UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

LABORATORIO DE BIOQUMICA
Profesora: Luz Mery Buitrago A.
Prctica de laboratorio

ENZIMAS PROTEOLITICAS

INTRODUCCIN

Las enzimas proteolticas rompen enlaces peptdicos, algunas de estas se encuentran en el

tubo digestivo que transforman progresivamente las protenas en pptidos y stos en
aminocidos.

La papana es una mezcla de proteasas que se han aislado como cristales y pueden separarse
en dos fracciones: papana propiamente dicha y quimiopapana. La papana hidroliza protenas
amidas y steres de aminocidos: su accin enzimtica est relacionada con la presencia de
grupos sulfidrilo (-SH) de la cistena en el centro activo.

Estas enzimas se sintetizan en forma activa, pero en algunos casos se pueden inhibir, de tal
forma que para obtener una actividad mxima necesitan de agentes alquilantes como el EDTA
o de sustancias reductoras como el cido sulfrico.

Al igual que otras proteasas, estas enzimas son activas en un rango de pH que oscila entre 3-
9. El valor de pH ptimo vara segn el sustrato que va a hidrolizarse; la temperatura tambin
est relacionada con el tipo de sustrato y se puede manejar entre 40 a 65 C

Los grupos sulfidrilo de la enzima se pueden inhibir por agentes oxidantes, tal es el caso del
perxido de hidrgeno (H2O2), agentes alquilantes y por metales pesados como el mercurio:
estos inhibidores convierten a los grupos sulfidrilo en disulfuros inactivos. El proceso es
reversible cuando se trata con agentes reductores, ejemplo; glutatin.

Por su actividad proteoltica la papana se emplea en la industria de alimentos, en la produccin

de concentrados, en medicina para controlar problemas digestivos y en la industria para el
tratamiento de textiles, de cueros, etc.

En esta prctica, se emplea la prueba de coagulacin de la leche para evidenciar la actividad

proteoltica de la papana extrada de la papaya; se prueba adems la que contienen algunos
ablandadores comerciales.

ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LAS ENZIMAS

Las enzimas son protenas globulares complejas de gran tamao, formadas por una o ms
cadenas polipeptdicas. Estn plegadas un surco o bolsillo en el que encajan la molcula o las
molculas reactivas (el sustrato) y donde tiene lugar las reacciones. Esta regin de la enzima
se conoce como sitio activo, el cual no slo tiene una configuracin tridimensional
complementaria a la del sustrato, sino tambin tiene una distribucin complementaria de
cargas y de zonas hidroflicas o hidrofbicas sobre la superficie de unin. Si una regin
particular del sustrato tiene una carga negativa, es probable que el sitio activo tenga una carga
positiva en la zona correspondiente. De tal modo el sitio activo no solamente reconoce y
confina a la molcula de sustrato, sino que tambin la orienta en una direccin particular.
ENERGA DE ACTIVACIN Y CATLISIS

Las reacciones qumicas en nuestras clulas no ocurren espontneamente. Si as fuera, el

metabolismo sera catico. En lugar de ello, muchas reacciones en la clula son controladas
por protenas llamadas enzimas. El nombre de enzima, propuesto en 1867 por el fisilogo
alemn Wilhelm Kuhne (1837-1900), deriva de la frase griega en zyme que significa en
fermento.

La mayora de las reacciones qumicas requieren un ingreso inicial de energa para comenzar y
desarrollarse a un ritmo razonable. La energa aadida incrementa la energa cintica de las
molculas, permitiendo que un mayor nmero de ellas adquiera la fuerza suficiente no slo
para superar su repulsin mutua, sino tambin para romper los enlaces qumicos existentes en
su interior. La energa que deben poseer las molculas para iniciar una reaccin se conoce
como energa de activacin. En el laboratorio, la energa de activacin se obtiene a menudo
como calor. Pero en una clula ocurren muchas reacciones diferentes al mismo tiempo y el
calor las afectara a todas indiscriminadamente. Adems, el calor rompera puentes de
hidrgeno y producira en la clula otros efectos generalmente destructivos. Las clulas evitan
este problema utilizando enzimas, que son protenas globulares especializadas para actuar
como catalizadores.

Un catalizador es una sustancia que disminuye la energa de activacin necesaria para una
reaccin formando una asociacin pasajera con las molculas que reaccionan (Figura 1). Esta
asociacin temporal acerca a las molculas que reaccionan y tambin pueden debilitar los
enlaces qumicos existentes, facilitando la formacin de otros nuevos. La disminucin en la
energa de activacin debida a la accin del catalizador es similar a la cantidad de energa que
posee la mayora de las molculas que intervienen en una reaccin qumica. Como resultado,
la reaccin ocurre ms rpidamente en presencia de un catalizador. El catalizador mismo no
sufre ninguna alteracin permanente en el proceso y se puede volver a utilizar repetidamente.

En la actualidad se conocen ms de dos mil enzimas diferentes, cada una de las cuales es
capaz de catalizar una reaccin qumica especfica. Sin embargo, diversos tipos de clulas
elaboran diferentes tipos de enzimas; ninguna clula contiene todas las enzimas conocidas,
las enzimas particulares que pueden fabricar una clula son uno de los principales factores que
intervienen en la determinacin de las actividades biolgicas y funciones de esa clula. Una
clula puede efectuar una reaccin qumica dada a una velocidad razonable solamente si
posee una enzima especfica que puede catalizar una reaccin. La molcula o molculas sobre
la cual acta una enzima se conoce como su sustrato.

Figura 1. Mecanismo de catlisis. Tomado de: www.100ciaquimica.net

 MATERIALES
MATERIALES BIOLGICOS
30 mL Leche fresca (* grupo de trabajo)
30 mL Zumo de papaya (* grupo de trabajo) o 30 g de papaya
Ablandador de carne (10 g * grupo de trabajo)
25 g de Hgado licuado en 75 mL de agua
3 papas criollas (1 hervida) (* grupo de trabajo)

MATERIALES NO BIOLGICOS
12 tubos de ensayo
1 Pinza para tubos de ensayo
2 Morteros
Pipetas de 1-5 y 10 mL
Vasos de precipitado: 50, 100 y 250 mL
1Gradilla
1 Embudo
1 Pipeteador
1 vidrio de reloj
1 Agitador
1 Termmetro
Papel filtro
Papel indicador de pH
Tubos para centrfuga

1 bistur (individual)
Gasa o muselina (individual)
1 Frasco de agua oxigenada (* grupo de trabajo)

REACTIVOS
EDTA 0.2M
Buffer de acetato de sodio 0.5 M pH 5.5 (cido actico y acetato de sodio)
Hidrxido de amonio 0.25 M
cido clorhdrico 0.25 M
Buffer fosfatos calibrado pH 6.0.
Buffer fosfato 0.02 M (pH=7)
MnO2
HCl 3 M
NaOH 3M
HgCl3 2%

EQUIPOS:

Centrfuga
Plancha de calentamiento
Bao serolgico
Balanza
 METODOLOGA

Preparacin de soluciones enzimticas:

Jugo de papaya:
Macere 30 g de papaya en un mortero y sin agregar agua, filtre a travs de doble gasa o de
muselina. Rotule el filtrado como solucin enzimtica 1.

Ablandador de carne:
A 3 g de ablandador de carne agregar 10 mL de agua destilada, mezcle y centrifugue. Separe
el sobrenadante y rotlelo como solucin enzimtica 2.

Ensayo de la prueba enzimtica

En un tubo de ensayo pipetee 0.5 mL de cualquiera de las soluciones enzimticas y adicione
3.0 mL de leche y mezcle e incube a 50C hasta la formacin del cogulo. Agitando
suavemente note el incremento de viscosidad.

NATURALEZA DE LA ACTIVIDAD PROTEOLTICA DEL ABLANDADOR DE CARNE

Prepare cuatro tubos de ensayo con los siguientes reactivos:

REACTIVOS (mL) 1 2 3 4
Solucin enzimtica 2 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada 0.2 - 0.05 0.05
EDTA - 0.1 - -
cido clorhdrico - - 0.15 -
Hidrxido de amonio - - - 0.15
pH 2 9
Mezclar y luego de 15 minutos de reposo, aadir 5 mL de buffer de acetato a cada uno.
Efectuar la prueba enzimtica a cada tubo. Registrar los resultados y analizarlos.

NATURALEZA DE LA ACTIVIDAD PROTEOLTICA DE LA PAPAINA

Prepare cuatro tubos de ensayo con los siguientes reactivos:

REACTIVOS (mL) 1 2 3 4
Solucin enzimtica 1 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada 0.2 - 0.05 0.05
EDTA - 0.1 - -
cido clorhdrico - - 0.15 -
Hidrxido de amonio - - - 0.15
pH 2 9
Mezclar y luego de 15 minutos de reposo, aadir 5 mL de buffer de acetato a cada uno.
Efectuar la prueba enzimtica a cada tubo. Registrar los resultados y analizarlos.
EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Tomar 4 tubos de ensayo, aadirles 5mL de hgado homogenado, rotular e incubar, de acuerdo
a la siguiente tabla:

TUBO INCUBACIN
1 80C (colocar tubo por 10 minutos)
2 37C (colocar tubo por 5 minutos)
3 Temperatura ambiente

1. Tomar el cronmetro, aadir 2 mL de perxido de hidrgeno a cada tubo, este es el tiempo

cero, registrar el momento en que empieza a producirse las burbujas

Registrar resultados y observaciones en una tabla.

La descomposicin del perxido de hidrgeno es un proceso biolgico importante. Debido a

que el perxido de hidrgeno (H2O2) es fuertemente oxidante, puede ser fisiolgicamente
nocivo. Por esta razn, la sangre y el hgado de los seres vivos contienen una enzima, la
catalasa, que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno

De acuerdo con la Universidad Del Pas Vasco (2017) la velocidad de las reacciones
enzimticas aumenta por lo general con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima
es estable y activa. La velocidad por lo general se duplica por cada 10 C de aumento de
temperatura. Sin embargo las enzimas se desnaturalizan cuando la elevacin de la temperatura
sobrepasa cierta temperatura lmite. La cual a su vez es la temperatura ptima de trabajo. A
bajas temperaturas, las reacciones disminuyen mucho o se detienen, pero la accin cataltica
reaparece cuando la temperatura se eleva a valores normales

En la prctica de laboratorio la temperatura varia en todas las muestras, por tal motivo estas
reaccionaron de manera diferente al entrar en contacto con el perxido de hidrogeno (H2O2),
existi una diferencia de reaccin entre el hgado cocido y el crudo, ya que el cambio de
temperatura que se realiz al cocer el hgado, desnaturalizo la enzima catalasa afectando su
funcionamiento. Otro aspecto para observar es que el hgado estaba macerado es decir las
celular ya estaban rotas por lo cual la catalasa reacciona ms rpido. En este proceso se pudo
observar la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxigeno lo cual se puede
evidenciar por la formacin de burbujas.

Brown, T., Bursten, B. y LeMay, H.2004. Qumica.La ciencia central

EFECTO DEL PH EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Tomar 3 tubos de ensayo, aadir 1 mL de hgado homogenado a cada tubo, luego rotular y
adicionar reactivos de acuerdo a la siguiente tabla:
 TUBO INCUBACIN
1 3 mL de HCl 3 M ph inferior a 1
2 3 mL de NaOH 3 M
3 3 mL de buffer fosfato 0.02 M (pH=7)

1. Agitar suavemente hasta mezclar

2. Adicionar 3 mL de perxido de hidrgeno a cada tubo
3. Observar y escribir resultados en una tabla

Segn la Universidad Nacional de Colombia (2006), la mayora de los enzimas son muy
sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del
pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad.

Debido a que el primer tubo contena HCl, las protenas se desnaturalizan ya que el pH es
cido y no se produce reaccin al agregar perxido

En el segundo tubo el NaOH contiene un pH alcalino, lo cual tambin desnaturaliza las

protenas y cuando aadimos perxido tampoco se produce reaccin

En el tercer tubo con buffer de fosfato se produjo la reaccin esperada debido a que el pH
ptimo para la catalasa es de 7

Universidad Nacional de Colombia (2006) CATALASA, PEROXIDASA Y POLIFENOLOXIDASA

DE PITAHAYA AMARILLA (Acanthocereus pitajaya)

COMPARACIN ENTRE LA ACCIN DE UNA ENZIMA Y LA DE UN CATALIZADOR

INORGNICO

Tome 7 tubos de ensayo limpios y secos y mida los reactivos sealados en la siguiente tabla:

TUBOS
REACTIVOS 1 2 3 4 5 6 7
Papa (Tr=trozo) 1 Tr - - - - 1 Tr -
H2O2 5% (gotas) 10 10 10 10 10 10 10
Extracto papa hervida(mL) - 1 - - - - -
Cloruro de Mercurio (mL) - - 1 - - - -
*Extracto enzimtico (mL) - - 1 - - - 1
MnO2 gramos - - - 0.01 **0.01 0.01 -
*Se puede utilizar cualquier extracto
** Al tubo 5 se le debe calentar con dixido de manganeso (MnO2), despus enfriarlo para
adicionarle perxido de hidrgeno.
Compare y escriba los resultados obtenidos en cada tubo.

Tubo 1: Debido a que la papa contiene catalasa al entrar en contacto con perxido de
hidrogeno lo descompone formando oxigeno

Tubo 2: En este caso la catalasa se desnaturalizo al hervir la papa por lo tanto no reacciono al
agregarle perxido de hidrogeno

Tubo 3:
Tubo 4: En este caso el dixido de manganeso debilita la unin entre los dos tomos de
oxgeno (H-O-O-H), que se separan durante el proceso.

Tubo 5: En este caso la temperatura no afecto el MnO2 ya que al calentarlo la temperatura no

subi a los 530 C que es la T de descomposicin del MnO2 por lo tanto se descompuso el
perxido

Tubo 6: Debido a que este tubo contenia catalasa de la papa y MnO2 la reaccin se produjo
ms rpido

Tubo 7

COMPARACIN ENTRE LA ACCIN DE UNA ENZIMA Y LA DE UN CATALIZADOR

INORGNICO

RESULTADOS Y DISCUSIN

1. Consulte la especificidad de las enzimas proteolticas: papana, tripsina, quimiotripsina,

renina y pepsina.
2. Consulte las principales caractersticas de la enzima quimiotripsina, sitio de sntesis en el
organismo, mecanismo de activacin, nmero de aminocidos que conforman la estructura
de la enzima, aminocidos del sitio activo y mecanismo de accin
3. Realice una descripcin sobre el efecto que tiene la temperatura en la actividad de las
enzimas
4. Cmo influye en la actividad cataltica los cambios de pH?
5. Consulte sobre los catalizadores inorgnicos y establezca dos diferencias con respecto a
las enzimas.

BIBLIOGRAFA

Bacca, C. Bioqumica. Manual de Laboratorio. Universidad INCCA de Colombia. Colombia:

Unidad Editorial. 2011
Laboratorio de Bioqumica 1, prcticas para la carrera de odontologa, Universidad Nacional
de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Qumica, Santaf de Bogot, 1996.
Lodish, H. et al. Biologa celular y molecular. 5 Ed. Argentina: mdica panamericana.2005
Nelson, D., COX, M. Leningher. Principles of Biochemstry. 3 Ed. New York: Worth
Publischer,2001
Plummer, D. Bioqumica Prctica. Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana, Mxico, 1981.
Rentina, G. Tcnicas de Bioqumica aplicada. Editorial interamericana, Mxico, 1974.
Stryer,L. Bioqumica. Cuarta edicin. Editorial Reverte, Barcelona, 1995.