Hiptesis de trabajo:

Determinar el agente etiolgico Staphylococcus aureus en queso fresco por la

tcnica de inoculacin en superficie con varilla acodada.

Hiptesis nula:

Se encontrara menos de 1000 UFC/ml de Staphylococcus aureus en queso

fresco por la tcnica de inoculacin en superficie con varilla acodada.

H0: Staphylococcus aureus 1000 UFC

Hiptesis alternativa:

No se encontraran menos de 1000 UFC/ml de Staphylococcus aureus en queso

fresco por la tcnica de inoculacin en superficie con varilla acodada.

HI: Staphylococcus aureus > 1000 UFC

Materialesy equipo
Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn a, c. (se debe
utilizar una pipeta para cada dilucin)
Pipetas Pasteur estriles
Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn. a. (en caso
que la
muestra sea lquida.
Varillas de vidrio de 3.5 mm de dimetro aproximadamente y 20 cm. de
largo,
dobladas en ngulo recto (forma de L), estriles (se debe utilizar una por
dilucin). a
Utensilios estriles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas,
pinzas, tijeras,
esptulas y separador de huevo. a
Vaso de licuadora estril o Bolsa para Stomacher a
Motor para licuadora o Stomacher a.
Asa bacteriolgica
Portaobjetos
Microscopio ptico
Balanza granataria .
Horno para esterilizar material de vidrio.
Autoclave
Bao de agua a ebullicind
 Incubadora a 35 2C

PROCEDIMIENTO
1. Aislamiento selectivo.
1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estril.
2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de
licuadora estril.
3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estril al 0.1% o solucin
amortiguadora de fosfatos 0.1M de pH 7.2.
4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10
segundos en licuadora a velocidad mnima.
5. Realizar diluciones decimales hasta 10-4(el nmero de diluciones est en
funcin de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm
conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente.
6. Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2,10-3 y 10-4 10-5 10-6 a
cajas de Petri con agar Baird Parker.
7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una
varilla de vidrio estril, en forma de L, iniciando a partir de la mayor
dilucin (Mtodo de inoculacin por extensin en superficie).
8. Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido
por el
agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente.
9. Invertir las placas e incubar a 35 1 C. durante 45 a 48 h.
10.Despus de incubar, observar las colonias caractersticas de este
microorganismo en el agar Baird Parker (BP). stas se presentan como:
colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas con dimetro de 1 a 2
mm, muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la
colonia.
2. Recuperacin de la cepa.
1. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias tpicas de
S. aureus, si no es posible, seleccionar las placas que contienen
concentraciones de la muestra ms diluidas, no obstante que contengan
ms de 150 colonias.
2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias tpicas, tambin
pueden ser utilizadas y al reportar se deber agregar la nota de valor
estimado.
3. Con ayuda del cuadro 1, determinar el nmero de colonias a evaluar,
tomando en cuenta el nmero de colonias tpicas de S. aureus obtenidas en
el agar Baird-Parker: As mismo seleccionar las colonias para realizar las
pruebas cuantitativas y cualitativas; dentro de estas ltimas estn
comprendidas la coagulasa y la termonucleasa.
 4. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son
caractersticas de este microorganismo, utilizando asa bacteriolgica recta
estril, en caldo infusin cerebro corazn.
5. Incubar a 35 1 C durante 24 h.6. Inocular e incubar en la misma forma,
cepas tipo de S. aureus ATCC 6538 y S. epidermidis ATCC 12228, como
controles positivo y negativo
pruebas bioqumicas.

Prueba de la presencia de la enzima coagulasa.

1. Con una pipeta estril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensin del
microorganismo que desarroll en el caldo infusin cerebro corazn,
adicionar
0.2 mL de plasma de conejo. Dicho plasma previamente diluido volumen a
volumen con solucin salina estril.
2. Incubar en bao Mara o en incubadora, entre 35 y 37 C y observar
durante 6
h. en intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse formacin de cogulo,
prolongar el perodo de observacin hasta por 24 h.
3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de
plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm,
posteriormente
aadir una gota de cloruro de calcio al 5%; se debe formar un cogulo entre
10 a 15 segundos.

NOTA
Analizar la consistencia del cogulo y registrar sta, de acuerdo con los
valores
del cuadro 2.Considerar la prueba positiva solamente si hay formacin de
cogulo con un valor igual o superior a 2 cruces.

Prueba de la enzima termonucleasa.o DNASA

1. Calentar 0.3 mL de la suspensin del microorganismo que creci en
caldo
infusin cerebro corazn durante 15 minutos en bao de agua hirviendo.
2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la
suspensin bacteriana, del punto anterior, con ayuda de una pipeta Pasteur
estril. Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S. aureus ATCC
6538), como negativos (S. epidermidis ATCC 12228).
3. Incubar a 35 2 C en cmara hmeda, durante 4 a 24 h.
4. Despus de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a
los
orificios hechos en el agar DNA. (Existe un agar DNA que ya contiene el
indicador de orto-toluidina).
5. La formacin de un color rosa brillante extendido por lo menos un
milmetro
alrededor del orificio, en donde se inocul, indicar que el microorganismo
posee la enzima termonucleasa.
6. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N
como
indicador. De encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente
alrededor de la colonia, seguido de un precipitado blanco.
NOTA
Si se utiliza el medio de cultivo comercial, generalmente ya tiene el
indicador de orto toluidina, por lo que despus de la incubacin se podr
observar la coloracin rosa en donde se inocul, en caso de encontrarse
dicha enzima.
Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioqumicas: la
fermentacin de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la
presencia de la enzima catalasa; cuando ambas pruebas son positivas,
quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce cido en
condiciones anaerbicas y adems contiene la enzima catalasa.
 Prueba de la catalasa
1. Con una asa bacteriolgica, tomar un inculo del caldo infusin cerebro
corazn despus de su incubacin, y colocarlo sobre un portaobjetos,
2. Adicionar una o dos gotas de perxido de hidrgeno al 30%, mezclar
perfectamente bien y observar los resultados.
3. Si se presenta formacin de burbujas, se considera positiva la prueba,
esto es que s contiene la enzima catalasa. En caso de no formarse
burbujas la prueba se interpretar como ausencia de esta enzima.

Pruebas de suceptibilidad

Antibiograma para S. aureus.

Estas pruebas determinan el crecimiento de una bacteria bajo la presencia de

ciertos inhibidores. Puede realizarse de varias maneras, una de las ms
difundidas, la inclusin de discos en los cultivos. Estos discos liberan el antibitico
solo a una distancia corta por lo que se notar la falta de crecimiento bacteriano
en la periferia del disco en caso de ser susceptible a tal antibitico.
Staphylococcus aureus es sensible a furazolidona (disco 100 mcg) y resistente
a bacitracina (0,04 unidades de bacitracina. Los estreptococos -hemolticos del
grupo A son susceptibles)