Profesores: Dr.

Enrique Mamani Zapana 3 de Noviembre de 2017

Mg. Christian Florian Carrillo
Merino Loayza, Aarom Sebastian1 16100075
1
E. A. P. Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San
Marcos
PRACTICA N10
MTODOS DE CULTIVO Y ESTUDIO MORFLOGICO DE HONGOS: AISLAMIENTO Y
MICROCULTIVO

INTRODUCCIN

Una forma de vida estudiada por la microbiologa son los hongos, estos organismos
eucariticos se caracterizan por ser osmotrficos, es decir su digestin es enzimtica. Otro aspecto
de estos organismos es el de ser no fotosintticos y poseer quitina en sus paredes celulares.

El hombre ha sabido emplear para sus beneficios los distintos hongos, uno de estos es el aprovechar
su rol de agentes biodegradables para el sustento de distintos hbitats, en el campo de la medicina
el ms popular es el uso de Penicillium sp. para la sntesis de penicilina, el cual es un potente
bactericida, lo cual ayudo a la cura de muchas enfermedades.

Para dicho aprovechamiento se desarrollaron distintas pruebas las cuales favorecen a su

identificacin y reproduccin con fines de estudio. Por ello en la experiencia realizada en laboratorio
se desarrollaron dos mtodos de cultivo: Mtodo de cultivo por puntura en agar APD y la tcnica de
Microcultivo de Ridell. En cuanto para la observacin instantnea se emple la tcnica de cinta
adhesiva con lactofenol.

MARCO TERICO

Segn Camacho (2009) tenemos que:

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente,

pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos
mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la elaboracin de
algunos alimentos, sin embargo, tambin pueden ser causantes de la descomposicin de
otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y
levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos
favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido
en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de
antibiticos, o la exposicin del alimento a la irradiacin. Por lo tanto, pueden ser un
problema potencial en alimentos lcteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias,
oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como
las mermeladas, cajetas, especias, etc.

Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas,

carbohidratos como polisacridos, cidos orgnicos, protenas y lpidos. Tambin pueden
causar problemas a travs de: sntesis de metabolitos txicos (micotoxinas), resistencia al
calor, congelamiento, antibiticos o irradiacin y habilidad para alterar sustratos no
favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. Pueden tambin causar
malos olores y sabores y la decoloracin de las superficies de alimentos.

El trmino moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos

multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer
fcilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente
todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificacin y
clasificacin de los mohos se basa en observaciones macroscpicas y microscpicas
(Frazier y Westhoff, 1994).

Hifas y micelio:
Por parte de Beuchat (2001) se entiende que los hongos microscpicos estn
formados por estructuras las cuales como el caso del talo de los mohos est formado por
una masa de filamentos ramificados, llamados hifas, llamndose micelio al conjunto de las
hifas. Las hifas pueden ser sumergidas o areas. Tambin se pueden clasificar en hifas
vegetativas o en crecimiento, las cuales se encargan de la nutricin del moho, y en hifas
frtiles o hifas que producen los rganos reproductores. Los mohos se dividen en dos
grupos: septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no
septados cenocticos, cuyas hifas estn formadas por cilindros sin tabiques transversales.
Este tipo de hifas posee ncleos diseminados a lo largo del cilindro y se les denomina
multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados rganos ayudan a
identificar a los mohos. Por ejemplo, los rizoides o anclajes de los gneros Rhizopus o
Absidia, la clula basal del gnero Aspergillus y la ramificacin dicotmica, o en forma de
Y, del gnero Geotrichum.

Figura 1: Tipos de hifas presentes en los distintos mohos.

Fuente: http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/micologia/generalidades.html
rganos o estructuras reproductoras:
Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas asexuales. Algunos
mohos tambin producen esporas sexuales. A tales hongos se les denomina perfectos,
los cuales se dividen en Oomycetes y Zygomycetes si no son septados, o bien en
Ascomycetes y Basidiomycetes si son septados, en contraposicin a los mohos
imperfectos, Fungi Imperfecti, los cuales slo poseen esporas asexuales (Frazier y
Westhoff, 1994).

Esporas asexuales:
Para Camacho (2009) los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son
pequeas, ligeras y resistentes a la desecacin. Se diseminan fcilmente por la atmsfera
para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos principales de esporas
asexuales son: conidios, artrosporas u odios y esporangiosporas. Los conidios se separan,
o crecen, en determinadas hifas frtiles denominadas conidiforos y generalmente son
libres, es decir, no se encuentran dentro de ningn receptculo, en contraposicin a las
esporangiosporas, las cuales se encuentran dentro de un esporangio o receptculo, situado
en el extremo de una hifa frtil, el esporangiforo. Las artrosporas se forman por
fragmentacin de una hifa. El extremo engrosado del esporangiforo se denomina
columnela y adopta formas tpicas en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos
mohos poseen conidios comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen
de una clula especializada, el esterigma o filide situada en el extremo del conidiforo.

Propiedades fisiolgicas:
Beuchat (2001) designa que en comparacin con la mayora de las levaduras y de
las bacterias, la mayora de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible.
Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos
frutos secos impedir o retardar mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podran
considerarse mesfilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales.
La temperatura ptima de la mayora se encuentra alrededor de los 25 a 30C, aunque
algunos son psicrtrofos y algunos son termfilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos
en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos. Casi todos los mohos son
capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5),
aunque la mayora crece mejor a pH cido. Son capaces de utilizar muchos tipos de
alimentos, que van desde sencillos a complejos. Poseen enzimas hidrolticas, y de aqu que
algunos se utilicen para la produccin industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y
lipasas.
Algunos gneros de mohos importantes en alimentos segn Hocking (2001):

Mucor: Intervienen en la alteracin de algunos alimentos y se utilizan en la fabricacin de

otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificacin del almidn, para la maduracin de quesos
y para la fabricacin de algunos alimentos orientales.

Figura 2: Observacin microscpica de Mucor sp.

Fuente: Autora propia.

Rhizopus: La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy comn e interviene en la

alteracin de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc.

Figura 3: Observacin microscpica de Rhizopus sp.

Fuente: https://atlasdemicologia.wordpress.com/2016/03/18/rhizopus-spp/

Aspergillus: Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen en
las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad para
preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la produccin industrial de cido
ctrico y glucnico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricacin de ciertos
alimentos orientales y en la obtencin de enzimas.

Figura 4: Observacin microscpica de Aspergillus sp.

Fuente: Autora propia.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIALES
- Cultivo de hongos(Mohos)
- APD (Agar Papa Dextrosa) o ASG (Agar Sabouraud Glucosado)
- Asas de siembra en ngulo recto
- Bistur
- Placas Petri con codo de vidrio estril
- Lminas portaobjetos y cubreobjetos estriles
- Trozos de algodn estril humedecidos en agua destilada o glicerol al 10%
- Azul de lactofenol
- Pinza punta fina
- Marcador
- Cinta adhesiva
PROCEDIMIENTO
a) Mtodo de la cinta adhesiva: Para este mtodo se procedi a tomar una muestra de
moho ayudados con cinta adhesiva transparente para luego pegar dicha cinta sobre una
lmina portaobjetos con unas gotas de lactofenol, finalmente, se llev al microscopio para
la identificacin de la muestra.

b) Mtodo de cultivo por puntura: Se tomo un con el asa de siembra recta previamente
flameada una pequea porcin de muestra de moho para luego inocularla por puntura en
agar APD, para luego llevarlo a incubar por 2 das. Una vez incubada la muestra se
procedi a visualizar la forma del crecimiento de las estructuras hifales a lo largo del agar.

c) Mtodo de Microcultivo de Ridell: Este mtodo se desarroll cortando un cubo de APD

de 0.5cm x 0.5cm con un bistur estril. Se coloco el cubo sobre una lmina portaobjetos
ubicada en una placa Petri. Seguido a esto se inoculo la muestra a cultivar con el uso de
un asa de siembra colocando la muestra en los cuatro vrtices superiores del cubo. Luego
se cubri con una laminilla y finalmente se agreg con cuidado un algodn estril
humedecido con glicerol. Se tapo la placa Petri y se llev a incubar por 2 das.
RESULTADOS
a) Mtodo de la cinta adhesiva: Los resultados obtenidos por el mtodo de la cinta
adhesiva fueron favorables a la observacin de distintas muestras. Una de ellas
perteneciente a la especie Mucor sp. ubicado en una fresa en descomposicin, la segunda
muestra obtenida fue de Aspergillius sp. extrado de una muestra de naranja en
descomposicin.

a) b)
Figura 5: Muestras obtenidas de Mucor sp. encontrada en fresa y Aspergillus sp.
encontrada en alimentos perecibles. Fuente: Autora propia.
 b) Mtodo de cultivo por puntura: Para el cultivo por el mtodo de puntura los resultados
salieron como se observan en la Figura 6-a donde se inoculo una muestra de Rizophus
sp. extrada de un pan con mohos de esta especie. En la Figura 6-b se muestra un cultivo
modelo presentado por el profesor de prctica.

a) b)
Figura 6: a) Resultado obtenido de la siembra pro puntura de moho extrado de naranja.
b) modelo de resultado de siembra por puntura de Rizophus sp. Fuente: Autora propia.

c) Mtodo de Microcultivo de Ridell: El Microcultivo realizado en clase dio como resultado

estructuras hifales primarias y la formacin de estructuras esporales tal y como se ve en
la Figura 7, donde (a) pertenece a una muestra de Aspergillius sp. mientras que (b)
pertenece a una muestra de Mucor sp.

a) b)
Figura 7: a) Observacin microscpica de hifas primarias de Aspergillius sp. por el mtodo
de Microcultivo e incubado por 2 das. b) Observacin microscpica de hifas primarias de
Mucor sp. por el mtodo de Microcultivo e incubado por 2 das. Fuente: Autora propia.

DISCUSIN
a) Mtodo de la cinta adhesiva: Si bien este mtodo se obtuvieron resultados favorables
este no fue en todos los casos ya que otras muestras se perjudicaron ya que este mtodo
requiere de experiencia y que en casos las estructuras de las esporas tienen a romperse
de forma que lo observado en el microscopio solo se observan esporas y muy poco de las
estructuras hifales. Por ltimo, este mtodo solo podramos utilizarlo o emplearlo para una
observacin rpida y para una identificacin preliminar de la muestra observada.

b) Mtodo de cultivo por puntura: En cuanto a este mtodo los resultados obtenidos fueron
lo suficientes para mostrar el crecimiento radial que poseen los mohos y que se pueden
ver las estructuras hifales formando los micelios de forma macroscpica.
 c) Mtodo de Microcultivo de Ridell: Los resultados obtenidos no fueron los mejores ya
que el tiempo de incubacin fue menor al que debi ser ya que el tiempo de incubacin
necesario para la observacin correcta de la muestra debi de ser de 7 das y no de 2,
dando as los resultados obtenidos mostrados en las seccin resultados del mtodo de
Microcultivo de Ridell.
CUESTIONARIO
1. Explique esquemticamente el mtodo de aislamiento por diluciones. Mencione y describa
brevemente otros mtodos de cultivo

Diluyente: Agua de triptona al 0.1%

Agar Diclorn 18% glicerol: Medio de cultivo selectivo para el recuento de hongos.
10-1 10-2 10-3

1mL 1mL 1mL

Muestra a
analizar

9mL

Diluyente

Se hacen diluciones de la muestra en diferentes tubos de ensayo con 9ml de agua de triptona. El
nmero de diluciones se realiza segn la cantidad aproximada de microorganismos que se espera
encontrar.
 10-3
10-1 10-2

10-3
10-1 10-2

Posteriormente se siembran las diluciones en placas con agar Diclorn 18% glicerol y se incuban a
22-25C durante 5 das. Se recomienda hacer dos sembrados por dilucin.

2. Qu tipo de ambientes dan condiciones para el crecimiento de mohos y por qu?

Factores fsicos
Humedad y Agua disponible (aw).
La cantidad de agua existente en el ambiente y en los sustratos es uno de los factores
importantes para el desarrollo de los hongos y para la produccin de micotoxinas. Sin
embargo, no slo influye la cantidad de agua sino tambin la forma de presentacin de la
misma, as pues, el agua se encuentra en forma libre y en forma combinada.
Temperatura
La temperatura ptima para el desarrollo de los hongos se encuentra entre 25 y 30C y el
lmite mximo entre 40 y 45C. Destacamos que la mayor parte de los hongos no crecen por
debajo de 5C y que sin embargo hay hongos como el Aspergillus flavus, Aspergillus
candidus y Aspergillus fumigatus que pueden crecer sin problemas hasta los 55C y otros
como el Penicillium expansum y el Penicillium cyclopium que son capaces de crecer a 0C.
Zonas de microflora
En un silo pueden existir pequeas zonas del alimento con alto contenido en humedad
susceptibles de desencadenar un desarrollo fngico, lo cual puede despus provocar un
aumento general de humedad en el sustrato y consecuentemente una mayor contaminacin
fngica y predisposicin para la produccin de micotoxinas.
Factores qumicos
pH
Los hongos toleran un gran intervalo de pH (2,5 - 7,5), de un modo general soportan mejor
el medio cido que el alcalino. Es de destacar que ellos mismos son capaces de alterar el
pH, utilizando como fuente de energa los cidos orgnicos
del alimento o los excretados por bacterias acidificantes que pueden aparecer durante el
periodo de deterioro del alimento.
Potencial de oxi-reduccin
La mayor parte de los hongos son aerobios y por lo tanto necesitan oxgeno para el
desarrollo de sus reacciones metablicas. Una carencia de oxgeno condiciona el
crecimiento de los hongos y la ausencia total puede llegar a producir la muerte de stos. El
anhdrido carbnico puede inhibir la formacin de algunas micotoxinas, como las
aflatoxinas.
Factores biolgicos
Presencia de invertebrados
La presencia de insectos acta como agente de diseminacin de la microflora y por lo tanto
contribuye al crecimiento y multiplicacin de los hongos. (Gimeno-Morn, 2012)

3. Qu caractersticas permiten diferenciar a los hongos de otros eucariontes?

Las paredes celulares de los hongos se crean a partir de la quitina, mientras que las
paredes celulares de las plantas estn formadas por celulosa. La mayora de las plantas
son capaces de producir su propio alimento, mientras que los hongos dependen de otras
sustancias orgnicas que les proporcionen energa.
Los hongos se reproducen de forma sexual y asexual, mediante la fragmentacin,
gemacin (asexual) y las esporas.

4. Cules son las ventajas y desventajas de la tcnica de microcultivo empleada?

Ventajas
Permite una mejor diferenciacin de las estructuras fngicas a diferencia de otros
mtodos ya que el hongo crece directamente en la laminilla a observar y no se corre
riego de daar las estructuras en el montaje.
Se selecciona previamente al hongo de inters por lo que al momento de la observacin
no hay intrusos.
Desventajas
Requiere seleccionar previamente el hongo de inters por lo que hay que aislarlo.
Requiere un poco ms de tiempo, inversin y esfuerzo en comparacin con la
observacin directa de un hongo obtenido con una cinta.

5. Qu otras tcnicas que permitan la identificacin morfolgica de hongos existen?

Tcnica de la cinta pegante
Esta tcnica es una de las ms usadas, debido a que se conserva la yuxtaposicin original de las
esporas y segmentos de las hifas. (Koneman, 1987) Adems de permitir observar las estructuras
fngicas casi sin alteracin (Arenas, 1993). Para su realizacin, se toma una tira de cinta de 4cm,
con el lado adhesivo hacia afuera, sostenindose con pinzas y presionando firmemente contra la
superficie de la colonia del hongo que se desea estudiar. Posteriormente, la tira de la cinta se coloca
en un portaobjetos con una gota de azul de lactofenol. (Arias, 2008)

Montaje por diseccin

Divo en 1990 relaciona esta tcnica al uso de una aguja de diseccin para tomar parte de la superficie
de una colonia y que luego debe ser depositada sobre una gota de azul de lactofenol. Con la ayuda
de otra aguja o de un asa microbiolgica se deber extender el preparado y se cubrir con una
laminilla; para luego ser observada al microscopio con un aumento de 40x. (Arias, 2008)

6. Por qu se utiliza el azul de lactofenol? Mencione otros colorantes de contraste.

Es una tincin simple (un slo colorante) y como tal est basada en la afinidad del colorante por
componentes de las clulas, en este caso por las estructuras fngicas. El azul de lactofenol tiene tres
caractersticas que lo hacen especial para observar dichas estructuras en los hongos del tipo moho
obtenidos en los cultivos por aislamiento.
El fenol destruye la flora acompaante (algunas veces en los cultivos, juntos a los hongos
pueden crecer colonias de bacterias)
El cido lctico conserva las estructuras fngicas al crear, por decirlo de algn modo, una
pelcula que las protege, provocado por un cambio de gradiente osmtico entre el interior y el
exterior de dicha estructura.
El azul de algodn tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los hongos
microscpicos.
BIBLIOGRAFIA

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas

para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM.
Mxico.
Frazier W. & Westhoff D. (1994) Microbiologa de los Alimentos. 4. ed. Acribia, Espaa.
23-50.
Beuchat L.R. & Cousin M.A. (2001) Yeasts and Molds. In: Compendium of Methods for
the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito
K. (Eds.) APHA. Washington. 209-215.
Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. In:
Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. &
Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 71-87.
Hocking A. (2001) Toxigenic Aspergillus Species. In: Food Microbiology. Fundamentals
and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 451-
465.
Gimeno, Alberto. Morn Velsquez, Rod. Principales factores condicionantes para el
desarrollo de los hongos y la produccin de micotoxinas. MICOTOXINAS [en lnea]
2012. Disponible en: https://www.engormix.com/micotoxinas/articulos/principales-
factores-condicionantes-desarrollo-t26065.htm
Arias Cifuentes, Edna Lorena. Pieros Espinosa, Paola Andrea. Aislamiento e
identificacin de hongos filamentosos de muestras de suelo de los pramos de guasca y
cruz verde. 2008. Bogot; Pontificia Universidad Javeriana. Disponible en:
http://javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis226.pdf