Instituto Politcnico Nacional porque sus bajas constantes dielctricas reducen el

poder de solvatacin de sus soluciones acuosas hacia los

Prctica Precipitacin, separacin y punto
isoelctrico de protenas.
Introduccin
La multiplicidad de grupos cidos y bsicos de una
protena hace que su solubilidad dependa de las
concentraciones de las sales disueltas, la constante
dielctrica del disolvente, pH y temperatura. Algunas
protenas precipitan en condiciones en que otras an
estn bastante solubles. Este efecto debe usarse como
base para la purificacin proteica.
Efecto de la solubilidad de una protena.
iones disueltos, como las protenas. La reduccin de la
constante dielctrica por los solventes orgnicos tambin
aumenta las diferencias entre las protenas respecto a su
comportamiento en el salting out.
Objetivos
Analizar el efecto que produce la modificacin de factores
fisicoqumicos sobre la solubilidad de las protenas.
Determinar el punto isoelctrico de la insulina, basndose
en sus propiedades de solubilidad a diferentes valores de
pH.
Resultados
Clculos

La solubilidad de una protena en solucin acuosa es Para el punto isoelctrico de la insulina:

sensible a las concentraciones de sales disueltas. La [ ]
= +
concentracin salina se puede expresar en trminos de []
fuerza inica, esta ltima se define como:
[0.20]
= 4.74 +
[0.05]
( ) ( )

= = .
2

La solubilidad de una protena a una determinada fuerza Para cuando nicamente hay concentracin de sal:
inica vara con las clases de iones en solucin. El orden
1 1
de eficacia de los distintos iones en cuanto a su influencia = 7 + 4.74 + log[0.25]
sobre la solubilidad proteica es bastante similar para las 2 2
diferentes protenas y parece deberse en primer trmino = .
al tamao y la hidratacin del in.
Determinacin del punto isoelctrico de la insulina
La solubilidad de una protena a baja fuerza inica se Tub Ac. Acetat Insulin pH Observacione
incrementa por lo general con la concentracin salina. La o Actic o de a s
o sodio 40U/ml
explicacin del fenmeno salting in (incremento de la
0.2 M 0.2 M
solubilidad por sales), es que a medida que se incrementa (ml) (ml)
la concentracin salina de la solucin proteica, los 1 0.23 0.02 0.06ml 3.6 No precipito
contraiones adicionales recubren con mayor eficacia las 7
2 0.15 0.10 0.06ml 4.5 Precipito
numerosas cargas inicas de la molcula de protena.
6
Con lo que se incrementa la solubilidad de la protena. A 3 0.05 0.20 0.06ml 5.3 Precipito
fuerzas inicas elevadas se reduce la solubilidad de las 4
protenas, como la mayora de las sustancias. Este efecto 4 0.01 0.24 0.06ml 5.4 No precipito
2
conocido como Salting out (reduccin de solubilidad por
5 0.00 .025 0.06ml 9.0 No precipito
sales) Es por la competencia por las molculas que 6
interactan entre los iones salinos agregados y los otros
solutos disueltos. A concentraciones salinas elevadas el
solvente se torna insuficiente para disolver tantos solutos Precipitacin por metales pesados
Tubo Clara de Solucin Observaciones
por lo que se reduce la actividad del solvente. Las huevo
interacciones entre solutos se vuelve mas fuertes que los 1 1ml Cloruro Precipito
que hay entre el soluto y el solvente. Lo que propicia la mercrico
precipitacin de este. 5% (0.25ml)
2 1ml Nitrato de Precipito
plata 2%
Efectos de los solvente orgnicos (0.25ml)
3 1ml Acetato de Precipito
Los solventes miscibles con el agua, como la acetona y plomo 2%
el etanol, suelen ser buenos precipitantes de protenas (0.25ml)
 4 1ml Cloruro de Precipito en el precipitado se disolvi en un mililitro de agua y se
bario 5% menor cantidad realiz la reaccin de Biuret a ambas fases. Los
(0.25ml)
5 1ml Cloruro de Solubilizo la
resultados que se obtuvieron fueron: positivo para
sodio 5% protena precipitado y negativo para sobrenadante. Esto sucedi
(0.25ml) porque al momento de saturar la solucin lo que paso es
6 1ml Agua Testigo o que se hizo precipitar las protenas acelerando el proceso
(0.25ml) comparacin
con la centrifugacin. Al momento de hacer la prueba de
Biuret, las protenas en realidad estn en el precipitado y
Precipitacin por efecto del pH y disolventes no en la fase acuosa de la mezcla
Tubo 1 2 3
Clara de 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml 2. Precipitacin por efecto de pH y solventes.
huevo filtrada El pH al que la cantidad de precipitado fue mayor, ya que
HCl 0.1 ml 1ml - -
NaOH 0.1 ml 1ml la composicin de la clara de huevo es:
Regulador de - - 1ml Ovalbmina 54%, Ovotransferrina 12%, Ovomucoide
acetatos 0.1M 11%, Ovoglobulina G2 4%, Ovoglobulina G3 4%,
(4.7ml) Ovomucina 3.5%, Lisozima 3.4%, Ovoinhibidor 1%,
Observacione Precipitaci Precipitaci Precipitaci
s n media n menor n mayor Ovoglicoprotena 1%, Flavoprotena - 0.8%,
Etanol 3ml 3ml 3ml Ovomacroglobulina 0.5%, Avidina 0.05%, Cistatina
Observacione Precipitaci Precipitaci Precipitaci 0.05%. Debido al alto contenido de ovalbmina,siendo el
s n media n menor n mayor punto isoelctrico de dicha protena 4.6 y el regulador de
acetatos de pH=4.7, esto caus que dicha protena se
encontrase en su estado sin carga, precipitando en mayor
Salting Out
Biuret Interpretacin cantidad que en los tubos a los que se adicion HCl y
Filtrado 1 + Positiva porque NaOH.
(sobrenadante) hay protenas
Precipitado 1 + Positiva porque Conclusiones
hay protenas Las variaciones de pH, presencia de sales y metales
Filtrado 2 + Las protenas pesados afecta a las protenas de manera directa ya que
(sobrenadante) precipitaron, provoca cambios en la carga de sus grupos R, alterando
estn en el su conformacin estructural, coagulndolas y facilitando
precipitado 2 su separacin de acuerdo a la secuencia de aminocidos
Precipitado 2 + Positiva porque
y la carga que estas posean, dichas tcnicas son tiles
hay protenas.
para el aislamiento e identificacin de protenas de
inters mdico y en investigacin para su caracterizacin
Discusin y secuenciacin.
1.Separacin de protenas por precipitacin con sales.
Al adicionar 6 mL de la solucin saturada de (NH 4)2SO4 Bibliografa
esta provoc la precipitacin de ciertas protenas, esto Zumdahl, Steven S. (2009). Principios de Quimica 6th Ed.
fue causado por la competencia que se da por las Houghton Mifflin Company. p. A21.
molculas de agua solubilizando a la protena y las que
Nelson, D. Cox, M. 2013. Lehninger Principios de
solubilizan a los iones NH4+ y SO42-, acaparando los iones
bioquimica. W.H. and Freeman. Pp. 147-151.
las molculas de agua, y causando que la protena se
coagule por las interacciones hidrofbicas que hay entre
los residuos de aminocidos de la misma. Para
comprobar que haba protenas en cada fase se realiz a
una muestra de 1ml de cada una de ellas, la reaccin de
Biuret. De las cuales se obtuvo un resultado positivo para
ambas. Posteriormente el sobrenadante se volvi a
saturar con con (NH4)2SO4 en estado slido para hacer
ms efectiva la saturacin debido a que este no est
diluido en agua. Se agito y se llev a centrifugar bajo las
mismas condiciones. Finalmente se volvieron a obtener 2
fases un sobrenadante y un precipitado. Se hizo la
transferencia del sobrenadante en otro tubo de ensaye,