UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA

PROFESOR: JORGE CHVEZ PREZ

PRUEBA DE ENSAYO FINAL CURSO DE ENZIMOLOGA

1. Qu criterios considera ud.. (Indique por lo menos 4) se deben considerar para realizar un
trabajo de aislamiento y purificacin de enzimas.

a) Seleccionar la muestra biolgica (fuente)

b) Definir objetivos : Pureza y cantidad requerida
c) Investigar las propiedades de las protenas a purificar
- Tamao
- Propiedades inicas ( punto isoelctrico )
- Hidrofobicidad ( solubilidad )
- Estabilidad ( Temperatura , pH,oxidacin ,reduccin)
- Afinidad por un ligando
d) Contar con un mtodo adecuado para la deteccin de la protena de inters
Monitorear el proceso de purificacin
Cuantificacin de protena total
Detectar especficamente la protena de inters
2. Describa ud. en un organigrama la metodologa a seguir para un proceso de purificacin,
indicando:
a) Cmo se selecciona un buffer
b) Cul es la concentracin ptima para la preparacin de homogenizados
c) Por qu debe mantenerse la cadena de fro?
d) Qu mtodos con son fundamentos son aplicados para la determinacin de protenas
 PROCESO DE PURIFICACION

Como seleccionar un buffer de

trabajo

Concentracin ptima para la

preparacin de homogenizado

Porque debe mantenerse la UTILIZAR

cadena de frio?
Solucionesamortiguadoras
Inhibidoresdeproteasas
BajasTemperaturas

PROCURAR
Procesorpido
No manipular mucho la muestra
 3. A qu llamamos actividad especfica y qu importancia tiene en la purificacin enzimtica?
Explique cmo se emplea.

Se define a la actividad especfica como la actividad por unidad de masa de protena en la preparacin
enzimtica. Es este trmino ampliamente utilizado en la purificacin de enzimas .En una preparacin
cruda de enzima existe una gran cantidad de protena contaminante, que no tiene nada que ver con la
enzima que tratamos de purificar. A medida que la purificacin avanza, vamos eliminando protena
contaminante. Si la purificacin va bien se conserva la actividad enzimtica pero aumenta la actividad
especfica. Es obvio que la actividad especfica a lo largo de una purificacin llega a un lmite superior
correspondiente a la actividad intrnseca de la enzima pura.
4. Describa el fundamento de la cromatografa de exclusin molecular

La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas diferentes presentes en una
misma muestra. El mtodo est basado en la circulacin de una fase mvil (que arrastra a la mezcla de
compuestos a separar), a travs de una fase
estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa
que por ambas fases tengan los distintos
compuestos presentes en la mezcla resultar su
separacin. La cromatografa de exclusin
molecular (a menudo tambin llamada filtracin en
gel o de tamiz molecular) es una de las tcnicas
ms sencillas de las empleadas en la separacin
de protenas y cidos nucleicos. Este tipo de
cromatografa se realiza en columnas cilndricas
rellenas con algunos de los geles que se fabrican
con este fn y que pueden ser de varios tipos:
dextranos con enlaces cruzados (sephadex),
agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-
gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se
hallan constituidos por grnulos (particulas) de un
material esponjoso hidratado, que contiene poros
con un tamao de dimetro determinado.
Hypothetical partial structure of sephacryl Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto
tamao, a travs de una columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el
dimetro de los poros de las particulas, slo podran moverse en su camino, a travs de la fase
estacionaria, en el espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto, no se vern retrasadas en su
descenso. En cambio aquellas molculas capaces de penetrar en las partculas se vern retrasadas por
la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamao. Por lo tanto, las molculas eluyen
en este tipo de cromatografa por orden decreciente de tamao molecula
 5. En que se basa la cromatografa de intercambio inico. Describa los tipos de intercambiadores.

El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas cargadas se adhieren
a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser asociadas o
disociadas cambiando el ambiente inico. La separacin mediante intercambiadores inicos se realiza
por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando
condiciones que originan una unin fuerte y estable; a continuacin, se eluye de la columna con buffers
de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del buffer con el material por
los sitios de unin. R + A - es un intercambiador aninico en la forma A - y B - representa a los aniones
en la disolucin.
Un intercambiador inico es, por lo general, un polmero que tiene grupos cargados unidos. La
mayora de las protenas son estables dentro de un margen de pH determinado (es decir, hay un
margen en el que no se desnaturalizan), en el que estn cargadas positiva o negativamente. Por lo
tanto si una protena es estable a valores de pH por encima del punto isoelctrico, se debe utilizar
un intercambiador anicnico. Si es estable a valores de pH situados por debajo del punto
isoelctrico, debe utilizarse un intercambiador catonice.

INTERCAMBIADORES ANINICOS: Son portadores de grupos con cargas positivas que unen
aniones de forma reversible. Si el grupo cargado es positivo, es un intercambiador de aniones. Los
intercambiadores dbilmente bsicos ms corrientes son los grupos aminos alifticos o aromticos.

INTERCAMBIADOR CATINICO: Los intercambiadores catnicos son portadores de grupos con

carga negativa que unen cationes de modo reversible. Un grupo tpico que se utiliza en los
intercambiadores de cationes es el grupo sulfnico, SO-3. Si se une un H+ al grupo, se dice que el
intercambiador se encuentra en forma cida y puede, por ejemplo, intercambiar un H+ por un Na+ o
dos H+ por un Ca+2. El grupo cido sulfnico es un intercambiador de cationes fuertemente cido.
Otros grupos de utilizacin corriente son el carbonilo e hidroxilo fenlico, dos intercambiadores
catinicos dbilmente cidos.
 6. Qu es la electroforesis preparativa y a que se denomina PAGE-denaturante?

La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los mtodos ms utilizados para la purificacin,

anlisis y caracterizacin de protenas. La tcnica permite separar molculas cargadas y explota diferencias
en movilidad cuando se les somete a la accin de un campo elctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre
un soporte inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida (PAGE). En la electroforesis desnaturalizante
(SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes de protenas, como
pueden ser: detergentes (p.e. SDS), catropos (p.e. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT).
Para la visualizacin de las protenas se utilizan diferentes mtodos de tincin, siendo el ms habitual el azul
de coomassie. En la SDS-PAGE, la separacin es funcin del tamao (masa molecular), lo que permite
determinar el peso molecular de las protenas. Para ello se compara la movilidad electrofortica (Rf) de la
protena de peso molecular desconocido con el de protenas de referencia de peso molecular conocido

Que funcin cumplen:

a) Persulfato de amonio

b) TEMED

Acrnimo de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina .Se trata de otro iniciador (propagador).

La tasa de polimerizacin y las propiedades del gel resultante dependen de la
concentracin de APS y TEMED. Aumentando su contenido se disminuye la longitud
media de la cadena de polmero y se incrementa la turbidez del gel, al tiempo que
disminuye su elasticidad. Por contra, disminuyendo la cantidad de iniciadores se
obtiene el efecto inverso. Se debe, por tanto, utilizar la menor concentracin posible de
catalizadores que permita la polimerizacin en un tiempo ptimo. Se utiliza APS y
TEMED en concentraciones equimolares del orden de 1 a 10 mM.

c) ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA
 Acrilamida -.Es un slido pulverulento, blanco y cristalino. Cuando se encuentra en
disolucin acuosa experimenta autopolimerizacin de forma espontnea y lenta; el
resultado es que las molculas de acrilamida se unen cabeza con cola. En presencia
de un sistema generador de radicales libres, los monmeros de acrilamida se activan,
quedando ellos mismos en estado de radical libre, y reaccionan rpidamente para
formar polmeros de cadena larga
.
Bisacrilamida, o N,N'-metilenbisacrilamida .- La bisacrilamida es el agente de
reticulacin ms frecuente para los geles de poliacrilamida. Su estructura est
compuesta por dos molculas de poliacrilamida enlazadas por sus grupos amino, no
reactivos de cara a la polimerizacin. Por ello, la bisacrilamida polimeriza
conjuntamente con la acrilamida pero establece puentes entre las cadenas lineales de
poliacrilamida, y as evita el deslizamiento de stas y conduce a la formacin del geL

d) SDS
El dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl Sulphate, SDS, laurilsulfato sdico) es un
detergente aninico que se une a las protenas, desnaturalizndolas en una
conformacin extendida recubierta de molculas de SDS. Como consecuencia, el
tamao de la molcula de protena es directamente proporcional a su longitud en
aminocidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la
recubre, que es tambin proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad
electrofortica de la protena depende exclusivamente de su masa molecular.

7. Que es el HPLC y cules son sus principales componentes.

 8. Respecto al siguiente cuado

a) Complete el cuadro de purificacin

b) Haga comentarios respecto al procedimiento empleado. (Secuencia, pertinencia,
productividad.

Fraccion Volumen Proteina Act-Enzim A.E* %Rec No .Pur

(ml) (mg/ml)
Homogenizado 7000 35.5 5.85
Gel -Filtracion 2500 21.4 14.21
25 % (NH4 )SO2 1500 15.1 17.9
Dialisis 1200 10 20
45%(NH4) SO2 230 8 98
CM-50 109 2.15 201