INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Fisiologa y Bioqumica Microbiana

Prctica 3.
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE SUCCINATO
DESHIDROGENASA DE Escherichia coli.

Alumnas:
Camargo Vega Mara Fernanda
Garca Martnez Diana Karla
Prez Bautista Maryjose
Snchez Villegas Laura Alejandra

Grupo: 6QV1 Seccin: I Equipo: 3

Profesoras:
Daz Silva Fabiola Karina
Rodrguez Olvera Alma Mara

Contenido Valor Calificacin

Hiptesis 1%

Objetivos 1%

Resultados finales y descripcin 1%

Discusin de resultados 4%

Conclusiones 2%

Bibliografa 1%

TOTAL

Fecha de entrega: 17 de Octubre del 2017

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HIPTESIS

S el mecanismo para que Escherichia coli incorpore succinato a su metabolismo requiere

una fase de adaptacin de mayor tiempo, presentara crecimiento en el medio con succinato
pero de manera ms lenta en comparacin con las clulas crecidas en glucosa.

Si se mide la actividad enzimtica de la succinato deshidrogenasa por el mtodo de Ells ,

entonces Escherichia coli tiene la capacidad de utilizar una cadena transportadora de
electrones artificial.

OBJETIVO GENERAL

Con base a una serie de datos experimentales sobre crecimiento y actividad

enzimtica obtenidos bajo diferentes condiciones de cultivo determinar el papel
fisiolgico de la enzima Succinato Deshidrogenasa en Escherichia coli

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Evaluar dos fuentes de carbono (Glucosa y Succinato) y la influencia que tienen

sobre el crecimiento de Escherichia coli
Estudiar la induccin de la sntesis de la enzima Succinato Deshidrogenasa en
presencia de Succinato como fuente de carbono
Determinar el papel antagnico de la glucosa en la sntesis de la enzima Succinato
Deshidrogenasa al ser empleada como fuente de carbono
Poner en evidencia, la importancia de la enzima Succinato deshidrogenasa en la
cadena de transporte de electrones.

RESULTADOS

Tabla 1 Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli

Cultivos previos en: Matraces con medio base +: Crecimiento (Absorbencia a 600 nm)

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Inicial Final

1 Succinato 0.148 0.627

Succinato
2 Glucosa 0.40 0.946

3 Succinato 0.103 0.525

Glucosa
4 Glucosa 0.113 0.814

1.6

1.4

1.2

1
A final
0.8
A

A inicial
0.6

0.4

0.2

0
S-S S-G G-S G-G

Figura 1. Efecto de la fuente de carbono en Escherichia coli.

Se presentan datos de absorbancia, segn las diferentes condiciones de cultivo, donde:
S-S: Cosecha en el medio Sypher y Strauss. Fuente de carbono: Succinato 0.5% Incubacin:12 hrs, 37C. (A inicial) Segunda
adicin de fuente de carbono: Succinato al 0.5 % Incubacin: 5 horas, 37C (A final)
S-G: Cosecha en el medio Sypher y Strauss. Fuente de carbono: Succinato 0.5% Incubacin:12 hrs, 37C. (A inicial) Segunda
adicin de fuente de carbono: Glucosa 1.0 % Incubacin: 5 horas, 37C (A final)
G-S: Cosecha en el medio Sypher y Strauss. Fuente de carbono: Glucosa 1.0% Incubacin: 12 hrs, 37C. (A inicial) Segunda
adicin de fuente de carbono: Succinato al 0.5 % Incubacin: 5 horas, 37C (A final)
G-G: Cosecha en el medio Sypher y Strauss. Fuente de carbono: Glucosa 1.0% Incubacin: 12 hrs, 37C. (A inicial) Segunda
adicin de fuente de carbono: Glucosa 1.0% Incubacin: 5 horas, 37C (A final)

Tabla 2. Efecto de carbono en la actividad de Succinato deshidrogenasa

Tiempo (seg) %T 600 nm de las suspensiones celulares crecidas en las fuentes de carbono:

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Succinato-Succinato Succinato- Glucosa-Succinato Glucosa-Glucosa

Glucosa

0 0.0 0.0 0.0 0.0

30 0.4 0.6 4.0 0.1

60 1.8 0.9 5.1 0.4

90 1.7 0.7 3.6 0.3

120 1.5 0.6 2.4 0.3

150 1.5 0.4 3.0 0.2

180 1.5 0.4 2.5 0.2

210 1.0 0.3 2.2 0.2

240 0.5 0.2 2.2 0.1

270 3.1 0.2 1.8 0.1

300 1.2 0.2 1.3 0.1

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S-S
%T

3
S-G
G-S
2
G-G

0
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo (segundos)

Figura 2. Efecto de carbono en la actividad de Succinato deshidrogenasa

Se presentan los datos de %T a 600 nm con respecto al tiempo (segundos) en las diferentes
condiciones de cultivo. Se observa que las condiciones de cultivo Glucosa-Glucosa (G-G) y Succinato-
Glucosa (S-G) presentan los valores de %T ms pequeos, seguidos de la condicin de cultivo
Succinato-Succinato (S-S) Siendo Glucosa-Succinato (G-S) la serie con los valores de %T ms altos.

DISCUSIN

En primera instancia es importante destacar el crecimiento del microorganismo de experimentacin;

Escherichia coli, pues controlando las condiciones de su crecimiento empleando un medio con caldo
nutrivo (Sypher y Strauss) y una fuente de carbono especifica (Succinato o Glucosa) se obtuvieron
los resultados representados en la tabla 1 en donde destaca una absorbancia mayor inicial en el
medio de succinato y una absorbancia mayor final en el medio de succinato resuspendido en glucosa
al 1%.

La succinato deshidrogenasa es un enzima que participa en el ciclo de Krebs para la conversin de

succinato a fumarato, es una enzima clasificada dentro del grupo de las oxidorreductasas.

Escherichia coli es el microorganismo que llevo a cabo esta cadena

artificial de transporte de electrones, se aade a una celda de
espectrofotmetro al igual que el succinato de sodio como sustrato que
la enzima oxidar, el compuesto metosulfato de fenazina actuar como
acarreador para garantizar que los electrones sean captados por el
aceptor artificial de electrones, el 2,6 diclorofenol indofenol.

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En la determinacin de la actividad de la enzima succinato

deshidrogenasa ninguno de los componentes clave puede medir
directamente la reaccin Succinato Fumarato por lo tanto esta se
midi mediante la reduccin de un aceptor de electrones artificial que
fue el 2,6-diclorofenol indofenol, un indicador de reaccin de xido
reduccin en donde oxidado es de color azul e incoloro reducido.

El KCN bloquea la trayectoria normal de electrones a travs de la cadena de

transporte de electrones mitocondrial, inhibiendo la transferencia de
electrones del citocromo a, al aceptor final de electrones que es el oxigeno de
manera normal

Efecto de la fuente de carbono en la actividad de succinato deshidrogenasa.

El mtodo de Ells es un mtodo desarrollado para el ensayo de la succinato deshidrogenasa

y la deshidrogenasa lctica, basado en la observacin de que el metasulfato de fenazina
puede transferir un par de electrones entre los nucletidos de pirimidina reducidos y el 2,6-
Diclorofenol indiofenol. Este es el primer mtodo espectrofotomtrico desarrollado para ser
aplicado en el ensayo de succinil deshidrogenasa soluble. La oxidacin del succinato
catalizada por Succinato deshidrogenasa,genera electrones que reducen al compuesto
metosulfato de fenazina (PMS), que posteriormente reducir al 2,6 diclorofenolindofenol
(DCIP). La adicin de metasulfato de fenazina a un sistema que contiene succinato,
diclorofenolindofenol y succinil deshidrogenasa soluble, causa una rpida reduccin del
colorante indofenol, en el cual la tasa de reduccin es proporcional a la cantidad de enzima
agregada.

Cianuro De Potasio. (KCN)

La funcin del cianuro de potasio en el desarrollo experimental, consisti en bloquear la

enzima terminal de la cadena respiratoria, asegurando la transferencia de electrones hacia
el metasulfato de fenazina reducindolo.

Efecto de la fuente de Carbono.

Para poder observar el efecto de la fuente de carbono en la actividad enzimtica de la

Succinatodeshidrogenasa fue necesario inducir en E. coli la formacin de una cadena
respiratoria artificial donde el aceptor de electrones es el 2,6 diclorofenolindofenol el cual
sustituye al cit ,3, ya que este se encuentra inhibido por KCN, sin embargo el 2,6
diclorofenolindofenol no acepta los electrones por s solo sino que es el metosulfonato de

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fenazina el que acepta los electrones de la reaccin de lasuccinato deshidrogenasa y

posteriormente los lleva al 2,6 diclorofenolindofenol el cual pasa de un color azul (oxidado)
a incoloro (reducido).

Para los ensayos de acuerdo a la bibliografa, se reporta que la actividad de la succinato

deshidrogenasa se ve reprimida cuando E. coli es crecida en un medio que contiene
glucosa, pero adems esta enzima incrementa su actividad cuando en el medio de cultivo
existe succinato como la principal fuente de carbono. Si succinato deshidrogenasa es una
enzima reprimible, se debe tener una clara disminucin en la actividad de la enzima para
el crecimiento en glucosa glucosa y un aumento en el porciento de
transmitancia(cuantificacin de la actividad) para el ensayo de succinato succinato.

CONCLUSIONES

E. coli presenta un buen crecimiento en un medio de glucosa-glucosa comprado

con el crecimiento en succinato-succinato.

El crecimiento de E. coli disminuye con la presencia de succinato como principal

fuente carbono y aumenta si la fuente de carbono es glucosa.

REFERENCIAS

1. Alvarado & et.al. (2008). BIOQUIMICA II. Consultado en:

http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.com.mx/media/users/10/523320/files/51871/
Ma. [15/Octubre 2017]
2. BRENDA. (2015). Informacin sobre EC 1.3.99.1 - Succinato deshidrogenasa.
Consultado en: http://www.brenda-
enzymes.org/enzyme.php?ecno=1.3.99.1&Suchword=succinato+deshidrogenasa&o
rganism%5B%5D=#INHIBITORS [16/Octubre/2017]
3. J. Rufz Herrera y L. G. Garca. Marzo 1972. Regulation of succinate dehydrogenase
in Escherichia coli.Departamento de microbiologa, Escuela nacional de ciencias
biolgicas,instituto politcnico nacional, Mxico 17, CDMX.

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