Disminucin de la resistencia a los antibiticos y prdida de plsmido en el transporte de plsmidos

cepas de Staphylococcus aureus tratadas con cido ascrbico

Se investig el efecto del cido ascrbico sobre la resistencia a antibiticos codificada por plsmido en
Staphylococcus aureus.
Varias cepas de S. aureus se cultivaron en presencia de ascorbato 1 mM durante 6 h. Este tratamiento
indujo una mayor prdida de marcadores de resistencia en 4 de 6 cepas evaluadas y electroforesis en
gel de agarosa
mostr esta desaparicin del ADN plasmdico en colonias susceptibles inducidas por ascorbato. La
presencia de
el ascorbato indujo una disminucin del 50-75% en concentraciones inhibitorias mnimas de diferentes
antibiticos para resistencia
son. Cuando se agrega ascorbato, anteriormente concentraciones subinhibitorias de penicilina o
tetraciclina
tienen un mayor efecto inhibitorio sobre las cepas resistentes e incluso indujeron la muerte del 25-93%
de la prueba inicial
poblacin. Estos resultados sugieren que el ascorbato puede inducir la prdida de varios plsmidos de
S. aureus, y que
los niveles de resistencia a los antibiticos tambin se ven afectados por la presencia de este
compuesto.

Se ha descubierto que el cido L-ascrbico (vitamina C) es

capaz de modificar las propiedades del ADN
(McCarty, 1945). El ascorbato puede inactivar varios
fagos por induccin de roturas monocatenarias en su
ADN (Murata y Kitagawa, 1973; Murata et al.,
1971, 1986), y puede inducir mltiples rupturas en el
cromosomas de mutantes deficientes en reparacin de
Escherichia coli (Van Sluys et al., 1986a).
Este efecto se atribuy inicialmente a la generacin de
perxido de hidrgeno (H2O2) y / o hidroxilo libre
radicales (HO -), pero esto no parece estar claro.
E. coli xthA, un mutante H202-hipersensible
(Demple et al., 1983), no es sensible al ascorbato
tratamiento (Van Sluys et al., 1986b). Una secuencia especfica
rotura despus del tratamiento con ascorbato,
poco probable que sea generado al azar por oxgeno
radicales, se ha observado en el ADN del fago
(Kobayashi et al., 1988).

La mayora de las pruebas in vivo no detectan mutagnicos o carcinognicos actividad

para el cido ascrbico (Douglas et al., 1984; Norkus et al., 1983).
Parece que el ascorbato solo puede daar el ADN pequeo y sin proteccin
molculas, especialmente circulares cerradas covalentemente
formularios (cccDNA) que dependen para su eficiencia
replicacin y transcripcin en el mantenimiento
de su estado superenrollado.
Este laboratorio ha informado previamente
eliminacin de plsmidos de penicilinasa de S. aureus
despus de un tratamiento de 6 h con ascorbato 1 mM
(Amfibile-Cuevas, 1988). La posibilidad de que
eliminacin de determinantes de resistencia bacteriana
podra ser de alguna ayuda para controlar la incidencia
de resistencia extracromosmica a los medicamentos, como ha sido
sugerido (Bouanchaud y Chabbert, 1971;
Hahn, 1976), nos ha inducido a examinar el rango
de esta prdida de resistencia causada por el cido ascrbico.
Hemos probado los efectos de este compuesto sobre
varias cepas resistentes a plsmidos de S.
aureus, incluidos aislados clnicos y laboratoriosconstruidos
cepas, resistencia a diferentes antibiticos,
y en el caso de plsmidos de penicilinasa,
diferentes 'familias' de elementos extracromosmicos
(Shalita y otros, 1980). Creemos que un agente
capaz de eliminar los plsmidos de resistencia podra ser
til en la terapia de enfermedades infecciosas con
etiologa multirresistente, si se administran juntos
con un antibitico comn. Para determinar si
un organismo resistente a los antibiticos puede ser inhibido por
la presencia de cido ascrbico y un antimicrobiano
droga, hemos expuesto estas cepas resistentes a la
accin conjunta de ascorbato y antibiticos. A pesar de que
el ascorbato no puede inducir la prdida del plsmido en todas las cepas evaluadas, encontramos un
aumento en la inhibicin
accin de antibiticos en cepas resistentes
cuando el ascorbato est presente.
Materiales y mtodos
Cepas y productos qumicos
Las cepas de S. aureus utilizadas se enumeran en la Tabla
1. Se cultivaron cultivos lquidos en Brain Heart Infusion
caldo (BHI) y slidos en Muller-Hinton
agar (ambos de Difco). cido L-Ascrbico (Sigma)
fue utilizado como la sal de sodio, ajustando 100 mM
soluciones madre a un pH de 7.2 por adicin de
NaHCO3. Amikacina, penicilina, espectinomicina,
tetraciclina y tobramicina se obtuvieron de
Laboratorios Bristol de M6xico, Farmac6uticos
Lakeside, Upjohn, Rorer de M6xico y Upjohn,
respectivamente.
Determinacin de prdida de plsmido
El tratamiento con ascorbato se realiz de la siguiente manera:
pequeos inculos (106 clulas / ml) de cada cepa fueron
cultivado en BHI con o sin ascorbato 1 mM, para
6 horas a 37 C con burbujeo de aire constante. Muestras de
estos cultivos fueron estriados en placas de agar para obtener
colonias aisladas. Los plsmidos fueron calificados por el
presencia o ausencia de sus marcadores de resistencia como
determinado por mondadientes a selectivo y no selectivo
medios de comunicacin. Las concentraciones selectivas fueron: 50
t ~ g / ml de amikacina, espectinomicina y tobramicina,
utilizado por separado para cepas DIM; 50 / ~ g / ml
tetraciclina, para la cepa RN2424; Penicilina 0.1 # g / ml
para las cepas RN11 y RN794. La prdida de plsmido fue
confirmado por seleccin electrofortica de agarosa de
ADN extracromosmico, realizado por el
mtodo de Nahaie et al. (1984) usando 0,8% de agarosa
geles en una losa horizontal.
Concentraciones inhibitorias mnimas
Determinaciones de CIM en presencia o
la ausencia de cido ascrbico fue hecha por la tubedilucin
tcnica, en BHI con o sin 1 mM
ascorbate Se hicieron determinaciones preliminares
duplicando las diluciones de los antibiticos, y luego
los rangos de actividad se dividieron con incrementos de 10- # g.
Las concentraciones probadas fueron: 40-100
# g / ml de tetraciclina y 40-250 ~ g / ml de penicilina.
Los tubos se incubaron a 37 C durante 12 h, y el crecimiento
la inhibicin fue confirmada 'por turbidimtrico
medicin a 620 nm en un colormetro Corning 252.
Culturas con antibiticos y ~ o ascorbato
El efecto del tratamiento simultneo con ascorbato
y concentraciones subinhibitorias de antibiticos
fue determinado por el crecimiento de las clulas en
BHI que contiene ascorbato 1 mM y 50 ng / ml
tetraciclina para la cepa RN2424, penicilina 40 ng / ml
para la cepa RN794, y 15 / ~ / ml para la cepa RNII.
Los cultivos se incubaron a 37 C con aire constante
burbujeando Se formaron unidades formadoras de colonias (ufc / ml)
determinado al diluir las clulas de manera apropiada, chaparlas e incubar a 37 C durante 18 h, y
luego
contando colonias.
Seleccin electrofortica de ADN plsmido de resistencia (R) y colonias susceptibles (S) inducidas por
ascorbato cepas DIM152, DIM162, DIM260 y RN1 I (RN794). Migracin de los marcadores de cccDNA
en el indicado a la derecha.

Prdida de plsmidos de resistencia debido a ascorbato El ascorbato aument la

aparicin de resistencia prdida en cepas resistentes a aminoglucsidos, y en una de las
cepas resistentes a la penicilina, pi258 (pluma r) y pT 181 (tet r) no pueden eliminarse por
tratamiento con Ascorbato 1 mM. Una comparacin de espontnea y la prdida de
marcadores de resistencia inducida por ascorbato es se muestra en la Tabla 2. La suma
de los resultados de 3 experimentos simultneos se muestran; estos valores son tpicos
para 4 series de experimentos independientes. La desaparicin del ADN plasmdico en la
electroforesis deteccin de lisados crudos de ascorbato inducido colonias susceptibles a
las drogas confirma que el prdida de marcadores de resistencia es el resultado de la
eliminacin de plsmidos de resistencia (Fig. 1). 10-20 colonias susceptibles de cada
experimento y cada cepa se analizaron y todos muestran la prdida de bandas de
plsmidos.
Reduccin de CIM por la presencia de ascorbato La adicin de ascorbato 1 mM reduce la
CIM de la penicilina en 52 70 para la cepa RN11, y por 75% para RN794. La CIM de
tetraciclina se redujo en 50% para RN2424. Los valores en la Tabla 3 son de un
experimento tpico, pero se han reproducido en al menos 3 experimentos independientes.
Inhibicin del crecimiento y muerte celular por antibiticos si Ascorbate est presente El
ascorbato 1 mM no modific por s mismo el crecimiento de las cepas RNll, RN794 y
RN2424. Pero el asociacin de ascorbato y concentraciones subinhibitorias de antibiticos
puede inhibir el crecimiento de poblaciones bacterianas, e incluso inducen la muerte de
25, 93 y 89o70 del inculo inicial de RNII, RN794 y RN2424 respectivamente, mientras
que los antibiticos ellos mismos solo inducen un retraso de tiempo (Figuras 2-4).
Discusion

El cido L-ascrbico est involucrado en una amplia gama de actividades biolgicas,

especialmente contra cidos nucleicos (Shamberger, 1984). Los resultados actuales
sugieren que una variedad de plsmidos de S. aureus son sensibles a el efecto de
"curado" del ascorbato, que era previamente informado por este laboratorio (Amfibile-
Cuevas, 1988). 4 de las 6 cepas probadas mostraron una prdida del fenotipo resistente
cuando se trata con ascorbato que se puede atribuir a la eliminacin del plsmido
codificante, como puede demostrarse mediante electroforesis cribado. En el caso de
RN2424, 1 Ascorbato mM no indujo la prdida de resistencia desde cualquier celda. Esto
podra ser la consecuencia de la alto nmero de copias del plsmido pT181 (20-25), por lo
que no debe descartar la posibilidad de que el ascorbato podra inducir la prdida de
algunas de las copias, pero no de todo.
El efecto bactericida de la asociacin de
ascorbato y antibitico en cepas resistentes, que
se puede observar en las determinaciones de CMI como
as como en las curvas de crecimiento, podra ser la consecuencia
de una variedad de eventos posibles: (a) el
reduccin en el nmero de plsmidos dentro del
poblacin bacteriana; (b) la inhibicin de la expresin
de determinantes resistentes por interferencia
con la transcripcin del plsmido o por dao a
ADN de plsmido (por ejemplo, la conversin de cccDNA a
ocDNA, previamente informado como un efecto del ascorbato
en ADN circular (Morgan et al., 1976)); o (c)
un efecto sinrgico del ascorbato, que simplemente
Potencia la actividad antimicrobiana de las drogas.
Creemos que la ltima posibilidad es poco probable, considerando
que los 2 antibiticos involucrados, la penicilina y
tetraciclina, tienen objetivos celulares muy diferentes y
mecanismos de accin. Adems, el efecto de
el ascorbato difiere en magnitud en diferentes RN
cepas que difieren solo en sus plsmidos de resistencia.
Por lo tanto, parece que el ascorbato est actuando
a travs del plsmido y no en la clula husped.
Adems, las CIM para el husped sin plsmidos
no cambia debido a la presencia de ascorbato
(no mostrada).
Sin embargo, la prdida de plsmidos (Tabla 2) no
parece correlacionarse con el efecto de la asociacin
de ascorbato y antibiticos, especialmente para
cepa RN2424. El ascorbato no elimin el
plsmidos de cualquier clula, pero redujeron la
MIC de tetraciclina hasta 50 7o y puede inducir la muerte del 89% de una poblacin original expuesta
a una
concentracin subinhibitoria del antibitico. Esta
podra ser el resultado de una reduccin en el plsmido
nmero de copia porque hay una dosis de gen
dependencia de la resistencia para este plsmido (Carleton
et al., 1984; Thomas, 1986). Aunque no hay
evidencia de que la resistencia a la penicilina tiene el mismo
comportamiento, este o mecanismos similares pueden ser propuestos,
junto con una interferencia con la expresin
de genes plasmdicos, como se mencion anteriormente.
Ninguno de estos resultados da ninguna indicacin sobre
el mecanismo de accin del ascorbato en los plsmidos.
Pero parece poco probable que esto pueda ser el resultado de
la generacin extracelular de radicales libres que
ingrese a la celda y dae el ADN u otras estructuras
implicado en la replicacin o estabilidad del plsmido. Gratis
radicales, si los hubiera, deberan generarse muy cerca de
ADN, tal vez incluso de un complejo ADN-ascorbato,
como se ha informado anteriormente (Jamaluddin)
et al., 1981). Dao en el ADN inducido por el ascorbato
parece tener 2 intermedios diferentes: (a)
perxido de hidrgeno, producido durante el ascorbate
autooxidacin, que genera radicales hidroxilo,
la especie radical ms reactiva involucrada en el
dao por ascorbato de ADN del fago in vitro
(Morgan et al., 1976, Murata et al., 1986) y E.
cromosoma coli in vivo (Van Sluys et al., 1986a);
y (b) otros productos de oxidacin de ascorbato,
probablemente radicales peroxi o alcoxilo de ascorbato,
que puede estar involucrado en la secuencia especfica
dao del ADN del fago, diferente del uniforme
escisin causada por HO- (Kobayashi et al., 1988).
La catalasa o tiourea extracelular evita la matanza
de uvrArecA mutantes de E. coli por ascorbato,
sugiriendo la participacin de H202 y HO "
(Van Sluys y otros, 1986a). Pero el concomitante
Rotura de un solo filamento de ADN inducida por el tratamiento
con ascorbato, que puede ser, al menos en parte,
responsable de la muerte celular, no puede ser causado por
H202 o sus productos, ya que el mutante xthA, que
es hipersensible al perxido de hidrgeno, no es sensible
para ascorbate / tratamiento de cobre (Van Sluys et al.
al., 1986b). ngr-374 mutantes de S. aureus (Tam y
Pattee, 1986), que tambin son hipersensibles a
H202, no son sensibles al ascorbato (Am ~ ibile-
Cuevas, resultados no publicados).
Adems, H202 en s mismo no indujo la prdida del plsmido en ninguno de los S.
cepas aureus utilizadas en este trabajo (Amfibile-Cuevas,
resultados no publicados). Estos resultados sugieren que
H202 no est involucrado como intermediario directo en
Dao al ADN o prdida de plsmido por cido ascrbico en
S. aureus.
Tambin existe la posibilidad de que los productos genotxicos
de la peroxidacin lipdica de los componentes de la membrana
puede actuar como intermedios reactivos de la
eliminacin de plsmidos mediante tratamiento con ascorbato, como
propuesto para la mutagnesis por radiacin (Petkau,
1980). Ascorbate puede promover extensos lpidos
peroxidacin en algunas preparaciones biolgicas, tales
como ensayos in vitro de enzimas de membrana (Schaefer
et al., 1975), o ensayos de unin de neurotransmisores
a los receptores de membrana (Heikkila, 1984). Interaccin
de ascorbato con membranas tambin puede
dar como resultado la distorsin de la arquitectura de la membrana,
ya sea como consecuencia de la peroxidacin de lpidos, o por
otros mecanismos que no involucran radicales libres
generacin o peroxidacin (Matsuda et al., 1990).
Otros compuestos de accin de membranas, como SDS
(Sonstein y Baldwin, 1972) y fenotiazinas
y la imipramina (Molnfir et al., 1982) tambin son
capaz de eliminar los plsmidos bacterianos. Sin embargo,
plsmidos pi258 y pT181, que pueden ser
eliminado por protoplast formacin-regeneracin
(Novick et al., 1980), no son susceptibles de ascotbate.
Inestabilidad del plsmido durante la regeneracin de protoplastos
se ha atribuido a la participacin de la
envoltura celular en el mantenimiento del plsmido (Novick et al.
al., 1980; Gruss y Novick, 1986). por lo tanto, nosotros
inicialmente se espera que estos plsmidos sean
eliminado por el tratamiento con ascorbato, si el cido ascrbico
altera la membrana celular; Este no es el caso. Promover
el trabajo es necesario para determinar el mecanismo por
que acta el cido ascrbico.