Caractersticas de Migs e

Contagem de Migs Viveis

CQ Micro
2017

Fonte:
Pinto, T.J.A., Kaneko, T.M., Pinto, A.F. Controle Biolgico de Qualidade de Produtos Farmacuticos, Correlatos
E Cosmticos. 3 ed. Ed. Atheneu, SP, 2010.
Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis. Universidade Luterana do Brasil,
2010.
Microrganismos Heterotrficos
Respirao
glicose + 6 O2 + 38 ADP + 38 Pi 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP
Quando o oxignio serve como aceptor final de eltrons a via conhecida como
respirao aerbia;
Fermentao
glicose + 2 ADP + 2 Pi 2 cidos lcticos + 2 ATP

Existem mecanismos anaerbios de produo de energia que no envolvem uma cadeia

respiratria e so denominados fermentao. Esta via no requer oxignio ou aceptor
final de eltrons, portanto a fermentao no envolve a fosforilao oxidativa para
gerar ATP.
Desde que a fermentao no requer oxignio, ela um processo anaerbico. Vrias
bactrias anaerbias facultativas realizam respirao aerbica e fermentao.
Temperatura e Migs
Influncia da concentrao de oxignio no crescimento microbiano

Microrganismos aerbios
Aerbios estritos
Microaerfilos

Microrganismos anaerbios
Facultativos
Aerotolerantes
Estritos
Curva de Crescimento Bacteriano
Qualquer bactria em condies ideais de cultura,
multiplica-se segundo um ciclo que se repete
constantemente.
Colocando-se certo nmero de clulas viveis em um
meio de cultivo lqido, em determinado intervalo de
tempo, traa-se uma curva do nmero de clulas pelo
tempo, obtendo-se 4 fases distintas.
Curva de Crescimento Bacteriano
fases de desenvolvimento de uma cultura
bacteriana
adaptao, desenvolvimento (crescimento),
extino de nutrientes e morte

fases: lag, exponencial, estacionria e morte

Curva de Crescimento Bacteriano
Controle de Qualidade Microbiolgico
Fontes de contaminao:

Matrias-Primas (almoxarifado)

Sistema de gua e ar

Equipamentos

Ambientes (instalaes inadequadas)

Operadores

Materiais de Embalagem

Estocagem do produto
Controle de Qualidade Microbiolgico
Objetivos:

Determinar o nmero de microrganismo viveis

Comprovar a ausncia de microrganismo patognicos

-Staphylococcus aureus
-Escherichia coli e Enterobacterias em geral
-Pseudomonas aeruginosa
-Salmonella sp

- Clostridium sp

Aprovar ou reprovar as amostras segundo os padroes microbianos estabelecidos.

Detectar possveis fontes de contaminao.

Controle de Qualidade Microbiolgico
Aplicao

Produtos acabados
Matrias-primas
Produtos em processo de fabricao
Material de acondicionamento
Monitoramento ambiental e operadores

Importncia
Segurana para o consumidor
Estabilidade do produto
Garantia de qualidade do produto
Controle de Qualidade Microbiolgico
Testes microbiolgicos

Controle de Qualidade de Produtos Farmacuticos no estreis e Cosmticos

Controle de Qualidade de Produtos Estreis

Efeito inibidor do produto

Eficincia do conservante

Doseamento microbiolgico de antibiticos, vitaminas e aminocidos do produto.

Controle de Qualidade Microbiolgico
Limite Microbiano

Amostragem (representar o conjunto das unidades produzidas)

Preparo da amostra
(Necessrio conhecer a composio do produto. Produtos acabados ou matrias-
primas podem conter substncias antimicrobianas; para tais substncias necessrio
efetuar sua neutralizao, utilizando agentes neutralizantes especficos).

Anlise Quantitativa: Determinao do nmero de microrganismos viveis

Anlise Qualitativa: determinao de patgenos

Capacidade nutritiva dos meios de cultura

 Controle de Qualidade Microbiolgico
Limites de aceitao
Os limites de aceitao de contaminantes de ambientes, so estabelecidos
conforme o grau de risco e da suscetibilidade a contaminao de cada
produto e por cada empresa.
Os limites para produtos e matrias primas so estabelecidos em
monografias farmacopicas.
gua de processo
gua geralmente utilizada como matria prima e portanto tambm pode
vir a ser uma fonte de contaminao para o produto.
Monografias farmacopicas preconizam como limite mximo 100 UFC/ml
para microrganismos totais aerobicos e ausncia de patgenos como P
aeroginosa, coliformes totais e fecais em 100ml de amostra.
 Controle de Qualidade Microbiolgico
Metodologia analtica
Mtodos de anlise envolvendo medicamentos no estreis abrangem:

- Descontaminao e descarte;
- Lavagem e acondicionamento;
- Esterilizao;
- Amostragem;
- Diluentes e inativantes;
- Preparo de meios de cultura;
 Controle de Qualidade Microbiolgico
Metodologia analtica
Descontaminao e descarte de resduos:
-Todo material resultante da anlise microbiolgica
considerado contaminado portanto deve ser descontaminado
em autoclave a Temperatura de 121C por 30 minutos.
-Os materiais devem estar bem acondicionados no interior do
equipamento.
-Utilizando a mesma autoclave para esterilizao de materiais,
meios de cultura e descontaminao estes devem ser
realizados em ciclos separados.

Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis.

Universidade Luterana do Brasil, 2010.
Controle de Qualidade Microbiolgico
Metodologia analtica
Diluentes
Os diluentes tem como funo nutrir as clulas
microbianas, possibilitando a retomada das funes
metablicas e permitir que os esporos germinem em:
- Caldo peptonado;
- Caldo casena-soja;
- Miristrato de isopropila;
- Ringer tamponado pH7,2 (tampo fosfato).
Acrescentar a estes substncias inativantes dos
conservantes.

Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis.

Universidade Luterana do Brasil, 2010.
Controle de Qualidade Microbiolgico
Metodologia analtica
Relao conservantes e inativantes
Conservante Inativante

Formaldedo 0,1% (p/v) histidina

Clorados 0,5%(p/v) tiossulfato de

sdio
Sais Quaternrios de Amnio 3,0% (p/v) polissorbato 80+
e tensoativos anfteros 0,3% de lecitina de soja
Parabenos (fenois)e 1,0% (p/v) polissorbato 80
derivados
Metais pesados 0,1% (p/v) de cistena
Fonte: Controle Biolgico de Qualidade de Produtos Farmacuticos,Correlatos e Cosmticos. Terezinha se Jesus Andreoli Pinto,
 Controle de Qualidade Microbiolgico
Metodologia analtica
Meios de cultura mais utilizados
Meios de enriquecimento:
- Caldo casena-soja;
- Caldo infuso crebro e corao.
Meios para contagem total de
microrganismos:
-Agar casena-soja (Meio l);
-Agar nutritivo.
Meios utilizados para anlise de fungos e
leveduras:
- gar Sabouraud-dextrose (Meio II);
- gar batata-dextrose.
Meios especficos para Pseudomonas:
-gar cetrimida;
-gar para deteco de fluorescena;
Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis.
Universidade Luterana do Brasil, 2010.
Controle de Qualidade Microbiolgico
Metodologia analtica
Meios de cultura mais utilizados

Meios especficos para S aureus: Meios especficos para E coli:

- gar Vogel-jonhson;
-gar Mac Conkey;
- gar desoxirribuneclease;
- gar sal manitol vermelho de fenol. -gar peptona-ferro;
-gar de eosina-cloreto de metiltioninio;
Meios especificos para Salmonella sp: -gar trplice-ferro (TSI);
- gar verde brilhante;
-gar citrato de Simmons;
- Caldo digesto pancretico de casena;
- gar de lisina-ferro(LIA); Meios para pesquisa de clostridios:
- gar trplice acar-ferro(TSI); -gar seletivo para clostridios;
- gar citrato de Simmons. -Caldo tioglicolato.
Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis.
Universidade Luterana do Brasil, 2010.
 Anlise Quantitativa Determinao do Nmero
de microrganismos viveis totais

Capaz de determinar o nmero total de bactrias

e fungos presentes em produtos e matrias-
primas no estreis.

A determinao pode ser realizada por trs

mtodos:
- Mtodo de Filtrao por Membrana,
- Mtodo de Contagem em Placa
- Mtodo de Tubos Mltiplos.
 Mtodo de Contagem de Microrganismos

Em meio slido, com Semeadura da Amostra em Profundidade

(Pour Plate)

- Transferir 1-2 mL de amostras em placas de Petri estreis

- Verter meio de cultura estril (20 mL)
- Homogenizao
- Incubar 30-35C bactrias (3-5 dias) e 20-25C bolores e leveduras (5-7
dias)
- Contar colnias
- Considerar fator de diluio UFC/ peso Menor que 250 bactrias
E menor que 50 para fungos e leveduras
Determinao do Nmero de microrganismos viveis totais
Mtodo de Contagem em Placas de Petri
Contagem de colnias
Utilizar contador de colnias ou lupa apropriada.
Somente as placas que apresentarem at 300 colnias para
bactrias e 100 para fungos devero ser consideradas para
registro dos resultados.
Calcular a mdia aritmtica de cada diluio multiplicando
o nmero de colnias da placa pela diluio usada e relatar
a mdia aritmtica dos resultados.
 Contagem de colnias Mdia: (2,93+1,00+4,1+1,2) x 104 = 2,3 x 104 UFC/ml ou g
4
Se o nmero de colnias em todas as placas forem
inferior a 20
registrar a contagem correspondente menor diluio.
Diluio Colnias UFC/mL
p/ placas
1:100 293 2,93x104
1:100 100 1,00 x 104
1:1000 41 4,1x104
1:1000 12 1,2x104

Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis.

Universidade Luterana do Brasil, 2010.
 Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis.
Universidade Luterana do Brasil, 2010.
Determinao do Nmero de microrganismos viveis totais
MTODO DE CONTAGEM EM PLACA Substncias insolveis ou parcialmente insolvel em
gua

10g/10ml 1ml 1ml 1ml

90 mL 9 mL 9 mL
tampo gua gua

10-2 10-3 10-4

AMOSTRA 10-1

1 mL

Pour Plate ou estria em superfcie

 Mtodo de Contagem de Microrganismos

Em meio slido, com Semeadura da Amostra em Superfcie

- Meio preparado e distribudo previamente em placas de Petri

- Com pipeta inserir a amostra
- Espalhar a amostra com ala de Drigalski
 Determinao do Nmero de microrganismos viveis totais
MTODO DE CONTAGEM EM PLACA
Tcnica do gar Fundido (Pour
(Pour Plate) x Tcnica de Semeadura em Superfcie
Determinao do Nmero de microrganismos viveis totais:
Membrana Filtrante

Membrana de nitrato de celulose ou acetato de celulose, com

porosidade igual ou inferior a 0,45m.
O equipamento para filtrao e as membranas devem estar
esterilizadas.
Transferir 10ml ou quantidade que represente 1g da amostra
para sistema filtrante e filtrar.
Lavar a membrana 3 vezes com 100ml de soluo salina
estril, ou Fluido I e transferir para uma placa de Petri
contendo o Meio I.
 Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis.
Universidade Luterana do Brasil, 2010.

Determinao do Nmero de microrganismos viveis

Filtrante Substncias solveis em gua.
totais Membrana Filtrante:

10ml FLUIDO l

10g ou ml 90 ML
MEIO I

30-35C

10ml

AMOSTRA TAMPO
FOSFATO
MEIO II
90 ml - pH
20-25C

Diluio da amostra, FLUIDO l

FILTRAO POR
Filtrao em membrana, 90 ML

Inoculao da membrana em meio de cultura; MEMBRANA

Incubao, interpretao
RESUMO
MTODO POR FILTRAO POR MEMBRANA
Placa com meio
estril
+
Copo de Filtrao Membrana Membrana
Membrana Filtrante

Placa Porosa

Incubao
Kitassato

Contagem Total

Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis.

Universidade Luterana do Brasil, 2010.
 Determinao do Nmero de microrganismos
viveis totais: Nmero mais provvel

Utilizado quando se espera que o produto apresente densidade

bacteriana baixa.
Baseia-se na probabilidade
Amostras pouco solveis e translcidas
Preparao das amostras:
- Amostras slidas 10g para 90ml de diluente.
- Amostras lquidas 1ml para 9ml de caldo de casena-soja.
Preparar diluies 1:100 e 1:1000 a partir da diluio 1:10
 Determinao do Nmero de microrganismos
viveis totais: Nmero Mais Provvel

Incubar os tubos a 30-35 C por 4 dias.

Positivo exame microscpio, formao de gs,se turvar meio
confirmar repicando novamente.
Determinar o nmero mais provvel de microrganismos por g ou
ml.
Exige tabelas estatsticas para obteno do resultado a partir das
leituras.
Nmero de replicatas: 3 ou 5 rplicas

Tubos mltiplos 3 ou 5
(5 tubos: maior preciso)
Nmero mais Provvel
NMP
 Apostila, Gonalves, L.A. Controle de Qualidade de Produtos no Estreis.
Universidade Luterana do Brasil, 2010.

Determinao do Nmero de microrganismos viveis totais:

Nmero Mais Provvel: Mtodo
Mtodo dos tubos mltiplos; Amostra
slida
10g 1ml 1ml

90 mL 9 mL 9 mL
1ml
diluente
diluente

AMOSTRA 10-2 10-3

10-1

10 mL
Caldo
casena
soja
Diluio da amostra,
Inoculao em tubos contendo meio de cultura;
Incubao, interpretao 30 - 35 C
4 DIAS
Pinto, T.J.A., Kaneko, T.M., Pinto, A.F. Controle Biolgico de Qualidade de Produtos
Farmacuticos, Correlatos e Cosmticos. 3 ed. Ed. Atheneu, SP, 2010.