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Artculo original
Biodegradacin de petrleo y sus derivados por la comunidad bacteriana en un suelo de
la Patagonia Argentina
Adrin Acua*, Graciela Pucci, Mara Jos Morales, Oscar Pucci
Centro de Estudios e Investigacin en Microbiologa Aplicada (CEIMA). Facultad de Ciencias Naturales. Universidad Nacional de la
Patagonia San Juan Bosco. Argentina.
Resumen: El objetivo de este trabajo fue caracterizar una muestra de suelo proveniente de un sistema de biorremediacin en actividad y
determinar la capacidad de la comunidad bacteriana de biodegradar petrleo y sus destilados, e identificar los principales microorganismos
involucrados en el proceso. Para esto se tom una muestra de suelo por la tcnica de lanfarming y se caracterizaron sus propiedades fsicas,
qumicas y microbiolgicas; as como el tipo de hidrocarburos que contena por extraccin con Soxhlet y cromatografa en columna de
slica gel. A partir de la muestra se extrajo la comunidad bacteriana, y se determin su potencial para biodegradar petrleo, sus diferentes
fracciones y los destilados comerciales que se obtienen a partir de l. Se utilizaron mtodos indirectos de medicin del crecimiento bacteriano
por conteo de microorganismos y medicin de densidad ptica. A partir de estos sistemas se aislaron 41 cepas y se identificaron por FAME.
Los principales resultados indicaron que la comunidad bacteriana del suelo posee la capacidad de biodegradar los hidrocarburos existentes
en el mismo, principalmente la fraccin aliftica, as como los destilados gasoil, kerosn y aceite lubricante, siendo la fraccin aromtica,
la polar y el destilado nafta no degradados. Est comunidad est constituida principalmente por Rhodococcus erythropolis, Achromobacter
xylosoxidans y Brevundimonas diminuta, mostrando la mayor biodiversidad cuando los hidrocarburos utilizados como fuente de carbono
pertenecen al grupo de los alifticos. Las caractersticas fsicas, qumicas y microbiolgicas del suelo indicaron que es factible que se realice
una biorremediacin eficiente de los hidrocarburos presentes.
Biodegradation of petroleum and its derivatives by the bacterial community in the soil of
the Argentinean Patagonia
Abstract: The purpose of this study was to characterize a soil sample obtained from an active bioremediation system and determine the
capacity of the bacterial community for biodegrading petroleum and its distilled products, and identify the main microorganisms involved in
the process. For this object a soil sample was taken with the lanfarming technique and its physical chemical and microbiological characteristics
were characterized, as well as the type of hydrocarbons it contained by Soxhlet extraction and silica gel column chromatography. From
this sample we also extracted the bacterial community and determined its potential for degrading petroleum, its different fractions and the
commercial distilled products obtained from it. We used indirect measurement methods for determining bacterial growth by counting the
microorganisms and measuring optical densities. Through these methods we isolated 42 strains and identified them by FAME. The principal
results indicated that the soil bacterial community has the capacity for degrading the hydrocarbons in it, mainly the aliphatic fraction as well
as the distilled products such as gasoil, kerosene and lubricant oil, while the aromatic and polar fractions and the naphtha distilled product
are non degradable. This community is mainly constituted by Rhodococcus erythropolis, Achromobacter xylosoxidans and Brevundimonas
diminuta, showing the greatest diversity when the hydrocarbons used as carbon source belong to the aliphatic group. The physical, chemical
and microbiological characteristics of the soil indicated that it is possible that an efficient bioremediation of the hydrocarbons present
occurs.
* Correspondencia:
E-mail: ajcuna@unpata.edu.ar
proteasa 0,5 g; casamino cido 0,5 g; glucosa 0,5 g; almidn correspondiente, con el fin de observar la cintica de
0,5 g; piruvato de sodio 0,3 g; K2HPO4 0,3 g; MgSO4.7H2O crecimiento y potencial de degradacin de hidrocarburos.
0,05 g; agar 15 g; agua destilada 1000 mL) y medio mineral Luego de los 24 das de incubacin, se realiz para
[1] [NaCl 5 g; K2PO4H 0,5 g; NH4PO4H2 0,5 g; (NH4)2SO4 1 cada tubo un recuento de UFC en placa, por la tcnica de
g; MgSO4 0,2 g; KNO3 3 g; FeSO4 0,05 g; SL 10 B (HCl (25 diseminacin en superficie, por triplicado, de BDH en medio
%) 7,7 mL; FeSO4.7H2O 1,5 g; ZnCl2 0,07 g; MnCl2.4H2O MM-PGO. La incubacin de las placas se realiz durante 20
0,1 g; H3BO3 0,3 g; CoCl2.6H2O 0,19 g; CuCl2.2 H2O 0,002 das a 28C.
g; NiCl2.6 H2O 0,024 g; Na2MoO4.2H2O 0,036 g; agar 15 Identificacin de BDH: De las distintas placas de recuento
g; agua destilada 1000 mL] adicionado con 30 L de una en MM-PGO de los sistemas de cintica de crecimiento,
mezcla de petrleo de la cuenca del Golfo San Jorge y se seleccionaron colonias siguiendo como criterio la
gasoil 1:1 al que se denomin MM-PGO [1] para bacterias visualizacin de la morfologa de las mismas, llegando
degradadoras de hidrocarburos (BDH). a seleccionar un total de 41 cepas. La identificacin se
Anlisis de hidrocarburos: El contenido de hidrocarburos realiz por metil steres de cidos grasos (FAME) mediante
totales (HT) se determin sobre 50 g de suelo mediante tratamiento de 40 mg de masa celular crecida en la tercera
extraccin con Soxhlet durante 24 h con tricloroetano como estra de un cultivo en medio TSBA [15] (triptena 15 g;
solvente de extraccin. Los hidrocarburos extrados fueron peptona de soya 5 g; NaCl 5 g; glucosa 5 g; agar 15 g; agua
cuantificados gravimtricamente [14]. Las fracciones destilada 1000 mL, pH 7,2) de 24 horas efectuando una
aliftica, aromtica y polar de los HT obtenidos fueron saponificacin con alcohol metlico-hidrxido de sodio-
separadas por cromatografa en columna de silicagel agua (150 mL:45 g:150 mL) seguida de una metilacin con
(Kieselgel 60, 35-70 mesh, Merck) a partir de 0,3 g de cido clorhdrico 6N y alcohol metlico (325 mL:275 mL)
residuo. Como solventes de elucin se utilizaron 250 mL y a continuacin una extraccin con n-hexano-metil trbutil
de hexano, 150 mL de benceno y 150 mL de cloroformo- ter (1:1) y lavado con hidrxido de sodio-agua (10,8 g-900
metanol 1:1, para los hidrocarburos alifticos, aromticos mL) [16]. Las muestras fueron procesadas por triplicado
y polares, respectivamente [5]. Las fracciones obtenidas se y se almacenaron a -20C hasta realizar la cromatografa
cuantificaron gravimtricamente [14]. correspondiente. Los cidos grasos obtenidos se
determinaron como metil steres (FAME) por cromatografa
Estudio del potencial de biodegradacin de la comunidad gaseosa, utilizando una columna capilar Ultra2 de 25m de
bacteriana del suelo: longitud y 0,2mm de dimetro. El anlisis se llev a cabo
Obtencin de la comunidad bacteriana: Se realiz un con un cromatgrafo HP 6890 serie II GC (inyeccin
enriquecimiento de la comunidad bacteriana degradadora splitless; presin inicial 10 psi; programa de temperatura:
de hidrocarburos a partir de 10 g de suelo en 90 mL de caldo 170-250C a 5C.min-1, 260-310C a 40C.min-1, 1,5 min.
mineral y 100 L de petrleo estril de la cuenca del Golfo de permanencia a 310C, detector por ionizacin de llama)
San Jorge no sometido a biodegradacin, que es el mismo controlado por Chemstation 10,0x (Hewlett Packard). La
que contamin la muestra estudiada; ste se incorpor integracin se realiz segn el sistema MIDI Sherlock
para tener todas las fracciones del petrleo disponibles y versin 6.0 [16].
enriquecer el mayor nmero de microorganismos. Se incub Como criterios de identificacin fueron tomados los
durante 10 das a 28C con agitacin orbital a 150 r.p.m. especificados por el manual del sistema utilizado que indica,
Luego se tom un mililitro de la suspensin bacteriana que para una buena identificacin, el microorganismo
obtenida y se coloc en 90 mL de caldo mineral nuevo debe tener un ndice de similitud (IS) mayor a 0,5 con una
con 100 L de petrleo estril y se incub en las mismas diferencia mayor de 0,1 con respecto a la segunda opcin de
condiciones. Esta operacin se repiti dos veces ms y luego identificacin que nos brinda el sistema.
del ltimo repique, se mantuvo el cultivo en las condiciones Con las identificaciones realizadas a partir de los sistemas
de incubacin hasta que el mismo logr una densidad ptica lquidos con diferentes fuentes de carbono, se realiz un
de 0,5 a 690 nm. anlisis de componentes principales utilizando el programa
Potencial de biodegradacin de la comunidad bacteriana: PASS.
Se prepararon sistemas lquidos por triplicado utilizando
como sustrato cada una de las fracciones de hidrocarburos Resultados
obtenidas desde el propio suelo (alifticos, aromticos, y
polares), y con petrleo de la cuenca del Golfo San Jorge Estudio inicial del suelo: Los datos fsicos y qumicos
y sus destilados (gasoil, kerosn, nafta y aceite lubricante), obtenidos indican que el suelo no posee limitantes de este
todos ellos estriles. Cada sistema se constituy con 15 mL tipo para el correcto desarrollo de microorganismos (Tabla
de caldo mineral, 20 L del hidrocarburo ensayado y 200 1), a excepcin del contenido de nutrientes biodisponibles
L del extracto bacteriano obtenido a partir del suelo. La (nitrato, nitrito, amonio y fosfato), que se observaron
incubacin se realiz 24 das a 28C con agitacin orbital en concentraciones deficientes en el suelo, lo que puede
a 150 r.p.m en oscuridad, y el seguimiento se realiz por representar un problema en la biorremediacin de los
medicin de absorbancia a 690 nm frente a un blanco hidrocarburos presentes. El nmero de microorganismos
conformado por el caldo mineral ms el hidrocarburo hetertrofos totales fue de 4,1x106 UFC/g y el de BDH
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de 1,2x106 UFC/g. El alto contenido de hidrocarburos bacteriana del suelo: De las fracciones de hidrocarburos
encontrado en el suelo fue concordante con su procedencia alifticos, aromticos y polares provenientes del suelo,
(Tabla 1). Estos se encontraron constituidos por un 45,8% slo los hidrocarburos alifticos produjeron un aumento
de hidrocarburos alifticos, un 26,1% de hidrocarburos en la biomasa en medio lquido (Figura 1). Con respecto
aromticos y un 28,1% de hidrocarburos polares. a los destilados del petrleo, la nafta produjo inhibicin
de la comunidad bacteriana recuperada, mientras que los
Estudio del potencial de biodegradacin de la comunidad dems fueron capaces de promover su desarrollo. Con
Arena media 4
Arena fina 61 Anlisis de hidrocarburos (mg.kg-1)
Arena muy fina 28 Totales 67800
Limo y arcilla 7 Alifticos 31052
Aromticos 17628
Polares 19119
nd: no detectable.
Gasoil Alifticos
Kerosn Aromticos
Nafta Polares
A. Lubricante
Petrleo
Densidad ptica
Densidad ptica
Tiempo (das)
Figura 1. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana extrada de suelo con diferentes hidrocarburos como nica fuente de carbono y energa.
Patagonia, Argentina.
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A. lubricante
Acinetobacter lwoffi (3) Nocardia corynebacterioides (1)
Gasoil
Kerosn
Petrleo
Achromobacter xylosoxidans (6) Pantoea agglomerans (1)
UFC.g-1
Polares
0,2
Pantoea agglomerans
Cepa 33
Kerosn
Cepas 27, 29
0
Alifticos
Petrleo
Pseudomonas stutzeri
Nocardia corynebacterioides
Brevundimonas diminuta
Enterobacter intermedius
Acinetobacter lwoffi Sphingobacterium faecium
-0,1 Cepas 16, 17 Gasoil
Rhodococcus erythropolis
aceite lubricante, la comunidad bacteriana logr el mayor fuente de carbono utilizada, resultando mayor para aceite
desarrollo, disminuyendo con gasoil, petrleo y kerosn, lubricante, y descendiendo con petrleo, gasoil, kerosn,
respectivamente. Los recuentos de BDH finales de los siendo igual a cero para el sistema con nafta.
sistemas lquidos de crecimiento, fueron concordantes Un total de 41 cepas bacterianas fueron aisladas a partir
con el seguimiento por densidad ptica (Figura 2). Con de los sistemas lquidos. Las cepas recuperadas fueron 14 a
las fracciones de hidrocarburos obtenidas desde el suelo, partir de hidrocarburos alifticos como fuente de carbono,
slo se encontraron microorganismos en el sistema con 11 a partir de gasoil, 7 a partir de kerosn y 3 de aceite
hidrocarburos alifticos. Con los destilados del petrleo lubricante y 6 de petrleo. Aproximadamente el 76% de los
utilizados, el nmero de BDH fue diferente segn la microorganismos fueron identificados por el sistema utilizado
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(Tabla 2), observndose que los de mayor frecuencia fueron compuestos con estructuras en anillos (uno o ms), o
Rhodococcus erythropolis, Achromobacter xylosoxidans y ramificaciones, haciendo an ms difcil su metabolizacin
Brevundimonas diminuta. En el anlisis de componentes [9]. La fraccin polar, constituida principalmente por
principales realizado, en funcin a los microorganismos asfaltenos, representa la fraccin ms recalcitrante a la
aislados y los hidrocarburos utilizados como fuente de biorremediacin debido a la complejidad de sus molculas,
carbono, se observ que, con los hidrocarburos alifticos, las que presentan compuestos poliaromticos con ms de tres
hubo mayor biodiversidad de microorganismos (Figura 3). anillos [8]. Esta composicin de la fraccin de hidrocarburos
Por otro lado, Rhodococcus erythropolis fue caracterstico polares sera responsable de la falta de desarrollo de
del sistema con gasoil y Pantoea agglomerans del sistema microorganismos en los tubos diseados para estudiar su
con aceite lubricante. Tanto el sistema con kerosn como cintica de biodegradacin. Si bien en la bibliografa se
con petrleo, se asociaron ms a los gneros bacterianos encuentran estudios en suelos en donde estas fracciones
Nocardia, Brevundimonas y Sphingobacterium. del petrleo son degradadas por los microorganismos [14],
es posible que esta sea una propiedad de las comunidades
Discusin bacterianas cuando en el ambiente en el que desarrollan se
encuentran todas las fracciones del petrleo juntas [20].
Para que un proceso de biodegradacin de hidrocarburos Por otra parte, el perfil de biodegradacin observado
sea eficiente en un suelo, es necesario conocer como son las para los destilados del petrleo evidenci que la mayor
caractersticas del hbitat microbiano. Estas estn definidas degradacin fue con aceite lubricante, seguido en orden
por las caractersticas fsicas y qumicas del suelo [7]. As, decreciente con gasoil, petrleo, kerosn y nafta, hecho
los valores de capacidad de retencin de agua, porosidad influenciado por el tipo de compuestos que constituyen
y textura observados en la muestra estudiada, favorecieron a cada uno. Los aceites lubricantes y el gasoil, estn
el crecimiento microbiano [17]. El suelo estudiado posee constituidos principalmente por parafinas y compuestos
una textura areno limosa al tacto con un 7% de partculas aromticos [5] que resultan sustratos biodisponibles y
finas (limo y arcilla), y un 93% de arena, conformada aprovechables como fuente de carbono y energa por los
principalmente por arena fina y muy fina. En esta textura se microorganismos. El kerosn y la nafta estn constituidos
encuentran poros grandes, conformados por las partculas por compuestos de menor peso molecular, entre ellos el
de arena, que permiten la buena aireacin del suelo, hexano, benceno, tolueno, xileno y etilbenceno [8], que
favoreciendo el desarrollo bacteriano [18]. Asimismo, resultan txicos para la membrana bacteriana inhibiendo el
al estar la arena del suelo conformada por partculas de crecimiento de los microorganismos [9]. Estos compuestos,
tamao fino y muy fino, el tamao de los poros es tal que los del kerosn y la nafta, seran responsables de ejercer
favorecera la retencin del agua incorporada en el suelo un efecto txico sobre la comunidad bacteriana del suelo,
[12]. Por otro lado, la fraccin de limo y arcilla que forma inhibiendo completamente a los microorganismos en el
parte de este suelo, le proporciona una fraccin que es capaz sistema con nafta, y mostrando la cintica de crecimiento
de retener por largos perodos el agua incorporada [19], lo menos eficiente para el kerosn de todos los destilados del
que brinda a los microorganismos una humedad adecuada petrleo utilizados como fuente de carbono en este trabajo.
para el desarrollo de su metabolismo por perodos de La comunidad bacteriana del suelo present una gran
tiempo mas prolongados. Esto tambin favorece el recorrido diversidad, siendo los microorganismos que se recuperaron
del agua dentro de la matriz del suelo con los nutrientes en mayor proporcin Rhodococcus erythropolis,
biodisponibles disueltos en ella, hacindolos accesibles para Achromobacter xylosoxidans y Brevundimonas diminuta.
los microorganismos. La baja concentracin de nutrientes Estos gneros bacterianos se encuentran frecuentemente en
biodisponibles (nitrato, nitrito, amonio y fosfato) es una suelos [10]. Los tres gneros bacterianos han sido estudiados
situacin desfavorable para el proceso de biorremediacin por sus capacidades de biodegradar hidrocarburos. El gnero
que, de acuerdo a lo expresado por Van Hamme et al. en Rhodococcus posee un gran potencial de biodegradacin
2003 [7], podra ser solucionado con un adecuado sistema de contaminantes en el ambiente [21], siendo la especie
de bioestimulacin. erythropolis, recuperada a partir del sistema con gasoil,
La fraccin de hidrocarburos alifticos fue degradada ms estudiada por su capacidad de biodegradar gasoil [22], as
fcilmente que las fracciones de hidrocarburos aromticos como tambin hidrocarburos n-alcanos [23] y poliaromticos
y polares extradas desde suelo. Esto es lgico debido a [24]. Sette et al. en 2006 [25] observaron que Achromobacter
que, la fraccin aliftica, est formada principalmente por xylosoxidans posee la capacidad de utilizar los hidrocarburos
n-alcanos, hidrocarburos que son fcilmente metabolizados como nica fuente de carbono y energa, encontrndose
por los microorganismos [4]. La utilizacin como fuente estudios que lo involucran en la degradacin de hidrocarburos
de carbono de compuestos orgnicos se dificulta a medida poliaromticos, como el fenantreno [8]. En este estudio,
que ramificaciones y anillos aromticos se incorporan en Achromobacter xylosoxidans fue aislado de los sistemas
su estructura [9]. As, seguido a los n-alcanos, se hace ms con hidrocarburos alifticos, kerosn, aceite lubricante y
compleja la degradacin de alcanos ramificados, compuestos petrleo, demostrando el gran potencial de biodegradacin
aromticos de bajo peso molecular y alcanos cclicos. La de hidrocarburos que posee. El tercer microorganismo ms
fraccin de hidrocarburos aromticos del petrleo presenta frecuentemente aislado fue Brevundimonas diminuta; ste
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