud de esa dispersin constituye la primera medida importante en la citometra, ya que es
aproximadamente proporcional al tamao de la clula. Por lo tanto, este dato se puede utilizar para saber cun grandes
son las clulas que se analizan y si hay varias poblaciones de diferentes tamaos en la muestra. La luz de dispersin
frontal es recogida por el detector especfico en el citmetro y es convertida en un pulso de voltaje:
- Las clulas pequeas producen pulsos cortos en un tiempo dado, mientras que las grandes producen pulsos mayores.

SIDE SCATTER
Segunda medida de importancia en la citometra de flujo y corresponde a la luz proveniente del lser y que es
dispersada en un ngulo mayor al de FSC (15) y menor o igual a 90.
Da cuenta de la configuracin interna de la clula y de la variedad de clulas existente en una poblacin. Nace del
hecho que una poblacin de clulas puede ser homognea en cuanto a tamao (medido por FSC) pero diferente en
configuracin interna (presencia de granulaciones, mayor o menor numero de determinados organelos, vesculas, etc.)

FLUORESCENCIA
Qu es un Fluorocromo?
Es un producto qumico que al ser estimulado con fotones con longitud de onda comprendida entre determinados
rangos (de excitacin) emiten a su vez otro fotn de longitud de onda mayor (de emisin).
En la citometra de flujo es posible combinar a la vez dos o tres colorantes fluorescentes siempre que emitan
fluorescencia en diferente longitud de onda y el lser sea capaz de excitarlos a la vez y el detector pueda discriminar
los fotones emitidos por ellos.

PTICA
Se utilizan dos tipos de pticas:
1.ptica de excitacin: lser y lentes para enfocar y dirigir el haz de luz.
2.ptica de lectura: lentes de recoleccin de luz emitida luego de la interaccin entre el haz del lser y las partculas
y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda especficas hacia los detectores correspondientes.
-FILTROS OPTICOS: seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser:
-DE INTERFERENCIA: Son espejos dicroicos que reflejan las longitudes de onda no deseadas);
-DE ABSORCION: Absorben las longitudes de onda no deseadas. De stos hay tres tipos:
Filtros Band Pass: Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej.: 620 640 nm)
Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada (Por ej.: < 575 nm)
Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por ej.: > 520 nm)

SISTEMA DE DETECCIN
Se encarga de la cuantificacin de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada y, bajo el control del
ordenador, se consigue la carga electrnica de las gotas que contienen las clulas de inters para poder
someterlas a defleccin y recogerlas en tubos especficos para tal fin, o sobre pocillos de cultivo de tejidos.
El ordenador permite almacenar datos de miles de clulas por cada muestra, y representar los resultados
grficamente.

PREPARACIN DE LA MUESTRA
Toma de muestra: Depende del tipo de muestra a recolectar.
-Sangre perifrica
-Aspirados de medula sea
-Productos de leucaferesis
-Lquidos de cavidades corporales (liquido cefalorraqudeo, liquido pleural y liquido asctico)
-Biopsias: Medula sea, ganglio linftico, bazo y timo.
-Se debe evitar la muerte de las clulas puesto que estas alteran su composicin y por ende los resultados de la
citometra.
Transporte: Colocar la muestra en nevera de icopor a temperatura ambiente SIN CONGELAR, deben estar
envueltos en gasa o algodn y a su vez estar contenidos en otro recipiente para protegerse de derrames o
contaminaciones.

Perodo de conservacin: Es recomendable procesar las muestras recin obtenidas. No es conveniente hacerlo
despus de 24-48h y en algunas muestras el tiempo recomendado es an menor:
-LCR, PAAF biopsias especialmente si contienen clulas susceptibles de entrar en apoptosis.
Temperatura
T ambiente 18-25. Si no puede procesarse en el tiempo adecuado: Nevera a 4 C

Procesamiento:
-Recepcin
-Lisado de glbulos rojos(muestras hematolgicas; en caso de anlisis de leucocitos u otras clulas)
LNW: Menos manipulacin, menos prdida de clulas.
LW: Mayor manipulacin, mayor prdida de clulas.
-Muestras de tejido slido deben ser procesadas con mtodos fsicos.
-Aplicacin de Anticuerpos
Se incuba muestra en mezcla de anticuerpos monoclonales unidos a un fluorocromo especfico de acuerdo a
protocolos establecidos segn el objetivo de la tcnica, por tanto la eleccin de fluorocromo, lavados, tiempos de
incubacin, son variables.
-Normalmente se realiza inmunofluorescencia directa: se busca antgeno en tejido o clulas a estudiar.

APLICACIONES
VALORACIN DE MARCADORES DE SUPERFICIE CELULAR
-Utilizacin de inmunofluorescencia directa para molculas de superficie leucocitaria.
-Utilizacin de paneles de anticuerpos monoclonales (CD) unidos a fluorocromos manufacturados por diversas
empresas.
-Estudio de la diferenciacin de linfocitos T (CD3+CD4+, CD3+CD8+) para el diagnstico y seguimiento de la
infeccin por VIH y otras patologas con desequilibrio en las subpoblaciones T, B y NK.
-Cuantificacin de linfocitos pre-inmunes (naive) o de memoria (y otras subcategoras) tanto en la poblacin T como
B, para esto se ocupa la citometra multicolor de antgenos de superficie (Fluorescencia en Tndem)

VALORACIN DE MARCADORES INTRACELULARES

Requiere de Permeabilizacin de Clulas: 0.1% Triton X-100
Marcadores de molculas como:
-ZAP70 (Leucemia)
-Citoquinas
-Perforinas
-Ki-67
-FoxP3

CAPACIDAD DE PROLIFERACIN CELULAR

-Utilizacin de Fluorocromos Vitales
+ CFSE (Carboxifluorescena Succinimidil Ester): Marca Clulas y transmite fluorescencia a clulas hijas. Se puede
detectar capacidad proliferativa frente a mitgenos u otros estmulos antes sospecha de mal funcin inmunitaria.

CAPACIDAD METABLICA CELULAR

-Evaluacin de presencia o no de enfermedad granulomatosa crnica mediante la estimulacin de monocitos y
neutrfilos con Dihidrorodamina.
-Se reemplaza el uso del test de Nitroazul de Tetrazolio y medicin del estallido respiratorio.

RECHAZO AGUDO DE INJERTOS

Ayuda a discriminar entre una infeccin viral aguda y el rechazo de trasplante:
Infeccin Rechazo
-Reduccin de relacin CD4+/CD8+ -Incremento de LT-IL 2R+
-Aumento de clulas CD57+, CD8+, HLA-DR+ -Incremento de LT CD4+, CD45 Ra-
Rechazo Crnico
-Identificacin de clulas CD4+, CD25+, FOX-P3 y su relacin con el rechazo humoral de injertos o la tolerancia.

CONCLUSIN: VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Ventajas
-Medicin rpida de gran cantidad de clulas
-Mediciones multiparamtricas
-Diferenciacin de poblaciones celulares
Desventajas
-Alto costo de equipos de citometra
-Se necesita entrenamiento del personal
-No incluye otorga informacin de la clula
en su contexto tisular

BIBLIOGRAFA
-Shapiro, H. (2005). Practical Flow Cytometry. Hoboken: Wiley.
-Flow Cytometry Instruments, Reagents & Software. (2017). Beckman.com. Retrieved 21 November 2017, from
https://www.beckman.com/coulter-flow-cytometers
-Otero, M., & Gonzlez Navarro, E. (2013). Aplicaciones clnicas de la citometra de flujo. SEQC, 17, 62-70.
-Citometra de flujo | Thermo Fisher Scientific. (2017). Thermofisher.com. Retrieved 21 November 2017, from
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