UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

ESCUELA DE POST-GRADO
ESPECIALIDAD DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

Practica :

COMPORTAMIENTO Y EVALUACIN DE LAS PROTENAS DE

LA LECHE (CASENA Y DEL LACTOSUERO) FRENTE AL
TRATAMIENTO TRMICO Y pH

Curso : Bioqumica de los Alimentos

Alumna : Deyli Daz Lezama

Lima , 2010
 COMPORTAMIENTO Y EVALUACIN DE LAS PROTENAS DE
LA LECHE (CASENA Y DEL LACTOSUERO) FRENTE AL
TRATAMIENTO TRMICO Y pH

I. INTRODUCCIN

La leche es el lquido segregado por las glndulas mamarias de las hembras de

los mamferos. Es el alimento exclusivo del animal recin nacido y contiene
todos los nutrientes necesarios para su desarrollo. (1)

Desde un punto de vista fsico qumico, la leche es una mezcla homognea de

un gran nmero de sustancias (lactosa, glicridos, protenas, sales, vitaminas,
enzimas, etc) que estn unas en emulsin (la grasa y sustancias asociadas),
algunas en suspensin (las casenas ligadas a sales minerales) y otras en
disolucin verdadera (lactosa, vitaminas hidrosolubles, protenas del suero,
sales, etc) (2)

La leche contiene 30-36 g/l de protena y alcanza cantidades nutritivas de muy

alto valor biolgico. Las protenas de la leche se clasifican bien como casenas
o bien como protenas del suero. Todas las protenas se encuentran con fosfato
clcico en forma de complejos esfricos, altamente hidratados y singulares,
conocidos como la micela de casena. Tales complejos son polidiversos
variando su tamao desde 30 a 300 nm de dimetro, con un pequeo
porcentaje que se aproxima a los 600 nm. Las casenas suponen el 80% de
las protenas de la leche; consecuentemente, la cuajada formada por
aglomeracin de micelas de casena durante la fabricacin de queso retiene la
mayora de la protena total de la leche. Las restantes protenas son retenidas
en el suero del queso, de ah su nombre de protenas sricas (3).
II. OBJETIVOS
Los objetivos que se plantearon en la presente prctica son:

Evaluar en la leche entera el efecto del pH sobre las protenas de la

leche, empleando el anlisis turbidimtrico.

Evaluar en el lactosuero el efecto del tratamiento trmico (diferentes

temperaturas por diferentes tiempos) sobre las protenas del lactosuero,
haciendo uso del anlisis espectrofotomtrico en el rango UV.

III. REVISION DE LITERATURA

2.1 Las protenas de la leche
Las protenas de la leche son de dos tipos, protenas del lactosuero y casenas.
Las casenas constituyen ms del 80% de las protenas totales de la leche,
aunque la proporcin relativa de protenas del lactosuero frente a casenas
vara segn el estado de lactacin. La leche producida en los primeros das
despus del parto y hacia el final de la lactacin tiene un contenido de
protenas del suero mucho mayor que la leche de mitad de lactacin. Este
incremento est acompaado de niveles elevados de protenas del suero
sanguneo.

2.1.1 Las casenas

Las casenas de la leche se pueden subdividir bsicamente en cinco tipos,
casenas s1, s2, , y k. Todas ellas, excepto la casena , se sintetizan en la
glndula mamaria; la casena se origina en la protelisis postraslacional de la
casena , por la accin de las proteinazas nativas de la leche, principalmente
plasmina, o de la actividad proteoltica de las bacteria. Las proporciones
relativas de casena , , y k estn sujetas a variaciones genticas dentro de
los rebaos y pueden existir diferencias significativas en la composicin de la
casena de diferentes vacas. Sin embargo, la composicin global de la casena
de la leche de una explotacin, vara muy poco en cualquier fase de la
lactacin.
Las casenas son protenas globulares y tienen un contenido de aminocidos
similar a los otros tipos, aunque la cistena slo est presente en pequeas
cantidades en las casenas s2 y k. Una caracterstica inusual de las casenas
es la modificacin post-ribosomal que consiste en la fosforilacin de los grupos
hidrxilo de la serina. Los residuos de fosfoserina son, en parte, responsables
de las propiedades nicas de las casenas.

La casena s2 contiene de siete a nueve residuos de fosfoserina por mol, la

s2 10 a 13 y la cinco. Los residuos de fosfoserina se concentran en grupos y
son responsables de la existencia de reas hidroflicas de fuerte carga
negativa. Las molculas tambin contienen bloques de residuos hidrofbicos.
La casena contiene la mayora de los componentes hidrofbicos y forma
agregados con el grupo hidroflico N-terminal expuesto al solvente y la parte
hidrofbica hacia el interior.

Tabla 1. Las casenas de la leche

Fraccin Peso molecular1 Residuos fosfoserina
Alfas1 23.000 7-9
Alfas2 25.000 10-13
Beta 24.000 5
Gamma 11.600-20.500 01
Kappa 1.980 12
1. Peso molecular del monmero
2. Slo la casena que contiene carbohidratos

Las casenas s son sensibles del calcio debido a la presencia de grupos

fosfato y precipitan en presencia de iones Ca2+ a pH 7.0. Las cadenas
polipeptdicas contienen 8.5% de prolina, lo que limita la formacin de la
hlice .

La casena k define de las casenas y porque contiene slo un grupo

fosfoserina y una fraccin glucdica cargada. La molcula de casena k parece
que se trata de una estructura relativamente estable con un puente disulfuro,
en la que hay tanto regiones con conformacin -hlice como -plegada. Se
cree que el enlace Phe105 Met106 sensible a la quimosina, sobresale de la
superficie molecular. Un tercio de la molcula de casena k corresponde a la
zona C-terminal fuertemente inica, que contiene tres residuos glucdicos. El
resto de la molcula es altamente h idrofbico y correspondiente a la para-k-
sena formada despus de la hidrlisis del enlace Phe-Met.

El carcter anfiflico de las casenas y su fosforilacin facilita las interacciones

entre ellas y con el fosfato clcico para formar complejos esfricos altamente
hidratados conocidos como micelas. Su tamao es variable, oscilando su
dimetro entre 30 y 300 nm (dimetro medio 120 nm, peso molecular 10 8). El
92% del contenido proteico de las mi celas est constituido por casenas s1,

s2, y k con una relacin media de 3:1:3:1. El 8% restante son compuestos

inorgnicos, principalmente fosfato clcico coloidal. Se cree que se distribuye
en la micela en forma de fosfato clcico amorfo y la presencia de iones calcio
es absolutamente esencial para la formacin de la micela. La transformacin en
formas ms estables, como el hidroxiapatito, se evita con la presencia de otros
iones, especialmente magnesio. El fosfato tambin parece que es esencial en
la estabilidad de las micelas al calor.

Se han propuesto varios modelos para la micela de casena que muchas veces
son contradictorios. El ms satisfactorio supone a la micela de casena
constituida por un agregado de sub-micelas casi esfricas que a su vez estn
formadas por agregados de molculas de casena. El fosfato clcico y las
casenas s1 y se unen al participar los grupos fosfoserina en la estructura del
fosfato clcico. La casena k se localiza en la superficie de la micela, o muy
cerca de ella. La zona hidrofbica de la molcula de casena k se une al centro
de la micela, mientras el macropptido hidroflico forma una capa de filamentos
pilosos altamente hidratados, que se proyectan en la fase acuosa. Los
filamentos de casena k son responsables de la estabilizacin estrica de las
micelas de casena.
Parece que los componentes de la micela de casena estn en equilibrio con la
fase acuosa, mientras la leche recin ordeada contiene slo pequeas
cantidades de casena soluble, algunas casenas se disocian junto con el
fosfato clcico coloidal de la micela durante el almacenamiento a 0C. La
casena principalmente afectada es la , que se puede encontrar hasta un 40%
en solucin. Se disocia una cantidad relativamente pequea de casenas s1 o
k y por esta razn se ha considerado que son estos dos componentes los que
tienen principalmente funcin estructural. La disociacin es reversible, pero no
se sabe si la estructura nativa se forma de nuevo.

2.1.2 Protenas del lactosuero

Las protenas del lactosuero comprenden dos tipos de protenas nativas: -
lactoglobulina y -lactalbmina; la fraccin proteosa-peptona (derivada de la
hidrlisis de la casena ) y pequeas cantidades de protenas de origen
sanguneo: seroalbmina e inmunoglobulinas (tabla 2).

Las protenas del lactosuero tienen una estructura tpica de protenas

globulares compactas, con una secuencia en la que los grupos no polares,
polares y cargados tienen una distribucin relativamente uniforme. Las
protenas sufren un plegamiento intramolecular como resultado de la formacin
de puentes bisulfuro entre los grupos sulfhidrilo de las cisitenas, quedando la
mayor parte de los grupos hidrofbicos encerrados en el interior de la molcula.
Por esta razn las protenas del lactosuero no se agregan fuertemente, ni
interactan con otras protenas, en estado nativo.

Tabla 2. Las protenas del lactosuero de la leche

Fraccin Peso molecular1
Beta-lactoglobulina 18.300
Alfa-lactalbmina 14.000
Seroalbmina 63.000
Inmunoglobulinas hasta 1.000.000
La protena mayoritaria del lactosuero, -lactoglobulina, sufre una limitada
autoasociacin a los valores de pH normales de la leche, para formar un
dmero con una forma geomtrica que recuerda a dos esferas superpuestas.
Los dmeros se disocian en solucin a 60C, volvindose susceptibles a la
desnaturalizacin por desdoblamiento de la estructura terciaria. La -
lactalbumina tiene una estructura primaria similar a la de la lisozima y es muy
compacta, con forma prcticamente esfrica. Esta molcula es termoestable
que la -lactoglobulina.

2.1.3 Efecto del calor sobre las protenas de la leche

Las micelas de casena son notablemente estables a temperaturas de hasta
140C. Por el contrario, las protenas del lactosuero son relativamente
termolbiles, sufriendo una intensa desnaturalizacin a 80C. La
desnaturalizacin se acompaa de la rotura y nueva formacin de numerosos
puentes disulfuro estabilizantes. -lactoglobulina, es ms sensible al calor que
la -lactalbmina debido a su grupo sulfhidrilo libre, que origina la iniciacin de
reacciones de intercambio disulfuro autocatalizadas.

La desnaturalizacin de la -lactoglobulina tiene importantes consecuencias

adicionales, ya que 100 C y temperaturas ms elevadas se produce una
interaccin entre la -lactoglobulina, y la casena k. En esta interaccin
probablemente se produce un intercambio tio-disulfuro, y mientras la casena k
permanece en la superficie, las propiedades de la superficie micelar se alteran.
Estos cambios afectan a la interaccin de las micelas con el fosfato clcico, y
por lo tanto a su estabilidad. El precalentamiento de la leche no concentrada a
90C por ejemplo, reduce su estabilidad durante el procesado posterior a
temperaturas ms elevadas. Por el contrario, la estabilidad de la leche
concentrada aumenta por calentamiento a 90C. Esto probablemente se debe a
la reduccin de la concentracin de iones calcio inducida por el calor, que es
considerable en la leche concentrada, superando el efecto desestabilizante de
la reaccin de la micela con la -lactoglobulina.
El calentamiento continuado conlleva cambios ms intensos incluyendo
protelisis inducida por el calor, formacin de lisinoalanina y pardeamiento de
Maillard. El calentamiento durante perodos de tiempo superiores a 20 minutos
a 140 conduce a la desestabilizacin de las micelas de casena y la formacin
de un gel.

2.1.4 Las protenas lcteas y el comportamiento de la leche durante el

procesado
Las propiedades de las protenas lcteas se relacionan con el comportamiento
de la leche durante el procesado, tanto debido a las caractersticas especificas
de la micela de casena como a la secuencia de aminocidos que en definitiva
determinan las propiedades funcionales.

Las reacciones ms importantes de las protenas lcteas son aquellas que

conllevan la desestabilizacin de las micelas proteicas. Algunas de estas
reacciones son tecnolgicamente deseables, como la formacin de un gel, bien
cuando se reduce el pH de la leche (por ejemplo, en la elaboracin de leches
fermentadas o quesos de coagulacin cida) o cuando la casena sufre una
protelisis selectiva (por ej., en la elaboracin de queso Cheddar). La
acidificacin en condiciones adecuadas tambin puede utilizarse para
fraccionar las protenas de la leche (por ej., obtencin de casena cida). Sin
embargo, en otros casos, las reacciones que determinan la desestabilizacin
de las micelas no son tecnolgicamente deseables. Entre estas ltimas se
incluyen diversas reacciones que causan la agregacin de la casena como
ocurre en la gelacin por envejecimiento de las leches concentradas.

Las propiedades funcionales de la casena y el lactosuero reflejan la secuencia

de aminocidos, y por tanto la conformacin de las protenas. En el caso de la
casena, la naturaleza anfiflica de la molcula, con aminocidos hidroflicos e
hidrofbicos, le confiere unas excelentes propiedades activas de superficie que
se traducen en las propiedades funcionales de emulsificacin y formacin de
espumas. Estas propiedades dependen en cierta medida del pH.
Las protenas del lactosuero no son anfiflicas y generalmente tienen menor
actividad de superficie que la casena. Las propiedades estabilizantes de
espumas son, sin embargo, superiores ya que forman una capa ms rgida en
la interfase aire/agua.

2.1.5 Propiedades nutritivas de las protenas lcteas

Las protenas lcteas tienen un gran valor nutritivo y en las tablas de
clasificacin provisional de los alimentos en funcin de su calidad nutritiva,
elaboradas por la Comisin de Agricultura y Alimentacin de las Naciones
Unidas, tanto las casenas como las protenas del lactosuero tienen
puntuaciones altas. los dos tipos de protenas lcteas son completamente con
respecto al contenido de aminocidos esenciales y esto compensa la ligera
deficiencia de aminocidos sulfurados, metionina y cistena de la casena. La
protena lctea es tambin muy digestible, aunque la digestibilidad puede
disminuir tras el procesado. El proceso tambin conduce a la prdida de
nutrientes.

IV. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

4.1 Estudio del efecto del pH sobre las protenas de la leche

Materiales, equipos y reactivos
- 5 beakers de 50 mL
- 1 probeta de 50 mL
- 02 pipetas de 1 2 mL
- Papel Whatman # 4
- Solucin de NaOH y HCl 0.1 N
- Potencimetro
- Conductmetro
- Espectrofotmetro rango visible y UV
- Centrfuga
- Sistema de filtracin
- Bao Mara
Procedimiento
- Se llev con una pipeta 20 mL de la leche a un beaker de 50 mL. Se
hizo esto 5 veces.
- En cada beaker se regul el pH a valores de 3, 4.6, 5.5, 6 y 7
(midindose la conductividad).
- Se centrifugaron las diversas soluciones a 5000 rpm por 10 minutos.
- Se separ el sobrenadante cuidadosamente, sin dejar caer parte del
precipitado y si cay parte del precipitado, se filtr con papel
Whatman # 4.
- En cada fraccin sobrenadante, se ley la turbidez a 500 nm en el
espectrofotmetro y la conductividad.

De los resultados obtenidos se hicieron las siguientes grficas.

a. pH vs turbidez en el sobrenadante (D.O. a 500 nm)
b. Conductividad (ms) vs pH
Esquema experimental 1: Estudio del efecto del Ph sobre las protenas de
la leche

20 mL de Leche

Con NaOH o Hcl

pH 3 pH 4.6 pH 5.5 pH 6 pH 7

Centrifugar a 5000 rpm x 10 minutos

Separar sobrenadante Si cae precipitado

Turbidez
Conductividad

Reporte de resultados
4.2 Estudio del efecto del tratamiento trmico sobre las protenas del
Lactosuero
Materiales, equipos y reactivos
- 9 beakers de 50 mL
- 1 probeta de 50 mL
- Papel Whatman # 4
- Centrfuga
- Sistema de filtracin
- Bao mara
- Embudos

Procedimiento
- Se llev con una pipeta 40 mL de suero a un beaker por 9 veces.
- Tres de los beakers fueron sometidos a la temperatura de 50C por
10, 20 y 30 min, los otros tres beakers fueron sometidos a la
temperatura de 70C por los mismos tiempos y en una tercera serie
se colocaron los beakers a 100C por los mismos tiempos.
- Pasados los tiempos respectivos se procedi a centrifugar a 5000
rpm por 10 min, luego se separ el sobrenadante cuidadosamente,
sin dejar caer parte del precipitadoy si caa parte del precipitado, se
filtr con papel Whatman # 4.

Para cada fraccin de sobrenadante obtenido se ley la densidad ptica en el

rango UV a 280 y 260 nm y se hall el contenido de protena del lactosuero
inicial y a la que qued en el sobrenadante luego de cada tratamiento, para
ello se recurri a la siguiente frmula:

Concentracin de protena (mg/mL) = 1.45 DO280 0.74 DO 260 (Kalckar, 1947).

Esquema experimental 2: Efecto del tratamiento trmico sobre las
protenas del lactosuero.

50 mL de Suero

50 C por 10, 20 y 30 min. 70 C por 10, 20 y 30 min. 90 C por 10, 20 y 30 min.

Centrifugar a 5000 rpm x 10 minutos

Separar sobrenadante Si cae precipitado

Leer D.O. en rango UV 280 y 260 nm

Concentracin de protena (mg/mL)

= 1.45 DO280 0.74 DO 260 (Kalckar,
1947).
V. RESULTADOS Y DISCUSIN

Tabla 1: Turbidez y pH en el sobrenadante de las protenas de leche.

pH Dilucin Absorbancia Turbidez ( 500 nm)

3 10 0,068 0,68
4,6 10 0,075 0,75
5,5 20 0,146 2,92
6 20 0,701 14,02
7 20 0,835 16,7

Figura 1: Turbidez y pH en el sobrenadante de las protenas de leche.

Tabla 2: pH y conductividad en el sobrenadante de las protenas de
leche.

pH CONDUCTIVIDAD
3 10,41
4,6 7,92
5,5 6,82
6 6,18
7 5,54

Figura 2: pH y conductividad en el sobrenadante de las protenas de

leche.
Tabla 3: Efecto del tratamiento trmico sobre las protenas del lactosuero

% de protena desnaturalizada
Tiempo Mesa A Mesa B promedio
(min.) 50C 70C 50C 70C 50C 70C
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
10 28,20 37,67 36,47 35,55 32,34 36,61
20 31,93 38,69 34,83 39,74 33,38 39,21
30 18,93 43,70 39,07 44,02 29,00 43,86

Figura 3: Efecto del tratamiento trmico sobre las protenas

del lactosuero.
-Ph y turbidez en el sobrenadante (500 nm):

De la figura 1, podemos encontrar que existe una relacin directa entre el

incremento del pH y la turbidez medida con absorbancia (500nm).

Segn Charles, 1970 la turbidez de la leche resulta principalmente de la

dispersin de la luz por las micelas de fosfocaseinato de calcio. Los glbulos
grasos dispersan igualmente la luz, pero intervienen poco en la opalescencia
blanca, ya que su dimensin es muy superior a la longitud de onda media de la
luz solar.
En la prctica la muestra evaluada corresponda en si al sobrenadante de la
leche cuando es sometida a centrifugacin, por lo cual podra deducirse que la
dispersin de la luz disminua cuando aumentaba el pH, debido a que a esos
pHs las micelas podran estar adems formando complejos con las protenas
sricas.

Es importante tambin sealar por lo expuesto que a mayor turbidez se

obtendrn mayores lecturas de densidad ptica.

Tambin Belitz y Grosch, 1997 sugieren que la medida de la densidad ptica

en leche es muy til para evaluar el aguado de (aunque menciona tambin que
este tipo de adulteracin se puede enmascarar con la adicin de sales); y la
construccin de la grfica de solubilidad de las protenas presentes en ella.

Ph y conductividad:
De la grfica 2; podemos observar que el pH y la conductividad mantienen un
alto nivel de correlacin negativa, pues a medida que aumenta el pH la
conductividad decrece.

La variacin de la conductividad de las leches est directamente relacionada

con la carga que presenten estas protenas a los diferentes pHs evaluados y de
manera indirecta a la concentracin de estos los sueros evaluados. Ante esto,
Cheftel y col, 1989 indican que a pHs prximos al punto isoelctrico (pI), las
molculas proteicas, manifiestan un mnimo de interacciones con el agua,
favoreciendo de esta manera a la formacin de agregados insolubles
(precipitan). Es decir, en las leches y sueros sometidos a los pHs evaluados se
produjo la precipitacin proteica de la leche, lo que redujo directamente e
indirectamente la carga neta de las protenas contenidas en las muestras y la
resistencia al paso de la corriente elctrica, respectivamente.

Fennema, 2000; manifiesta que la fraccin k-casena se insolubiliza en un

rango de 4.1-4.5, mientras que la -casena, - casena y lasprotenas del
suero (-lactoalbmina y -lactoglobulinas) lo hacen entre 5.1 y 5.3. Esto
explica el porque la conductividad disminuye a medida que se incrementa el
pH, pues poco a poco se van a insolubilizar las dieferentes fracciones proteicas
presentes en la leche, disminuyendo as la carga neta total.
La conductibilidad de la leche vara con la temperatura, normalmente s el mide
a 25 C. El agudo de la leche rebaja la conductibilidad y ante una acidificacin,
la conductibilidad se eleva. La medicin de la conductibilidad se utiliza
generalmente para investigar este aguado de la lache o para descubrir las
leches mastticas.

En la figura 3 que se muestra la turbidez o D.O de las protenas del suero de

leche al ser sometidas a diferentes tiempos de tratamiento trmico. La protena
del suero de leche se desnaturaliza ms a 70 C que a 50 C.

Cheftel, 1989 establece que las protenas de lactosuero son relativamente

termolbiles, sufriendo una intensa desnaturalizacin a 80 C, y que esta
desnaturalizacin se acompaa de la rotura y nueva formacin de numerosos
puentes disulfuro dando lugar a la formacin de dmeros y tetrmeros de alto
peso molecular que se precipitan (esto se conoce en la industria lctea como
la piedra de la leche). La protena responsable de este efecto es la -
lactoglobulina, pues es ms sensible que la -lactoalbmina debido a su grupo
sulfhidrilo libre, que origina la iniciacin de reacciones de intercambio disulfuro
autocatalizadas.
Sin embargo en la prctica no se pudieron hallar valores del tratamiento
trmico a 90C en las protenas del lactosuero debido a fallas en el equipo de
bao mara.
 VI. CONCLUSIONES

-El pH altera la carga neta de las protenas, haciendo que estas se comporten
como base o como cidos dependiendo del pH del medio. Estas cargas le
permiten a la protena interaccionar con el agua y de esta manera mantenerse
solubles en el medio.

-Cuando el pH del medio se aproxima al punto isoelctrico, la carga neta de la

protena es cero, y esta se precipita, lo cual es fcilmente detectable a travs
del anlisis turbidimtrico.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Belitz y Grosh. 1997. Qumica de los Alimentos. Editorial

Acribia. Zaragoza.

2. Ordoez, J. 1998.Tecnologa de los alimentos. Volumen II.

Editorial Sntesis, S. A. Espaa.

3. Fennema, O. R. 1985. Introduccin a la Ciencia de los

Alimentos. Editorial Revert. Barcelona.

4. Charles, A. 1970. Ciencia de la leche. Principios de tcnica lechera.

Editorial Continental. Mxico.

5. Cheftel, J. 1989. Protenas Alimentarias. Editorial Acribia, S. A.

Zaragoza. Espaa.