Qumica Biolgica I T.P.

Cromatografa en columna: filtracin molecular

Trabajo Prctico 11: Cromatografa en columna: filtracin molecular

OBJETIVO:
-Demostrar la aplicacin de una columna de cromatografa como mtodo de separacin.
-Separar los componentes de una mezcla mediante una columna de tamiz molecular.
-Verificar la separacin de los compuestos.

FUNDAMENTO
Las protenas, debido a su alto peso molecular, no pueden ser separadas por cromatografa de
particin, ya que no son arrastradas por el solvente. En tales casos se utiliza la cromatografa
en columna, en la que una solucin de una mezcla de protenas se pasa por una columna
formada por un material slido y poroso (denominado matriz), con el cual las protenas
interaccionan de diferentes maneras y pueden ser separadas segn sean o no retardadas en su
pasaje (Fig. I). Las matrices de las columnas estn diseadas de manera de interactuar con la
carga de las protenas (cromatografa de intercambio inico) o con los aminocidos expuestos
en su superficie (cromatografa de interaccin hidrofbica), o pueden llevar unida alguna
molcula que, a su vez, interacciona especficamente con la protena que se quiere retener
(cromatografa de afinidad).
La cromatografa de exclusin molecular es diferente de las anteriores, pues conduce al
fraccionamiento de las protenas segn su tamao. Para ello, la matriz est formada por
pequeas esferas porosas que permiten la entrada de protenas de un cierto tamao, que son
retardadas, mientras las molculas mayores pasan o eluyen ms rpido (Fig. II).
La salida de las protenas de una columna cromatogrfica se detecta normalmente por
absorcin de la luz a una longitud de onda de 280 nm. Debido a la composicin de sus
aminocidos, las protenas absorben esta luz y, utilizando un espectrofotmetro, se puede
detectar la elucin de las protenas en la cromatografa. Los datos se registran en lo que se
denomina diagrama de elucin e indican la posicin de las protenas que se han separado.
Despus pueden realizarse estudios de actividad biolgica, enzimtica, etc. de las protenas
fraccionadas.
La cromatografa de filtracin en gel, permeacin en gel, columna de filtracin molecular o
cromatografa de exclusin es una tcnica ampliamente utilizada para separacin de molculas
de acuerdo al tamao molecular.
Las sustancias de la muestra se mueven a distintas velocidades en la columna y son eludas
como bandas separadas. La columna tiene un gel de polmero entrecruzado con poros de

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tamao seleccionado. Las molculas mayores son eludas ms fcilmente que las menores por
ser demasiado grandes para penetrar en los poros del gel as pueden recorrer un camino ms
directo a travs de la columna.
Las molculas menores pueden penetrar en los poros y de esa manera se equilibran
rpidamente entre la fase mvil, compuesta de lquido intersticial y la fase estacionaria
constituida por el agua del interior del gel. Como hay dos veces mayor cantidad de agua en el
espacio intersticial, las molculas pequeas gastan un tercio de tiempo en el agua intersticial y
2/3 dentro de las partculas del gel, siendo eludas despus.
Las molculas de tamao intermedio pueden penetrar solamente en la parte del agua del gel y
as ser separadas las molculas mayores y menores.
Cuando la columna es calibrada con molculas de masa molecular conocida, puede utilizarse
para conocer la masa molecular de una sustancia en anlisis.

Figura I Figura II

Separacin de protenas por cromatografa en Separacin de protenas segn su tamao

columna. La muestra se aplica en la superficie
de una columna de vidrio o plstico llena con
una matriz permeable inmersa en el solvente
elegido. Luego, el solvente se hace pasar
lentamente por la columna y es recogido en
tubos separados. La elucin de las protenas se
registra por su capacidad de absorber luz en
una longitud de onda de 280NM. Abajo:
Diagrama de elucin de protenas fraccionadas.
molecular. La mezcla de protenas en
solucin se pasa por una columna
compuesta por esferas de un polmero
slido (en general dextrano), que permite
la entrada de pequeas molculas; las de
mayor tamao no penetran en la matriz y
eluyen con mayor rapidez. Abajo:
Diagrama de elucin de las protenas
fraccionadas.

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PARTE EXPERIMENTAL

Muestra a sembrar: mezclar 200 ul de Blue-Dextrn (1 mg/ml) y 200 ul de Hemoglobina

bovina (1 mg/ml)
Volumen a sembrar: 0,4 ml
Fase estacionaria: Sephadex G-100 (rango de fraccionamiento de 4.000 a 100.000 Daltons
Altura del gel en la columna: 12 cm
Fase mvil: agua destilada
Recoleccin del eluato: fracciones de 1 ml por tubo desde el instante en que se siembra la
muestra en el gel.
El anlisis de las fracciones obtenidas se realiza en forma visual, ya que ambas sustancias son
coloreadas, y por lectura de su absorbancia a 280 nm para el caso de la protena.
Confeccionar el diagrama de elucin de la hemoglobina.

Masa molecular de Blue-Dextrn: mayor a 500.000 Daltons

Masa molecular de Hemoglobina: aproximadamente 60.000 Daltons