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MDULO 2

1. INTRODUCCIN.

El principio bsico de las pruebas de difusin por disco ha sido utilizado por ms de 70 aos
en los laboratorios de microbiologa. Alexander Fleming utiliz una variante de esta tcnica
cuando realizaba estudios con la penicilina en los aos cincuenta. En ese entonces exista
una gran variedad de procedimientos diferentes, con pobre estandarizacin.

Los doctores Bauer, Kirby, Sherris y Turck estudiaron minuciosamente todas las variables
involucradas en el proceso, tales como los medios de cultivo, la temperatura y el espesor
del agar. En 1966, publicaron los resultados de su estudio describiendo la prueba que se usa
en la actualidad.
El CLSI adopt los pasos bsicos del procedimiento descritos en el estudio de Bauer como el
mtodo de referencia para difusin por disco. Estos pasos estandarizados deben seguirse en
forma minuciosa para obtener resultados adecuados.

2. CMO REALIZAR LA PRUEBA.

Una vez que se han aislado colonias de una bacteria que ha sido previamente identificada
como patgeno potencial, es necesario proceder de la siguiente manera para realizar la
prueba de susceptibilidad.

Seleccin de las colonias.

Preparacin y estandarizacin del inculo.
Inoculacin de las placas.

Aplicacin de los discos de antimicrobiano.

Incubacin.
Medicin de las zonas de inhibicin.
Interpretacin de los resultados.

2.1 Seleccionar las Colonias:

Uno de los pasos ms importantes en el proceso de esta prueba es la preparacin del
inculo. Este involucra la seleccin de colonias apropiadas para preparar la suspensin y su
posterior estandarizacin.
Primero, seleccione varias colonias de la bacteria que est analizando. Si selecciona entre
35 colonias, con el fin de aumentar la probabilidad de detectar resistencia.
Utilizando una trula (hisopo de algodn estril) o un asa de inoculacin recoja de la placa
cuidadosamente slo las colonias claramente aisladas para evitar pruebas de cultivo mixto.
Si no dispone de colonias bien aisladas, haga un subcultivo de la bacteria en una nueva
placa.

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Figura 1: Seleccin de colonias aisladas para el inculo.

2.2 Preparacin y Estandarizacin del Inculo Bacteriano:

Preparar a partir de un cultivo puro, de 18-24 horas de incubacin, una suspensin directa
de colonias, la turbidez de la suspensin debe ser cuidadosamente estandarizada al patrn
de turbidez 0,5 de la escala Mc Farland (lo que corresponde a aproximadamente 1,5 x 108
UFC/mL). Las suspensiones se realizan en suero fisiolgico o caldo Mueller-Hinton, las
cuales deben ser homogenizadas en un agitador, previo al ajuste de turbidez. La medicin
de la turbidez debera ser realizada a travs de un turbidmetro, en caso contrario
comparando directamente (visualmente) la suspensin preparada con el control 0.5 de Mc
Farland, bajo luz transmitida. Una vez ajustada la suspensiones, esta debe ser usada como
inculo inoculada en la placa dentro de los 15 minutos siguientes.
El estndar de Mc Farland o tambin llamado Etaln, est hecho de sulfato de bario (0,5 mL
BaCl2 1,175% + 99.5 mL H2SO4 1%). Se debe agitar antes de usar y al terminar su uso se
debe guardar protegido de la luz.

Figura 2: Estandarizacindel Inculo.

El mtodo descrito de suspensin directa de colonias se aplica para los siguientes

organismos:

- Suspensin directa en suero fisiolgico o caldo MH:

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Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Enterobacterias.
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter spp.
Bacilos gram-negativos no fermentadores: complejo Burkholderia cepacia y
Stentrophomonas maltophilia.

- Suspensin directa con observaciones especiales:

Haemophilus spp.: suspensin directa de la colonia, usando cultivo con incubacin preferentemente
de 20 a 24 horas, en placa de agar chocolate.
Streptococcus spp (grupo Beta hemoltico y grupo viridans): suspensin directa de la colonia,
usando cultivo con incubacin de 18 a 20 horas en placa de agar sangre de cordero.
N. gonorrhoeae: suspensin directa de la colonia en Mueller Hinton Broth o solucin salina 0,9%,
pH 7.0, usando cultivo con incubacin de 20 a 24 horas en placa de agar chocolate incubada en 5%
de CO2. Incubacin a 36C (no debe exceder 37C).
N. meningitidis: suspensin directa de la colonia usando cultivo de 20 a 24 horas en placa de agar
chocolate incubada a 35C y con 5% de CO2.

2.3 Proceso para la Inoculacin de la Placa:

Antes de realizar la inoculacin, se debe retirar del congelador o refrigerador los discos para
permitir que estos se adapten a la temperatura ambiente. Esto debe realizarse una hora
antes de usar, para minimizar la condensacin y reducir la posibilidad que la humedad
afecte la concentracin de los agentes antimicrobianos contenidos en los discos.
Las placas de Agar Mueller-Hinton (MHA), Agar Mueller Hinton + 5% sangre de cordero o
HTM, segn corresponda, tambin deben adquirir la temperatura ambiente, para que
cualquier exceso de humedad se absorba dentro del medio. Este proceso se puede acelerar
poniendo las placas entreabiertas en el incubador por 1015 minutos. Se debe verificar en
cada lote de placas la profundidad adecuada de 4 mm y el pH entre 7.2 y 7.4. Si son placas
comerciales puede ser mediante un certificado del proveedor.
Para asegurar que la suspensin est homognea, se debe agitar la suspensin bacteriana
previamente preparada. Para sembrar las placas sumerja cuidadosamente un trula de
algodn estril en la suspensin. Remueva el exceso de lquido presionndo la trula contra
la pared del tubo.

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Figura 3: Removiendo el exceso de lquido del hisopo.

Con la trula inocule la superficie comenzando en la parte superior de la placa. Cubra toda
la placa frotando de ida y vuelta de un borde al otro. Rote la placa en tres direcciones y
repita el procedimiento de siembra al menos 3 veces. Esto garantizar que el inculo sea
distribuido homogneamente.

Figura 4: Inoculacin de la placa.

2.4 Aplicacin de los Discos de Antimicrobianos:

Coloque los discos con los agentes antimicrobianos dentro de los 15 minutos siguientes a la
inoculacin de la placa MHA. Los discos pueden ser depositados uno a uno con ayuda de
pinzas estriles o con un dispensador de discos multicanal.
Se pueden aplicar un mximo 12 discos en una placa de 150 mm de dimetro o
hasta 6 discos en una placa de 100 mm. Los discos deben ser colocados a una distancia
no menor de 24 mm de centro a centro, (CLSI M02).

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En el caso de Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, S. pneumoniae y Streptococcus beta

hemolticos, se indica aplicar un mximo 9 discos en una placa de 150 mm de dimetro o
hasta 4 discos en una placa de 100 mm.
Presione cada disco firmemente para asegurar el contacto completo con la superficie de
agar. No olvidar esta indicacin ya que si los discos no estn bien adheridos pueden
terminar en la tapa de la placa durante la incubacin. Nunca reubique un disco una vez que
ste ha tomado contacto con la superficie del agar.

Figura 5: Esquema aplicacin de los discos manualmente.

Figura 6: Aplicacin de los discos con dispensador.

Puntos que hay que recordar sobre los discos de antimicrobianos:

No use discos despus de su fecha de vencimiento.
No almacene discos en un congelador libre de escarcha (nonfrost), ya que el mecanismo para
lograr la condicin de nonfrost se basa en aumentos y disminuciones cclicas de la temperatura lo
cual puede afectar la estabilidad de los principios qumicos de los discos. Ante el uso de
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congeladores que forman hielo, se recomienda que los discos sean almacenados en contenedores
hermticos e impermeables con proteccin contra la humedad con algn absorbentes como Slica
gel o en contenedores sellados al vaco. Adicionalmente, se recomienda situar las cajas alejadas de
las paredes del congelador donde se encuentra la acumulacin de hielo.
Use productos validados para diagnstico in vitro como los aprobados por la FDA o CE-IVD.
Use discos con el contenido de antimicrobiano especificado en los estndares de CLSI.

2.5 Incubacin de la Placa de Agar:

Una vez sembrado el inculo y depositado los discos, coloque la tapa e invierta las placas e
incbelas.
Para las bacterias no fastidiosas, incube en atmsfera normal a 35C +/- 2 por 1618 horas
o 24 horas segn corresponda.
Para la prueba de difusin por disco de bacterias fastidiosas, use las condiciones especficas
de incubacin recomendadas por el CLSI, como se muestra en el siguiente cuadro:

Bacteria Medio Incubacin

Tiempo Atmsfera
(horas)

Haemophilus spp. Medio de prueba para 16-18 CO2 5%

Haemophilus
N. gonorrhoeae 20-24 CO2 5%
Agar base GC 1% sup.
S.pneumoniae 20-24 CO2 5%
MHA-5% sangre de
Otros Streptococcus cordero 20-24 CO2 5%
spp.
MHA-5%sangre de
cordero

2.6 Medicin de Zonas de Inhibicin:

2.6.1 Cmo Medir las Zonas de Inhibicin usando Luz Reflejada.

Despus de retirar la placa de la incubadora:

Examine detenidamente la placa para verificar que el crecimiento sea uniforme y
confluente, de tal modo que permita obtener halos de inhibicin bacteriana simtricos y
definidos.

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Figura 7: La luz reflejada es usada para medir las zonas de inhibicin (placa MHA 150 mm).

Figura 8: Midiendo zonas en una placa de sangre Mueller-Hinton desde la parte posterior de la placa (placa MH sangre de 150 mm).

Para medir las zonas de inhibicin desde la parte posterior de la placa usando luz
reflejada:
Luz reflejada es la luz que llega desde arriba, es decir, la placa de petri se mantiene a una distancia
de pocos centmetros sobre un fondo negro y se ilumina desde un nivel superior con una lmpara.
Medir redondeando (aproximando) al milmetro ms cercano con una regla o un pie de metro.
La luz reflejada es usada para Enterobacteriaceae, como E. coli, otros bacilos gram negativos,
estafilococos y enterococos (excepto para vancomicina).
La luz reflejada tambin es usada cuando se miden zonas de inhibicin en agar Mueller-Hinton
sangre ( Streptococcus spp).

Sugerencia tcnica: Cuando analice Streptococcus spp en agar Mueller-Hinton con 5% de

sangre de cordero, retire la tapa y mida las zonas desde la parte superior de la placa.

2.6.2 Cmo Medir las Zonas de Inhibicin usando luz Transmitida.

Se utiliza la luz transmitida, cuando mida zonas de:

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Enterococcus spp con vancomicina y linezolid.

Los antibiogramas por difusin para Enterococcus spp se deben leer a las 1618 horas
aproximadamente, excepto el disco de vancomicina y linezolid que se lee a las 24 horas de
incubacin, lo cual debe ser realizado utilizando luz transmitida (luz que llega desde la parte
posterior de la placa), es decir, la placa se mantiene hacia la luz (lmpara) y se debe
considerar el desarrollo al interior del halo el cual puede pasar desapercibido si se utiliza luz
reflejada.

2.7 Cmo interpretar los resultados:

Cada halo alrededor del disco debe ser ledo cuidadosamente, midiendo el dimetro en
milmetros con una regla o pie de metro. El resultado de esta medicin se interpreta
basndose en los puntos de corte tabulados en las tablas CLSI (actualizadas anualmente),
las cuales contienen los criterios Resistente, Intermedio, Sensible o No Sensible, segn
corresponda para cada bacteria en estudio.
Variables a controlar en la Prueba de Difusin por Disco

Las siguientes variables enumeradas a continuacin, deben ser controladas cuidadosamente

al realizar las pruebas de difusin por disco:
Composicin del medio de cultivo.
pH del medio.
Profundidad del agar.
Concentracin del inculo.
Procedimiento de inoculacin.
Contenido del antimicrobiano en el disco.
Almacenamiento de los discos.
Nmero de discos en la placa.
Temperatura de incubacin.
Atmsfera de incubacin.
Tiempo de incubacin.
Medicin de la zona de inhibicin.
Registro de mediciones e interpretacin con tablas CLSI vigentes.

Perfil de antibiticos a estudiar en bacterias frecuentemente aisladas en la clnica:

Escherichia coli aislada de orina.

cefazolina
cefuroxima
cefotaxima
ciprofloxacino
nitrofurantoina
gentamicina
amikacina
ertapenem
meropenem*(IAAS)
imipenem*(IAAS)
cefepime
colistin*(IAAS)
fosfomicina*(IAAS)

Nota:

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Fosfomicina: CLSI tiene puntos de corte para interpretacin solamente para Escherichia coli. Si se realiza el antibiograma en otra
Enterobacteria aislada de orina, se debe utilizar los puntos de corte de EUCAST 2017.

Enterobacterias aisladas de
otros orgenes.

cefazolina
cefuroxima
cefotaxima
ceftazidima
cefepime
ciprofloxacino
levoflxacino
gentamicina
amoxicilina cido clavulnico
amikacina
ertapenem
meropenem*(IAAS)
imipenem*(IAAS)
piperacilina-tazobactam
trimethoprim-sulfametoxazole
aztreonam
cloranfenicol
tetraciclina

Nota: Colistin no es indicado por mtodo de difusin, solo se debe realizar por mtodo de CIM, y es interpretado con valores e corte
epidemiolgico.

Staphylococcus aureus aislado de

secrecin de herida.

cefoxitina
eritromicina
clindamicina
sulfametoxazol
trimetoprim
rifampicina

Enterococcus faecalis aislado de

orina.

ampicilina
ciprofloxacino
levofloxacino
tetraciclina
nitrofurantoina
fosfomicina

Nota: Fosfomicina: indicado solo para Enterococcus faecalis aislados del tracto urinario.

Pseudomonas aeruginosa aislado de

sangre.

ceftazidima
gentamicina
piperacilina/tazobactam
amikacina
cefepime
ciprofloxacino
levofloxacino
imipenem
meropenem

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Nota:Colistin: no es indicado por mtodo de difusin, solo se debe realizar por mtodo de CIM.

Complejo Acinetobacter baumannii

aislado de sangre.

ampicilina/sulbactam
ceftazidima
ciprofloxacino
levofloxacino
cefepime
imipenem
meropenem
gentamicina
amikacina
piperacilina/tazobactam
cefepime
ceftriaxona
trimethoprim-sulfametoxazole
minociclina

Nota:Colistin: no es indicado por mtodo de difusin, solo se debe realizar por mtodo de CIM.

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