Prctica de Laboratorio 2- Bioqumica

Actividad Cataltica de la a-Amilasa y variables que la

Afectan

Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas,
siempre que sean termodinmicamente posibles: Una enzima hace que una reaccin
qumica que es energticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja
transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las
enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten
en molculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas
necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones
mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimticas. Las enzimas son un
ejemplo de que no slo es importante lo que comemos sino que adems es indispensable
una buena capacidad de absorber esos nutrientes.

OBJETIVOS

Experimentar sobre diferentes aspectos de la actividad enzimtica.

Comprender la forma como diversos factores influyen sobre la actividad cataltica de
las enzimas.
Evaluar la dependencia que puede presentar una reaccin enzimtica con respecto
a la acidez del medio y a la temperatura.

MARCO TERICO

Constituye la forma ms generalizada, aunque no la nica, de reserva energtica en

vegetales. Se almacena en forma de grnulos, y puede llegar a constituir hasta el 70%
del peso de granos (maz y trigo) o de tubrculos (patata). El anlisis minucioso de la
estructura del almidn demuestra que es una mezcla de otros dos polisacridos: la
amilosa y la amilopectina. La proporcin de ambos polisacridos vara segn la
procedencia del almidn, pero por lo general, la amilopectina es la ms abundante.
Los almidones constituyen la principal fuente de nutricin glicdica para la humanidad. El
almidn puede ser degradado por muchas enzimas. En los mamferos, estas enzimas se
llaman amilasas, y se producen sobre todo en las glndulas salivares y en el pncreas.
La amilosa es un polmero lineal formado por unidades de -D-glucopiranosa, unidas
exclusivamente por enlaces (1-4). El nmero de monmeros de la molcula depende
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de la procedencia del almidn: alrededor de 1000 en el caso de la papa y 4000 en el

caso del trigo. La amilosa se disuelve fcilmente en agua, adquiriendo una estructura
secundaria caracterstica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de la hlice
comprende 6 unidades de glucosa.
La amilopectina tiene un peso molecular mucho mayor que la amilosa y puede contener
cientos de miles o millones de monmeros de -D-glucopiranosa. Es un polmero
ramificado, en el que las cadenas principales estn formadas por mosacridos unidos
mediante enlaces glucosdicos (1-4) y donde cada rama se une a la cadena principal
mediante enlaces glucosdicos (1-6). Estas ramificaciones estn regularmente
espaciadas (cada 25-30 residuos de glucosa) y cada rama contiene nicamente uniones
(1-4) (Almidn).

Termamyl 120L es un producto enzimtico lquido que contiene -amilasa sobresaliente

termoestable expresada en y producida mediante una cepa genticamente modificada
de Bacilluslicheniformis. Se utiliza en las industrias de:

Almidn: Licuefaccin contina del almidn en cocedores a presin o en equipos

que operan a similar temperatura.
Alcohol: Adelgazamiento del almidn en los macerados de la destilacin.
Cervecera: Licuefaccin del almidn.
Azcar: Rompimiento del almidn presente en el jugo de caa.

Por lo que el contenido de almidn en el azcar crudo se reduce y la filtracin en la

refinera se facilita. La enzima es una endoamilasa que hidroliza las uniones 1,4-
glucosdicas de la amilosa y amilopectina. Por lo que el almidn se rompe rpidamente
en dextrinas solubles y oligosacridos (Termamyl 120L).

Los pasos para transformar el almidn en jarabe glucosado son dos: licuefaccin, y
sacarificacin. Durante el proceso de licuefaccin se obtienen malto dextrinas empleando
la enzima alfa amilasa. Estas malto dextrinas contienen diferentes oligosacridos y
dextrinas y es ligeramente dulce. Luego se puede continuar la conversin a glucosa
usando la enzima amiloglucosidasa conocida tambin como glucoamilasa. Esta ltima
etapa se conoce como sacarificacin, donde la amiloglucosidasa puede transformar las
malto dextrinas casi completamente en glucosa; en la prctica se produce tambin un
poco de maltosa (Cruz, 2012).
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MATERIALES

Almidn soluble.
DNS
Lugol
Soluciones Buffer 0.1 M
Citrato con pH:3.5
Fosfato con pH:6.3
Fosfato con pH:9

PROCEDIMIENTO

1. Preparar las siguientes soluciones:

25 ml de Almidn al 0.5% m/v en buffer citrato pH 3.5

25 ml de Almidn al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 9
50 ml de Almidn al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 6.3
50 ml de enzima diluida 1:150 (Preparada por el monitor)

2. Evaluacin del cambio del pH sobre la actividad de la enzima amilasa

Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2,5 mL de la solucin de almidn, de acuerdo

a la siguiente tabla:

Nmero de tubo pH
1 3,5
2 6,3
3 9
4 3,5
5 6,3
6 9

Llevar los tubos de ensayo por 3 minutos a bao de 90oC para temperar.
Agregar 0.5 mL de la enzima diluida a los tubos a los 1,2 y 3,
Agregar 0.5 mL agua destilada a los tubos a los 4,5 y 6
Agitar y dejar los 6 tubos en el bao de 90oC por 30 minutos.
Agregar 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos, para parar la reaccin.
Tomar 0,5 mL de cada uno de los tubos y agregar 30L de lugol.
Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio.
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Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores.

Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la
del DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6.

3. Evaluacin del cambio de temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa.

Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2.5ml de la solucin de almidn de pH 6.3.

Temperar cada uno de los tubos por 3 minutos as:

Nmero de tubo C
1 25
2 60
3 90
4 25
5 60
6 90

Agregar 0.5ml de la enzima diluida a los tubos 1,2, y 3.

Agregar 0.5 mL agua destilada a los tubos a los 4,5 y 6
Agitar y llevar cada tuvo nuevamente a la temperatura correspondiente por 30
minutos.
Parar la reaccin agregando 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos.
Tomar 0,5 mL cada uno de los tubos y agregar 30L de lugol.
Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio.
Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores.
Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la
del DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6.

Nota: La actividad enzimtica ser reportada como mol de azucares formados por litro
de solucin por minuto por cantidad de enzima.

Procedimiento para determinar el porcentaje de azcares reductores utilizando DNS

a. Tomar 1 ml de solucin problema.

b. Adicionar 1 ml de reactivo DNS.
c. Tapar los tubos con papel para film y ponerlos en bao a ebullicin por 5 minutos.
d. Pasar los tubos a un bao de hielo, dejarlo por 5 minutos.
e. Leer Absorbancia de todas las soluciones a 540 nm.
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Preguntas para entregar (10% del informe final):

1. Realice un diagrama de flujo con el procedimiento a realizar en el laboratorio.

2. Qu son azcares reductores?, Porqu la glucosa es un azcar reductor,
esquematice la estructura de la glucosa y su extremo reductor.
3. En qu consiste el mtodo de DNS para azucares reductores?.
4. Cuals son las condiciones ptimas para la reaccin con la enzima Termamyl
(pH, temperatura), cual es el principal producto de la reaccion de la alpha-
amilasa y el almidon? Esquematice la reaccin.