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Cruz, A. S. et al. Testes in vitro como alternativa aos testes in vivo de Draize. Rev. Inst.

Adolfo Lutz, 64(1):1-9,2004


ARTIGO DE REVISO/ REVIEW ARTICLE

Testes in vitro como alternativa aos testes in vivo de Draize


In vitro tests used as an alternative to Draize in vivo tests

RIALA6/967
urea Silveira CRUZ1*, Maria Luisa BARBOSA, Terezinha de Jesus Andreoli PINTO2

* Endereo para correspondncia: Instituto Adolfo Lutz Av. Dr. Arnaldo, 355 CEP. 01246-902 So Paulo -SP - Seo de
Culturas Celulares Virologia - 1- Instituto Adolfo Lutz - 2- Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So
Paulo - e-mail aurcruz@ial.sp.gov.br
Recebido: 19/09/2003 Aceito para publicao: 01/04/2004

RESUMO
Os procedimentos descritos por Draize deram origem aos testes de irritao ocular e cutnea adotados
internacionalmente para avaliar produtos e substncias. Entretanto, eles so criticados por motivos ticos,
devido crueldade com os animais, mesmo aps diferentes modificaes terem sido propostas nos
protocolos originais. Metodologias alternativas tm sido estudadas para avaliar a toxicidade de produtos
usados em seres humanos. Entre as mais citadas encontram-se as que utilizam organismos inferiores,
clulas vivas de mamferos, sistemas organotpicos e substratos inertes, alm de bancos de dados
informatizados e programas que avaliam a toxicidade pela determinao de relao estrutura-atividade. Os
mtodos utilizando clulas vivas tm sido muito utilizados para predizer com segurana a irritao,
contribuindo para a reduo do nmero de animais utilizados nos testes in vivo. At o momento, no
existem mtodos validados para substituir os ensaios de irritao ocular e cutnea, mas somente para
avaliar substncias corrosivas.
Palavras-Chave. teste de Draize, irritao ocular, irritao cutnea, citotoxicidade, testes in vitro

ABSTRACT
The procedures described by Draize have generated both eye and cutaneous irritation tests, which have
been internationally adopted to evaluate products and substances. However, they have been criticized for
ethical reasons, due to their cruelty towards animals, even after the proposal of different modifications in
the original methods. Thus, alternative techniques have been studied to evaluate the toxicity of products
used for human beings. Those, which utilize inferior organisms, mammal living cells, organotypic systems
and inert substances, besides computerized databanks and programs that evaluate toxicity by determining
the structure-activity relationship. Methods using living cells have been widely used to safety predict
irritation, what contributes to the reduction of animals use for in vivo tests. So far, there are no validated
methods to replace the ocular and cutaneous irritation assays, except for the evaluation of corrosive
substances.
Key Words. Draize tests, ocular irritation, cutaneous irritation, cytotoxicity, in vitro tests.

INTRODUO TESTES IN VIVO

O potencial irritante de vrias substncias e produtos de Desde a antiguidade, vrias espcies animais foram
uso humano vem sendo avaliado, desde a dcada de 40, em utilizadas como modelos vivos, em estudos de situaes de
experimentos que utilizam animais de laboratrio. Alguns dos risco, principalmente do gs mostarda empregado durante a
ensaios adotados para tal finalidade, denominados testes de guerra, e no desenvolvimento da indstria farmacutica no
irritao ocular ou cutnea, ainda hoje adotados pelos rgos sculo XX. O efeito prejudicial para os olhos, ocasionado por
oficiais, foram inicialmente descritos por Draize. algumas substncias, resultou no desenvolvimento da
Procedimentos severos que afetam a segurana dos toxicologia ocular que utilizava principalmente o coelho, como
animais resultam em crticas e discusses por parte de entidades modelo de estudo, para as avaliaes de irritao99.
no governamentais. Mtodos alternativos vm sendo No incio da dcada de 40, Jonas S. Friendenwald props
investigados para tentar minimizar este conflito. a graduao de nveis de severidade, dos diferentes

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componentes da irritao ocular, em escalas numricas. Este evita, na maioria dos casos, resultados falsos positivos ou
mtodo foi modificado e adotado para avaliar quantitativamente negativos, alm de muitas vezes eliminar a necessidade de uma
substncias perigosas, bem como garantir a segurana dos segunda bateria de testes. Estas recomendaes foram adotadas
produtos de aplicao tpica que eram aplicados sobre pele e pelos rgos americanos, enquanto que os europeus
mucosas ocular e peniana de coelhos albinos da raa Nova recomendam o emprego de at trs animais, dependendo do
Zelndia. Os coelhos em relao aos outros animais possuem tipo de produto a ser avaliado.
pele permevel, olhos grandes com anatomia e fisiologia bem Diversos estudos sugerem diminuir a quantidade do
descrita, so fceis de manusear, apresentam vantagens no produto a ser aplicado no olho do animal, passando de 0,1 mL
aspecto econmico, alm de fcil aquisio35,99. como no mtodo de Draize para 0,01 mL, sem alterar a
O teste de irritao cutnea, seja do tipo primria ou sensibilidade do mtodo. A reduo do volume sugerida visa,
cumulativa, estabelece graduaes para reaes como edema e ainda, tornar o ensaio mais prximo do emprego do produto,
eritema. O teste de irritao ocular estabelece graduaes para passando a refletir o modo de uso real em humanos43,45.
as reaes observadas na crnea, ris e conjuntiva. Os protocolos Roggeband et al.74, aps avaliarem detergentes lquidos
definem o volume, forma de administrao, intervalos de nas mesmas condies, em voluntrios humanos e coelhos,
observao e nmero de animais a serem utilizados. Estes confirmaram que o teste de irritao ocular com baixo volume
ensaios, denominados testes de Draize, foram adotados por em coelhos permite predizer o perigo de irritao ocular no ser
muitos laboratrios e tornaram-se a base para os mtodos oficiais humano, pois a sensibilidade geralmente maior que a observada
de avaliao de irritao drmica e ocular. Aplicam-se a produtos no homem.
qumicos, de higiene, cosmticos, perfumes e correlatos, que Das propostas sugeridas para diminuir o incmodo
podem ser, conforme resultados obtidos, classificados em causado pelos produtos, nos animais experimentais, encontra-
irritantes e no irritantes2,35,70. se ainda, a recomendao do uso de anestsicos, embora estes
Kay e Calandra54 propuseram modificaes quanto ao possam contribuir para alterar a permeabilidade da crnea42,44,82.
critrio de avaliao, estabelecendo oito classificaes para o O teste de irritao drmica vem sendo modificado por
potencial irritante, com graduaes intermediarias entre no diferentes agncias reguladoras, porm sua essncia continua
irritante e maximamente irritante, ao contrrio de Draize que sendo a aplicao do produto sob ocluso na pele dorsal do
estabeleceu somente dois tipos de classificao, irritante e no coelho, por perodo de 24 horas. Aps, a retirada do produto, os
irritante. animais so observados por intervalos de 24 e 72 horas. A
O conceito dos trs Rs (3 Rs), reduction, refinement e modificao mais citada e adotada como oficial pela OECD, o
replacement, para o uso de animais, em ensaios ou no tempo de exposio da amostra que passou a ser de quatro
desenvolvimento de pesquisas, foi definido aps a publicao horas, alm do nmero reduzido de animais que passou de seis
do livro The Principle of Humane Experimental Technique de para pelo menos trs coelhos. As diferentes variaes no
Russel e Burch em 1959. Este conceito tem como objetivo a procedimento formam a base da classificao de corroso ou
reduo do nmero de animais, o refinamento dos mtodos e a irritao, dependendo da severidade da reao da pele, sua
reposio ou troca destes mtodos por ensaios substitutos ou persistncia e reversibilidade73.
alternativos in vitro. Com a publicao do livro de Singer em Mesmo com algumas modificaes j estabelecidas, o
1975, sobre a tica no tratamento dos animais, o teste ocular de teste de Draize continua sendo muito combatido por
Draize tornou-se alvo para as crticas das sociedades protetoras organizaes no governamentais de proteo animal. Os
dos animais99. cientistas no tm medido esforos para que haja uma
Diferentes modificaes vm sendo propostas por harmonizao dos ensaios e a implementao dos 3Rs, nas
pesquisadores de todo mundo envolvendo desde o nmero de instituies de pesquisa e educacionais dos paises da Europa97.
animais, quantidade do produto aplicado, tempo de irrigao A FDA j aceita sem a necessidade de correlao com
aps aplicao do produto, perodo de observao, graduao teste in vivo, o teste in vitro Limulus amebcito lisado (LAL)
e interpretao dos resultados. As mais aceitas so as que no para deteco de endotoxinas bacterianas nos produtos
alteram a preciso dos resultados obtidos nos ensaios de injetveis de uso humano e animal, como substituto do teste de
irritao ocular e cutnea99. pirognio em coelhos. Os testes de irritao ocular e cutnea de
A modificao mais citada refere-se ao nmero de animais, Draize, para a FDA, continuam sendo considerados os mais
originalmente nove e atualmente nos protocolos oficiais variando confiveis para avaliar a segurana das substncias introduzidas
de trs a seis coelhos, a exemplo dos protocolos da Organization no olho ou aplicadas ao seu redor, assim como aquelas aplicadas
for Economic Cooperation and Development (OECD), da Food na pele. J a Unio Europia, em suas emendas diretivas,
and Drug Administration (FDA) e do Ministrio da Sade do estabelece prazos para o trmino do uso de animais nos ensaios
Japo70,99. de produtos acabados, ingredientes ou combinao de
Springer et al.86 analisaram a reduo do nmero de ingredientes. Entretanto, estes prazos podero ser adiados se
animais praticada no teste de irritao ocular, por diferentes os mtodos alternativos no forem validados pelo European
entidades internacionais e sugeriram que o uso de seis animais Center for Validation of Alternatives Methods (ECVAM)38.

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TESTES IN VITRO de Draize e o mtodo de difuso em gar utilizado como


alternativo. Algumas modificaes no protocolo original do
O questionamento quanto ao uso de animais de mtodo in vitro foram introduzidas, a lise em relao toxicidade
laboratrio, na avaliao de risco dos produtos de uso humano, foi definida por um mtodo planimtrico, onde o tamanho da
resultou em vrios estudos a partir da dcada de 60, direcionados rea das clulas mortas desenhado em papel, que aps ser
a metodologias que utilizam tecidos e clulas vivas de mamferos, pesado pode fornecer quatro classificaes diferentes. Neste
organismos inferiores e substratos inertes23. Bancos de dados estudo, os resultados foram agrupados em duas classes,
informatizados e programas que avaliam a toxicidade pela designadas como no irritante e irritante e a correlao
determinao de relao estrutura-atividade, tambm foram observada entre os dois mtodos foi de 86% de concordncia.
desenvolvidos, por exemplo o Quantitation Structure Activity O mtodo de difuso em gar, segundo os autores pode ser
Relationship (QSAR), cujo protocolo relaciona a estrutura fsico- includo na bateria de testes para avaliar o potencial de irritao
qumica de um componente com sua toxicidade5,7,11,31. Estes dos produtos cosmticos.
estudos tm por finalidade principal obter metodologias rpidas, No incio da dcada de 80, Mosmann63, Borenfreud e
baratas, de fcil execuo e reprodutibilidade que possam ser Puerner15 descreveram outra tcnica para quantidades elevadas
padronizadas e validadas, situao imprescindvel para que os de amostras. Nesta tcnica, as clulas so semeadas em
mtodos in vitro alcancem a aceitao cientfica internacional. microplacas e a viabilidade celular avaliada por mtodos
As metodologias que utilizam tecidos e clulas vivas colorimtricos, utilizando a reduo do MTT ou a incorporao
so as mais empregadas, pois a intrnseca complexidade celular do vermelho neutro, os quais so quantificados por
mantida. As clulas utilizadas podem ser de vrios tecidos, espectrofotometria. Esta tcnica rpida e quantitativa, pois
tanto de origem humana quanto animal, sendo que a permite avaliar vrias concentraes do produto e calcular a
sobrevivncia e/ou proliferao celular podem ser avaliadas por concentrao que causa 50% de morte celular. Desde ento,
contagem do nmero de clulas ou pelo uso de corantes vitais. vrios estudos comparando o uso do vermelho neutro com o
A incorporao de radioistopos, formao de colnias, MTT ou estudos utilizando um destes corantes tm sido
aderncia celular, produtos de metabolismo entre outros so realizados para a determinao do ndice mdio de citotoxicidade
parmetros que tambm podem ser utilizados33,37,50,57,64,69,71,80,81. de muitas substncias3,4,14,16,49,68,88.
A verificao da viabilidade celular pelo uso de corantes Chiba et al.25 desenvolveram um estudo, onde analisaram
vitais um dos parmetros empregados e dentre os mais citados na mesma clula a viabilidade e o crescimento celular usando
na literatura encontramos o brometo de 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) simultaneamente vermelho neutro, MTT e cristal violeta. O
2,5 difeniltetrazlio (MTT) e o vermelho neutro (3-amino-7- mtodo pode ser til na avaliao da citotoxicidade de
dimethylamino-2-methylphenazine hydrocloride). O MTT um substncias mediadas por diferentes mecanismos, levando a
sal amarelo solvel, metabolizado pela succinato desidrogenase diferentes respostas e ainda, o uso de vrios tipos de avaliao
presente na mitocndria, transformando-se em um produto azul evitaria resultados duvidosos. Estudos comparando
insolvel. O vermelho neutro em pH fisiolgico passa facilmente simultaneamente a viabilidade e o crescimento celular utilizando
atravs da membrana plasmtica e se concentra no interior dos os corantes vermelho neutro e o amino black respectivamente,
lisossomos. A perda deste gradiente de pH por mortalidade/ mostraram boa correlao com a combinao dos dois mtodos
morbidade da clula ou a perda da permeabilidade da membrana no mesmo ensaio, resultando em informaes tanto sobre a
inibe a incorporao destes corantes48. viabilidade como sobre o nmero de clulas26.
Uma das primeiras metodologias descritas para avaliao Com o propsito de se encontrar um protocolo que
in vitro foi sugerida por Rosenbluth et al.77, que propuseram o substitusse os ensaios in vivo vrios outros modelos foram
teste da biocompatibilidade para avaliar plsticos empregados desenvolvidos, dentre eles os chamados organotpicos, os quais
em artigos mdico-hospitalares. Neste ensaio os materiais eram empregam rgos isolados do animal, mantidos por curto perodo
colocados diretamente sobre uma monocamada de clulas de de tempo in vitro preservando suas funes fisiolgicas e
mamfero e aps 24 horas estas clulas eram observadas, quanto bioqumicas. Os mais conhecidos so ensaios com olho isolado
presena ou no de algum efeito txico. No mesmo ano, Guess de coelho (IRE), olho isolado de galinha (CEET), opacidade e
et al.47 descreveram o mtodo de difuso em gar, onde a permeabilidade de crnea bovina (BCOP) e cristalino bovino.
monocamada celular era sobreposta por uma camada de gar e Todos estes mtodos foram elaborados com o propsito de
os materiais a serem testados eram colocados sobre esta camada selecionar e avaliar o potencial irritante de vrias substncias,
evitando assim, os problemas apresentados quando colocados antes de serem aplicadas no mtodo tradicional de irritao ocular
diretamente em contato com a monocamada celular. Este mtodo de Draize22.
citado na American Society for Testing and Materials (ASTM), No estudo realizado por Chamberlain et al.22, concluiu-
Farmacopia Americana e pelas normas da International se que os mtodos de olhos isolados e o BCOP podem ser
Organization for Standartization (ISO) para avaliao de usados para seleo prvia de substncias severamente
polmeros de uso mdico1,51,90,91,92,93,94. irritantes, antes da sua avaliao in vivo. O BCOP o mais
Combier e Castelli28 compararam o teste de irritao ocular recente dentre os ensaios organotpicos e, apesar de apresentar

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uma boa correlao com os ensaios in vivo, seu uso como necessidade de mais estudos intra e interlaboratoriais para
metodologia seletiva deve ser prudente, devido aos resultados avaliar a reprodutibilidade destes mtodos.
falso-negativos apresentados. Este aspecto foi discutido por Clothier et al.27 desenvolveram um protocolo utilizando
outro autor que sugere ajustes no protocolo41. Cooper et al.29 o teste de passagem de fluorescena combinado com o mtodo
demonstraram que o BCOP menos sensvel que o IRE, talvez de viabilidade celular utilizando o corante azul de alamar. O
devido ao maior nmero de camadas epiteliais no olho do boi objetivo foi avaliar a resposta irritante e o perfil de recuperao
em relao ao encontrado na crnea do coelho. do dano ocasionado nas clulas, simulando os mesmos
Jester et al.53, em seus estudos sobre os mecanismos acontecimentos e os mesmos valores observados no protocolo
de leso da crnea, avaliaram o processo de irritao ocular de Draize. A combinao dos efeitos iniciais e a taxa de
utilizando crnea de coelho cultivada in vitro. O modelo recuperao permitiram discriminar o potencial de irritao das
apresentou boa correlao com os testes in vivo e facilitou o substncias e a sua concentrao.
conhecimento dos mecanismos de danos na crnea causados Como alternativo ao teste de irritao ocular de Draize, a
por substncias promotoras de diferentes graus de irritao. In Vitro International, Inc (USA) desenvolveu o Sistema Eytex
Este conhecimento pode ainda, ser aplicado no que consiste de mltiplos protocolos, cada qual especfico para
desenvolvimento de modelos alternativos para avaliao de um tipo de amostra. Este sistema baseado nas respostas fsicas
irritao ocular. e bioqumicas de um conjunto de macromolculas, a qual
Sistemas organotpicos, utilizando membrana crion- consiste em uma matrix protica, que produz turbidez similar
alantica de ovos embrionados de galinha, resultaram em dois opacidade da crnea em resposta a irritantes qumicos. Estudos
tipos de protocolos, o CAMVA (teste de membrana vascular revelam que a maior vantagem deste sistema a habilidade de
crion-alantica) desenvolvido por pesquisadores americanos testar vrios tipos fsicos de materiais, sendo tambm rpido e
que usavam ovos embrionados de 10 a 14 dias e o HET-CAM barato, apresenta ainda, boa correlao com o mtodo de Draize,
(teste de membrana crion-alantica de ovo de galinha) segundo os resultados obtidos em vrios laboratrios
desenvolvido por pesquisadores alemes com ovos americanos21,32,46.
embrionados de nove dias. Estes protocolos foram baseados Sistemas alternativos como o Microtox esto
na observao da vascularizao da membrana crion-alantica disponveis comercialmente. Bactrias luminescentes so usadas
que praticamente similar quela dos tecidos da mucosa ocular. como alvo e a medida da reduo de luminosidade como
No CAMVA os parmetros de avaliao so os efeitos vasculares indicador de toxicidade. Este mtodo proposto como pr-
como hemorragia, no HET-CAM alm destes efeitos vasculares triagem para alguns produtos e para outros mostra-se
observa-se a desnaturao de protenas85. inadequado32.
Os estudos realizados por Spielmann et al.85 mostram Nos testes de pele-equivalente que so modelos de
que o protocolo do HET-CAM prediz melhor o mtodo in vivo, culturas tridimensionais de fibroblastos e queratincitos
para avaliar agentes tensoativos ou formulaes baseadas humanos, vrios parmetros podem ser observados, tais como:
nestes compostos, enquanto o CAMVA tem melhor desempenho viabilidade com MTT ou vermelho neutro, PGE2 (prostaglandina)
com formulaes alcolicas. Estes modelos muitas vezes geram como medida de resposta inflamatria e dosagem de lactato
polmica, j que em alguns pases os ovos embrionrios de 14 desidrogenase (LDH). Este tecido construdo in vitro
dias so includos na categoria de experimentos in vivo6. estratificado, mas no corneificado e por isso se assemelha ao
Mtodos baseados nas funes celulares so tambm epitlio humano da crnea ou conjuntiva. Foi demonstrada ainda,
utilizados, tais como o teste da passagem de fluorescena e o uma boa correlao com os ensaios de irritao in vivo32,56,75.
teste da medida do metabolismo celular. O teste da passagem Diferentes metodologias tm sido propostas como
de fluorescena reflete os aspectos funcionais das clulas substitutas aos testes de Draize, desta forma muitos estudos
epiteliais como barreira, nas regies das ligaes intercelulares comparando-as vm sendo realizados. Alguns autores procuram
e na integridade da membrana plasmtica. Neste teste, as relacionar todos os eventos clnicos que ocorrem na crnea e
linhagens celulares mais utilizadas so a MDCK (cultura de na conjuntiva durante o processo de irritao ocular78.
clulas de rim de cachorro) e a NHEK (cultura de clulas de Vrios autores comparam diferentes metodologias com
queratincitos humanos) porque mantm estas funes in os resultados dos testes de irritao ocular. Dentre as
vitro. O teste do metabolismo celular realizado por meio de metodologias foram consideradas diferentes linhagens celulares
um aparelho que detecta alteraes metablicas celulares e os resultados comparados com distintos mtodos in vitro,
semelhantes resposta local, das clulas oculares, frente tais como HET-CAM, BCOP, hemlise de clulas vermelhas do
aos produtos irritantes. Muitas linhagens celulares tm sido sangue, Microtox, Eytex, entre outros. Aps a avaliao dos
usadas para esta medida de atividade metablica. Os estudos resultados foi sugerida a utilizao de uma bateria de testes
realizados por Botham et al.17 indicam que estes testes podem para predizer melhor o potencial irritante, pois cada mtodo reflete
ser utilizados como substitutos do teste de irritao ocular determinada etapa do efeito ou aplica-se mais adequadamente a
de Draize para irritantes severos e que respondem melhor a determinado grupo de substncias6,36,52,55,58,65,78,98. Na maioria
determinados tipos de formulaes. Os autores sugerem a destes estudos, o produto avaliado caracteriza-se por ser um

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agente tensoativo, utilizado como ingrediente de diferentes validao dos mtodos alternativos, uma vez que o objetivo
formulaes de xampus, sabonetes lquidos e outros. Tais predizer o grau de irritao do olho do coelho.
produtos so, na maioria das vezes, os responsveis pela No inicio da dcada de 90, um grupo de pesquisadores,
irritao no olho do coelho. financiados pelo Ministrio da Sade do Japo, props um
Roguet e Schaefer76 fizeram uma reviso sobre vrios projeto intitulado Study on Test Methods to Evaluate the
tipos de clulas cultivadas in vitro e culturas de pele Safety of Cosmetics Containing New Ingredients. O objetivo
reconstitudas. Segundo os autores, a evoluo das tcnicas de do projeto foi investigar a possibilidade de substituir os testes
culturas celulares poder contribuir muito para a aplicao nos in vivo de Draize por mtodos in vitro. Aps rever os mtodos
estudos frmaco-toxicolgicos in vitro, proporcionando o alternativos para ingredientes de cosmticos, decidiu-se
refinamento de mtodos alternativos aos animais de laboratrio. conduzir um estudo de validao interlaboratorial. Os mtodos
Majmudar e Smith62 compararam vrios tipos de clulas foram selecionados com base nos princpios cientficos,
da pele utilizadas nos testes in vitro. Fizeram referncias aos consideraes ticas e na possibilidade do mtodo ser usado
modelos tridimensionais da epiderme e derme humana como no Japo. O estudo foi dividido em trs etapas e 12 mtodos
sistemas in vitro eficazes para a deteco bioqumica e foram aplicados para o mesmo grupo de 38 substncias24,67,87,89.
histolgica de irritao, corroso e fototoxicidade da pele, apesar Todos os resultados gerados pelo projeto foram avaliados e
de serem dispendiosos e de difcil manuteno. comparados por Ohno et al.66, que discutiram as vantagens e
Em 1993, o Interagency Regulatory Alternative Group as desvantagens de cada metodologia, juntamente com os seus
(IRAG) conduziu um Workshop com a inteno de examinar a coeficientes de variao interlaboratorial e suas correlaes
importncia dos mtodos alternativos quando comparados com com o mtodo in vivo. Estes autores concluram que no
o teste de irritao ocular de Draize. Neste estudo foram indicado um nico mtodo para avaliar todos os tipos de
identificadas cinco categorias de mtodos agrupados com base substncias, enquanto vrios mtodos podem predizer melhor
em princpios gerais, biolgicos ou bioqumicos. Os grupos de o potencial de irritao ocular, desde que usados com claro
trabalho formados foram de modelos organotpicos, testes entendimento de suas caractersticas. Por exemplo, os testes
baseados na membrana crion-alantica, testes baseados na de citotoxicidade proporcionam informaes a respeito dos
funo celular, testes de citotoxicidade e outros sistemas. Cerca efeitos txicos dos mecanismos bioqumicos bsicos da clula,
de 26 tipos diferentes de mtodos foram revistos, concluindo- enquanto os testes de membranas crion-alantica avaliam
se que os dados eram insuficientes para decidir pela total reaes nos vasos sanguneos, e assim distintos mtodos se
substituio do teste in vivo. Os mtodos alternativos podem, complementam.
porm ser usados nas indstrias como triagem no processo de Com o mesmo propsito de validar os mtodos
avaliao de risco dos produtos em desenvolvimento e os alternativos ao teste de Draize, uma comisso formada pelo
resultados de alguns modelos podem levar a reduo do nmero governo britnico e membros da comunidade europia,
de animais, quando conduzidos sob condies bem definidas. European Commission/British Home Office (EC/HO)
Recomendaes adicionais foram sugeridas, tais como: aumentar desenvolveram um estudo interlaboratorial com o objetivo de
o nmero de pesquisas bsicas voltadas para identificao de sugerir s autoridades reguladoras um ou mais mtodos a serem
mecanismos alvo de resposta da injria ocular humana; adotados como substitutos dos ensaios in vivo. Sessenta
estabelecer banco de dados com substncias padro; selecionar substncias foram avaliadas por nove mtodos e quatro etapas
baterias de testes para identificar substncias novas; identificar foram determinadas. Os mtodos deveriam identificar todas as
mtodos promissores para facilitar os estudos de validao; dar substncias severamente irritantes, substncias irritantes
prioridade padronizao internacional18. pertencentes a uma classe especifica, todos os nveis de irritao
Com o intuito de fornecer para as indstrias de das substncias, sem observar a classe qumica e todos os nveis
cosmticos informaes suficientes sobre o desempenho dos de irritao das substncias pertencentes a classes qumicas
mtodos alternativos, a Cosmetic Toiletry and Fragance especficas. Aps avaliarem todos os resultados, concluiu-se
Association (CTFA) desenvolveu um programa para avaliao que alguns mtodos poderiam predizer o potencial de irritao
das limitaes e da aplicabilidade de cada mtodo alternativo. ocular, mas com preciso muito baixa e utilidade prtica
Estudos de correlao in vivo/in vitro permitiram concluir que a questionvel. A baixa preciso poderia estar relacionada com a
maioria dos mtodos utilizados apresentou sensibilidade e escolha das substncias testes, com os protocolos usados no
especificidade adequadas, com exceo dos mtodos de estudo e com a variabilidade dos dados in vivo. A comisso
liberao de vermelho neutro e da dosagem de lactato sugere que para soluo deste problema mais pesquisas bsicas
desidrogenase42,44. sejam desenvolvidas9.
Com base nos resultados obtidos no estudo A European Cosmetic, Toiletry and Perfumary
desenvolvido pelo CTFA, Lordo et al.59 discutiram que embora Association (COLIPA) rgo que representa a indstria de
a preocupao fundamental seja quanto ao desempenho dos cosmticos, desenvolveu um estudo de validao dos mtodos
mtodos alternativos, a variabilidade dos resultados do teste alternativos com o objetivo de avaliar sua habilidade em predizer
de Draize deve ser considerada. Esta variao dificulta a o potencial de irritao ocular. Neste estudo 10 diferentes

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mtodos alternativos foram avaliados para analisar 55 amostras, teste de resistncia eltrica transcutnea (TER), que utiliza
sendo 23 ingredientes e 32 formulaes. Os resultados discos de epiderme de rato para avaliar a integridade do estrato
preliminares indicam que os mtodos alternativos utilizados no crneo, afetada aps exposio s substncias corrosivas. O
poderiam ser considerados como vlidos para substituir o teste segundo teste foi o Corrositex que emprega uma matriz de
de Draize, pois nenhum apresentou confiabilidade em demonstrar colgeno reconstituda, elaborada para apresentar propriedades
as variaes da escala de irritao ocular19. fsico-qumicas semelhantes da pele de rato, que em contato
Os detalhes sobre determinados mtodos, do estudo com substncias corrosivas alterada. O terceiro e o quarto
realizado pela COLIPA, foram comentados em publicaes testes foram o EPISKIN e o SKIN 2, modelos de peles
posteriores. Southee et al.83 descreveram os resultados do tridimensionais reconstitudas, onde a ao corrosiva avaliada
ensaio de tecido equivalente (TEA) e verificaram que apesar pela diminuio da viabilidade celular, constatada pela reduo
deste mtodo apresentar boa correlao com os resultados in do MTT.
vivo e no ser limitado aos materiais lquidos e solveis, no Cada mtodo foi avaliado em trs laboratrios e frente a
apresentou boa reprodutibilidade. As tcnicas de aplicao das 60 substncias de diferentes categorias de corrosividade, j
amostras, o manuseio e os tempos utilizados pelos dois classificadas in vivo e com informaes de relao estrutura-
laboratrios onde este mtodo foi realizado podem estar atividade. Todos os testes apresentaram reprodutibilidade intra
relacionados com as diferenas observadas. e interlaboratorial, mas somente os testes de TER e o EPISKIN
Courtellemont et al. 30 utilizaram o Predisafe , um atenderam aos principais objetivos do estudo, discriminando
protocolo disponvel comercialmente para avaliar a as substncias corrosivas das no corrosivas. O Corrositex s
citotoxicidade, utilizando a linhagem celular SIRC e a medida de identificou alguns tipos de substncias e o SKIN 2 no
liberao do vermelho neutro (NRR). As anlises estatsticas evidenciou resultados que permitissem sua validao12,13,39.
mostraram que o mtodo pode predizer o potencial irritante de O ECVAM, devido ao sucesso da validao dos mtodos
uma grande categoria de produtos acabados. Ainda, associado alternativos para avaliao de substncias corrosivas, apontou
sua facilidade de uso oferece vantagens relevantes para ser a necessidade urgente de validar testes in vitro para avaliar
utilizado na rotina das indstrias de cosmticos, como mtodo irritao cutnea. Com este objetivo, Fentem et al.40 elaboraram
de triagem na avaliao da irritao ocular. um estudo de pr-validao, no qual foram avaliados cinco
Lovell61, com o objetivo de diminuir a variabilidade dos mtodos. Observaram que dentre os mtodos utilizados, os de
resultados in vivo durante o estudo de validao dos mtodos pele equivalente, EpiDERM e EPISKIN apresentaram a melhor
in vitro da COLIPA, buscou a correlao entre os valores de reprodutibilidade intralaboratorial, mas s o EPISKIN foi
irritao ocular e os valores individuais dos danos observados aceitvel quanto a reprodutibilidade interlaboratorial.
nos tecidos oculares dos coelhos, obtidos na avaliao das 55 Concluram que nenhum dos mtodos utilizados poderia ser
amostras utilizadas. O autor realizou uma anlise estatstica indicado no estudo formal de validao, mais estudos deveriam
utilizando o mtodo de multivariveis e concluiu que h poucas ser feitos para melhorar os protocolos e os modelos de predio
evidncias de que os valores individuais dos danos no tecido dos testes EPISKIN e EpiDERM.
possam melhorar a habilidade de predizer o potencial de irritao Robinson et al.72 fizeram uma reviso de todos os
ocular pelos mtodos alternativos. resultados obtidos nos estudos de alguns mtodos alternativos
Mtodos que adotam discos de pele de coelho, mantidos utilizados para avaliao do potencial de corroso e irritao da
in vitro por at sete dias, para avaliar substncias irritantes ou pele. Neste trabalho verificaram que h vrias ferramentas
corrosivas foram desenvolvidos com o objetivo de substituir bsicas disponveis para que avaliaes seguras de corroso/
os testes de irritao cutnea de Draize. O modelo aplicvel na irritao cutnea possam ser conduzidas sem a realizao de
avaliao da toxicidade drmica, podendo utilizar vrios novos testes em animais.
parmetros de avaliao79,95,96. O grande desafio, atualmente, a validao dos mtodos
Segundo Dickson et al.34, as culturas de queratincitos alternativos, que tem gerado muita preocupao e discusso,
podem ser importantes na avaliao do potencial de irritao tanto por parte da comunidade cientifica quanto dos rgos
drmica. A atividade da fosfatase alcalina, tomada como reguladores. A utilizao de mtodos validados busca garantir
parmetro pode ser considerada como indicador sensvel, o mesmo nvel de proteo oferecido pelos mtodos oficiais.
principalmente quando a substncia testada altera as funes Sendo assim, alguns autores baseiam seus estudos na
das membranas dos lisossomos. definio de que validao um processo no qual os
At o momento no existem mtodos validados para parmetros como confiana e relevncia de um mtodo
substituir os ensaios de irritao cutnea. No entanto, o ECVAM alternativo so estabelecidas para um propsito particular. A
concluiu, para produtos corrosivos, a validao de dois mtodos confiana refere-se s condies de reprodutibilidade e
in vitro. Neste estudo, em que foram analisados quatro mtodos, capacidade com que um mtodo pode predizer o resultado in
o objetivo foi verificar a capacidade de discriminar entre vivo. O mtodo, para ser includo no estudo de validao requer
substncias corrosivas e no corrosivas, alm de identificar estabelecimento de certos elementos, como a relevncia,
corretamente certas classes de substncias. O primeiro foi o procedimentos operacionais padro e as medidas de confiana

6
Cruz, A. S. et al. Testes in vitro como alternativa aos testes in vivo de Draize. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 64(1):1-9,2004

que sero confirmadas durante o processo de validao20. 14. Borenfreund, E.; Babich, H.; Martin-Alguacil, N. Comparisons of two
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